胡力飛,梅文莉,易克賢,戴好富

中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所農(nóng)業(yè)部熱帶作物生物技術(shù)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室,?？?571101

劍麻提取物的細(xì)胞毒活性研究

胡力飛,梅文莉,易克賢,戴好富＊

中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所農(nóng)業(yè)部熱帶作物生物技術(shù)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室,?？?571101

用溶劑萃取法對劍麻的 95%乙醇提取物進(jìn)行分段處理,利用MTT法測定各提取部位的體外細(xì)胞毒活性。正丁醇提取物對腫瘤細(xì)胞株 K-562、S MMC-7721和 SGC-7901顯示有生長抑制活性,IC50值分別為 5.6、23.8和 26.8μg/mL,而石油醚、乙酸乙酯和水溶性部位則沒有活性。

劍麻;細(xì)胞毒活性;MTT法

劍麻 (Agave sisalanaPerrine)又名菠蘿花,為龍舌蘭科龍舌蘭屬植物,是亞熱帶特有的多年生草本經(jīng)濟(jì)作物。原產(chǎn)墨西哥尤卡坦半島,我國海南、廣東、廣西、云南和福建等省均有種植。劍麻葉具有涼血止血、消腫止痛之功效,民間常用于治療肺癆咯血、衄血、便血、痢疾、癰瘡腫毒和痔瘡[1]。劍麻葉片含豐富的纖維,是重要的工業(yè)原料,在劍麻葉片抽取纖維后的葉汁中含有有甾體骨架的劍麻皂苷元(Tigogenin),是合成甾體激素類藥物的重要原料[2]。本實(shí)驗(yàn)利用溶劑法對劍麻的乙醇提取物進(jìn)行分段處理,并運(yùn)用MTT法,選擇人慢性髓原白血病細(xì)胞株 K-562、人肝癌細(xì)胞株 S MMC-7721和人胃腺癌細(xì)胞株 SGC-7901為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞株,研究劍麻提取物對腫瘤細(xì)胞的體外增殖作用和劑量效應(yīng)關(guān)系,為劍麻資源的進(jìn)一步開發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

試驗(yàn)用植物樣品采自廣東湛江,由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所王祝年研究員鑒定為劍麻 (Agave sisalanaPerrine),憑證標(biāo)本(20080701),現(xiàn)存于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院。

四甲基偶氮唑鹽 (MTT)、MEM和平衡鹽溶液PBS(北京欣經(jīng)科公司);絲裂霉素 C(kyowa Hakko kogyo Co.Ltd.)。CO2培養(yǎng)箱 (RSBiotech Ltd.);酶標(biāo)儀 (BioTek Instruments,Inc.)。

人慢性髓原白血病細(xì)胞株 K-562、人肝癌細(xì)胞株 S MMC-7721和人胃腺癌細(xì)胞株 SGC-7901購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫,在含有 10%小牛血清的 RPM I1640培養(yǎng)基中,于 5%CO2、濕度 90%以上、37℃溫箱中培養(yǎng),貼壁細(xì)胞用 0.25%胰酶消化。

1.2 樣品的制備

取新鮮劍麻葉片 (10.5 kg),粉碎后用重蒸的95%工業(yè)乙醇冷浸提取 3次,提取液濃縮至無醇味后分散于水中,依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取,分別得到石油醚提取物 (Pet),乙酸乙酯提取物(E tOAc)、正丁醇提取物 (n-BuOH)和水提物 (H2O)。上述4種提取物均用于體外抗腫瘤活性篩選。

1.3 體外腫瘤細(xì)胞生長抑制實(shí)驗(yàn) (MTT法)[3]

實(shí)驗(yàn)設(shè)陰性對照組 (DMSO溶劑對照組)、陽性對照組 (絲裂霉素C)和 5個(gè)不同濃度的待測樣品,每個(gè)濃度設(shè) 2個(gè)平行。

收集對數(shù)生長期細(xì)胞,血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù),按每孔4500個(gè)癌細(xì)胞量接種于 96孔平底細(xì)胞培養(yǎng)板中,置于 5%CO2、濕度 90%以上、37℃溫箱中培養(yǎng)。24 h后取出加入一定量的待測樣品,繼續(xù)培養(yǎng) 3 d后取出置于顯微鏡下觀察每孔細(xì)胞形態(tài),記錄細(xì)胞形態(tài)變化情況,接著每孔加入5 mg/mL的MTT溶液(溶于平衡鹽溶液 PBS)50μL,37℃反應(yīng) 4 h后,將細(xì)胞培養(yǎng)液吸出,每孔加入 100μL DMSO使For mazane充分溶解后,將細(xì)胞培養(yǎng)板置于 ELX-800酶標(biāo)儀上,用 490 nm波長測各孔的吸光度 (A),按下列公式求生長抑制率。而后以樣品濃度為橫坐標(biāo),以抑制率為縱坐標(biāo),作圖并求出抑制率為 50%時(shí)樣品的濃度 (I C50),樣品活性結(jié)果即以半數(shù)抑制濃度 (IC50)表示。

