康傳真,程曉杰,陳西廣

中國海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院.青島 266003

殼聚糖及其衍生物溫敏水凝膠研究進(jìn)展及其應(yīng)用

康傳真,程曉杰,陳西廣＊

中國海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院.青島 266003

殼聚糖基溫度敏感性水凝膠具有原位成膠的特點,廣泛應(yīng)用于組織工程修復(fù)和藥物釋放載體的研究中。近年來圍繞殼聚糖及其衍生物溫敏水凝膠的研究逐年增多,本文綜述了近年來殼聚糖基溫敏水凝膠的研究進(jìn)展及其應(yīng)用。

殼聚糖;甘油磷酸鹽;溫敏水凝膠;藥物釋放載體;組織工程

溫度敏感水凝膠能夠感受外界環(huán)境溫度的變化而發(fā)生溶膠-凝膠轉(zhuǎn)變或者可逆體積轉(zhuǎn)變,廣泛應(yīng)用于組織工程、藥物釋放系統(tǒng)等的研究?？捎糜谥苽錅孛羲z的材料已發(fā)現(xiàn)很多種,如:聚-N-異丙基丙烯酰胺(PN IPAM)、泊洛沙姆 (Poloxamer)、聚丙烯酸(PAA)、聚丙烯酰胺(PAAm)等合成高聚物,以及纖維素及其衍生物[1,2]、殼聚糖及其衍生物等天然高聚物。本文就近年來有關(guān)殼聚糖及其衍生物所形成的溫度敏感性水凝膠以及其應(yīng)用的研究情況進(jìn)行綜述和討論,文中所涉及的殼聚糖類溫敏水凝膠均是指在低溫條件下保持可流動性液態(tài)而在高溫條件下會自發(fā)交聯(lián)形成不可流動的半固體狀的水凝膠[3]。這種具有熱致成膠特性的溫敏水凝膠,制備條件溫和,相變溫度與人體體溫接近甚至低于人的體溫,具有良好的生物相容性和生物可降解性,因而在組織工程和藥物緩釋載體等方面具有極大的應(yīng)用潛力,已經(jīng)引起人們的廣泛關(guān)注,相關(guān)的研究報道也在逐年增多。

1 殼聚糖/甘油磷酸鹽溫敏水凝膠制備條件的優(yōu)化研究

殼聚糖 (chitosan,CS)為聚陽離子多糖,具有良好的組織相容性、生物可降解性和黏膜粘附性,在醫(yī)學(xué)、生物學(xué)領(lǐng)域得到了深入的研究和廣泛的應(yīng)用。CS分子鏈上的羥基 (-OH)、氨基 (-NH2)和 N-乙酰氨基之間形成的分子內(nèi)和分子間氫鍵,以及其分子的立體規(guī)整性,使其在多數(shù)有機(jī)溶劑、水、堿中難以溶解,但是在稀酸溶液中,-NH2被質(zhì)子化為破壞了分子內(nèi)部的氫鍵和立體規(guī)整性,-OH與水分子發(fā)生水合作用,導(dǎo)致了 CS分子膨脹而溶解。調(diào)節(jié)溶液 pH至堿性時,CS分子就會立即絮凝沉淀。甘油磷酸鹽 (Glycerophosphate,GP)為強(qiáng)堿弱酸鹽,低溫條件下弱堿性的 GP溶液中和 CS溶液至 pH 6.5以上,和磷酸基團(tuán)靜電結(jié)合,CS分子之間的靜電斥力降低;另外 GP是一種多羥基化合物,多羥基化合物能夠保護(hù)蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)的水合狀態(tài),促進(jìn)其在水中的溶解[4],因此即使中性 pH條件下 CS也不會發(fā)生絮凝。隨著溫度的升高,體系中氫鍵作用力減弱,CS分子之間的疏水相互作用迅速增強(qiáng),CS分子相互聚集交聯(lián),體系由流動的溶膠轉(zhuǎn)變?yōu)榘牍腆w狀的凝膠[5,10.13-15]。

2000年,Chenite等[5-8]最先報道了這種 CS/GP溫敏凝膠體系的制備,即 0.2 g CS溶于 9 mL的 0.1 mol/L稀鹽酸溶液中,冰浴條件下將 GP溶液(56%, M/V)滴加到 CS的鹽酸溶液中。繼續(xù)冰浴攪拌充分混合,將其置于 37℃環(huán)境下即可迅速凝固為半固體狀水凝膠。

1.1 殼聚糖材料對成膠性能的影響

脫乙酰度和相對分子質(zhì)量是 CS的兩項主要的性能指標(biāo),它們對 CS許多性質(zhì)都有影響,例如這兩項指標(biāo)都明顯影響 CS的溶解性能:相對分子質(zhì)量小于 8 kDa的 CS可以直接溶于水而不需借助酸的作用。而隨著分子量的增大,分子內(nèi)和分子間會形成更多氫鍵,同時分子更易于纏繞在一起,CS水溶性變差,即使在酸溶液中也難以溶解;脫乙酰度越高CS分子中的氨基質(zhì)子化程度越高,水溶性越好。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)分子量、脫乙酰度對殼聚糖成膠效果有顯著影響。

Ruel-Garie′py等[6]發(fā)現(xiàn)隨著 CS脫乙酰度的增大,其成膠溫度呈降低趨勢;脫乙酰度為 92%時樣品成膠溫度下降為 27℃。我研究室的周惠云等[9]研究了 CS分子量高低和脫乙酰度大小與其成膠性能的關(guān)系。37℃條件下,分子量大于 1130 kDa的CS所制備的 CS/GP體系的旋轉(zhuǎn)粘度隨保溫時間的延長而增大,分子量為 1360 kDa時體系旋轉(zhuǎn)粘度增長最快;脫乙酰度為 75.4%時體系的旋轉(zhuǎn)粘度增長最快,而其他脫乙酰度時體系旋轉(zhuǎn)粘度則無明顯變化。

1.2 甘油磷酸鹽對成膠性能的影響

甘油磷酸鹽具有兩種異構(gòu)體:α-甘油磷酸鹽和β-甘油磷酸鹽 [Fig.1]。α-甘油磷酸鹽是線性分子結(jié)構(gòu),β-甘油磷酸鹽為非線性分子結(jié)構(gòu),兩者在體系內(nèi)部引起的空間位阻不同,因此對殼聚糖成膠速度有明顯影響。

Zhou和Wu等[9,10]分別研究了兩種甘油磷酸鹽(β-甘油磷酸鹽和α,β-甘油磷酸鹽混合物)對于成膠性能的影響,研究表明α,β-較β-具有更快的成膠速度。Wu等研究發(fā)現(xiàn) CS和 GP濃度相同的條件下,α,β-制備的水凝膠成膠時間為 14 min,而β-則為33 min。這是因為α,β-中的α-為線性分子結(jié)構(gòu),其形成的空間位阻較β-的要小,體系中的 CS分子間的疏水相互作用更易于形成。

圖 1 α-GP(a)和β-GP(b)的分子結(jié)構(gòu)[10]Fig.1 Molecular structure of(a)α-GP and(b)β-GP[10]

1.3 不同酸溶劑對成膠性能的影響

CS不溶于水和堿溶液,可溶于大多數(shù)有機(jī)酸溶液,以及稀的鹽酸、硝酸等無機(jī)酸溶液,不溶于稀的硫酸、磷酸。不同酸配制的CS溶液的pH、粘度以及穩(wěn)定性等存在差異[11],使用不同酸溶解 CS之后所制備的溶膠的成膠性能也有差異。

我研究室的趙慶升等[12]研究了 CS在不同稀酸溶劑中的溶解性,并考察了不同酸溶解的 CS的成膠性能。研究發(fā)現(xiàn)所有單價酸 (包括甲酸、乙酸、丙酸、正丁酸、異丁酸、乳酸、硝酸、鹽酸和氯乙酸)配制的 CS溶液,加入 GP后均可在 2～5 min內(nèi)成膠,而二價酸(包括硫酸、草酸、琥珀酸、蘋果酸、抗壞血酸)和三價酸 (包括磷酸和檸檬酸)則均不能成膠。原因可能在于多價酸溶解 CS時需用更多的 GP中和剩余的酸,而 GP濃度過高時導(dǎo)致 CS的沉淀析出,因而無法成膠。以上幾種羧酸的成膠時間無明顯區(qū)別,均為 2 min,而氯乙酸則稍長,為 3 min。掃描電鏡結(jié)果顯示除以乳酸為溶劑制備的水凝膠內(nèi)部呈明顯的絮凝聚集結(jié)構(gòu)外[Fig.2-f],其他各種水凝膠均為多孔分枝狀結(jié)構(gòu)[Fig.2],孔徑大小因酸的種類而異,羧酸的烴鏈越長,孔徑越大。

2 殼聚糖衍生物溫敏水凝膠

CS分子的單糖殘基上有三個活性基團(tuán):分別是C2-NH2、C6-OH和 C3-OH。在-NH2和-OH上能發(fā)生接枝反應(yīng),生成一系列 CS衍生物 (如酯化反應(yīng)、醚化反應(yīng)等),從而制備得到溶解性能更好或具有其他特殊性能的 CS衍生物,其中有些衍生物水凝膠在溫敏方面的研究已經(jīng)被報道。

2.1 殼聚糖季銨鹽溫敏水凝膠

Wu等[10]利用失水甘油基三甲基氯化銨 (GTMAC)和 CS反應(yīng),制備了水溶性的季銨化衍生物N-(2-羥基)丙基-3-甲基氯化銨殼聚糖 (HTCC)[Fig. 3]。研究發(fā)現(xiàn),HTCC溶液與 GP溶液共混后的體系(HTCC/GP)同樣具有類似 CS/GP的溫敏特性,即在低溫或室溫保持溶液狀態(tài),而在37℃或更高溫度條件下發(fā)生凝膠化。與 CS/GP水凝膠相比,HTCC/ GP水凝膠呈現(xiàn)透明態(tài),對環(huán)境的 pH更加敏感。

本研究室的吉秋霞等[38]制備了溫敏性更好的CS/HTCC/GP溫敏水凝膠,通過調(diào)節(jié)體系內(nèi) CS和HTCC的比例,能夠調(diào)節(jié)成膠溫度到 25℃。

圖 3 HTCC的合成方案[10]Fig.3 Synthesis scheme of HTCC[10].