2 結(jié)果與討論

以MTT法對劍麻的 4種提取物進(jìn)行了體外腫瘤細(xì)胞毒活性篩選,結(jié)果見圖 1和表 1。從圖表中可以看出,石油醚提取物 (Pet),乙酸乙酯提取物(EtOAc)和水提物 (H2O)的篩選結(jié)果均為陰性;而正丁醇提取物 (n-BuOH)對體外培養(yǎng)的人慢性髓原性白血病細(xì)胞株 K-562、肝癌細(xì)胞株 S MMC-7721和胃癌細(xì)胞株 SGC-7901的增殖均顯示出抑制作用,在測定濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好劑量依賴性,對人慢性髓原性白血病細(xì)胞株 K-562、肝癌細(xì)胞株S MMC-7721和胃癌細(xì)胞株 SGC-7901的 I C50值分別為 5.6μg/mL、23.8μg/mL和 26.8μg/mL。

圖 1 劍麻 n-BuOH提取物對腫瘤細(xì)胞的抑制作用Fig.1 Inhibitory effects of the n-BuOH extract fromA-gave sisalanaon tumer cell lines

表 1 劍麻提取物的 IC50值 (μg/mL)Table 1 The IC50values of extracts fromAgave sisalana(μg/ mL)

劍麻乙醇提取物的正丁醇部位的化學(xué)成分主要為高極性成分。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,龍舌蘭屬植物中含大量的甾體皂苷元和甾體皂苷[4]。楊崇仁等從劍麻葉汁提取物的甲醇部分中分離得到 5個(gè)甾體皂苷dongnoside A、B、C、D、E[5,6],每個(gè)甾體皂苷的糖鏈含有 5個(gè)糖單位以上,糖鏈由葡萄糖,木糖,半乳糖和鼠李糖 4種單糖組成。劍麻中的抗腫瘤活性成分是否就是這些甾體皂苷,還有待進(jìn)一步研究確證。

此外,我們通過薄層層析 (TLC)比較了劍麻及抽取纖維后麻渣的乙醇提取物的正丁醇部位的化學(xué)成分,發(fā)現(xiàn)二者所含化學(xué)成分基本一致。目前在廣東湛江地區(qū),抽取纖維后的麻渣均為廢棄物,既浪費(fèi)了資源,又污染了環(huán)境。因此本次研究結(jié)果將為劍麻麻渣的開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 Editorial Committee of Chinese Materia Medica.State Drug Administration of China.Chinese Materia Medica(中華本草).Shanghai:Science and Techonology Press,1999.7244.

2 Han YL(韓耀玲),Lin CW(林翠梧).Extraction and isolation of tigogenin.J Henan univ,M ed Sci(河南大學(xué)學(xué)報(bào),醫(yī)學(xué)版),2006,25:27-29.

3 Mos mann T.Rapid color imetric assay for cellular growth and survival:Application to proliferation and cytotoxicity assays.J Imm unolM ethods,1983,65:55-63.

4 Zhang YH(張?jiān)?,Wang FP(王鋒鵬).Recent Advance of Chemical Constituents ofAgave SPP.Plants.Nat Prod Res Dev(天然產(chǎn)物研究與開發(fā)),2003,15:349-353.

5 Ding Y,Tian RH,YangCR,et al.Two new steroidal saponins from dried fermented residuesof leaf-juices ofAgave sisalanaforma dongNo.1.Chem Phar m Bull,1993,41:557-560.

6 Ding Y,Chen YY,WangDZ,et al.Steroidal saponins from a cultivated form ofAgave sisalana.Phytochem istry,1989,28: 2787-2791.

Cytotoxic Activity ofAgave sisalanaExtract

HU Li-fei,MEIWen-li,YI Ke-xian,DA IHao-fu＊
Key Laboratory of Tropical Crop B iotechnology,M inistry of Agriculture,Institute of Tropical B ioscience and B iotechnology,Chinese Academ y of Tropical Agricultural Sciences,Haikou 571101,China

The 95%ethnol extract fromAgave sisalanawas treated by solvent partition to afford different extracts.The cytotoxic activities of the different extractsin vitrowere evaluated byMTTmethod.Then-butanol extract showed inhibitory effect on the cell linesof K-562,S MMC-7721 and SGC-7901 with the I C50valuesof 5.6,23.8 and 26.8μg/mL,respectively.The extract of petroleum ether,ethyl acetate and water-soluble showed no activity.

Agave sisalanaPerrine;cytotoxic activity;MTTmethod

R284.2;R285

A

1001-6880(2010)05-0907-02

2009-08-13 接受日期:2009-11-03

973計(jì)劃前期研究專項(xiàng) (2007CB116306)

＊通訊作者 Tel:86-898-66988061;E-mail:hfdai2001@yahoo.com.cn