2.2 羥丁基殼聚糖溫敏水凝膠

羥丁基殼聚糖 (HBC)的制備是在 CS上的-NH2、C6-OH或 C3-OH上引入羥丁基基團(tuán)制備的衍生物,羥丁基結(jié)合到 CS上賦予 CS良好的水溶性。Dang等[16]發(fā)現(xiàn) HBC水溶液同樣具有溫敏特性,其成膠溫度低于人體正常溫度,取代度為 1.33%、 1.75%、1.96%時成膠溫度分別為 29、18、13℃;且成膠速度更快,如濃度為 3.8%的 HBC水溶液在37℃下成膠時間小于 60 s。這種凝膠的機(jī)械性能良好,能用鑷子直接鉗起。而低溫條件下,該凝膠又可重新轉(zhuǎn)變?yōu)榭闪鲃訝顟B(tài)。

3 殼聚糖與其他大分子聚合物共混制備的溫敏水凝膠

3.1 殼聚糖/聚乙烯醇/碳酸氫鈉溫敏水凝膠

低溫條件下,在 CS酸溶液中滴加碳酸氫鈉和聚乙烯醇(PVA)的混合溶液,制備得到的 CS/PVA/ NaHCO3的混合物溶液,同樣具有溫敏性。Tang等[17]制備了這樣的共混溫敏水凝膠,具體的制備方法是:低溫條件下將預(yù)先配置好的 PVA和碳酸氫鈉的混合液滴加到 CS鹽酸溶液(2%,w/v)中,得到均質(zhì)、透明、低溫可流動的 CS/PVA/NaHCO3共混溶液,37℃條件下放置 30 min即可轉(zhuǎn)變?yōu)榘牍腆w狀水凝膠。成膠機(jī)理如圖 4所示:

圖 4 殼聚糖/聚乙烯醇水凝膠的形成機(jī)理Fig.4 Formation mechanism of chitosan/PVA gel

NaHCO3是強(qiáng)堿弱酸鹽,其水溶液中呈弱堿性,能夠中和 CS溶液至中性.低溫條件下,PVA作為多羥基化合物能夠保護(hù) CS在中性條件下保持溶解狀態(tài),。當(dāng)環(huán)境溫度升高到 37℃時,體系內(nèi)部的氫鍵作用力減弱,CS分子周圍結(jié)合的水分子丟失,疏水片段暴露出來,CS分子因疏水相互作用而結(jié)合,體系轉(zhuǎn)變?yōu)槟z。在成膠過程中,疏水相互作用是主導(dǎo)作用力。隨著 PVA含量百分比的增大,共混溶液的成膠溫度和成膠時間都會增大,這是因為,PVA含量越大,親水性越強(qiáng),體系中氫鍵作用力越大,成膠時克服氫鍵所需能量越大。

3.2 殼聚糖季銨鹽/聚乙二醇/甘油磷酸鹽溫敏水凝膠

Wu等[18]制備了殼聚糖季銨鹽 (HTCC),聚乙二醇 (PEG)和少量α,β-GP的混合物,證明該混合物具有良好的溫敏性,室溫下呈液態(tài),而 37℃環(huán)境下數(shù)分鐘轉(zhuǎn)變?yōu)槟z。α,β-GP的加入能調(diào)節(jié)體系pH至中性,并與 CS分子上的-NH3+發(fā)生靜電結(jié)合,降低HTCC分子間的靜電斥力。PEG分子兩端的羥基,同 CS分子上的氨基和羥基形成氫鍵,促進(jìn) CS分子間的交聯(lián)作用;相同分子量的甲氧基聚乙二醇(MPEG)替代 PEG則不能成膠,表明 PEG分子兩端的羥基對于成膠的必要性。低分子量 PEG對于成膠的促進(jìn)效果不如高分子量 PEG,這是因為小分子量的 PEG水溶性更好,親水性更強(qiáng),與水分子之間的氫鍵更加緊密,成膠時克服氫鍵作用而消耗的能量更大,阻礙凝膠形成。

Wu等還研究了該溫敏系統(tǒng)作為鼻腔藥物緩釋系統(tǒng)的可行性,包埋親水性的大分子藥物胰島素作為模型藥物,室溫下將其滴加到小鼠鼻腔中,能夠良好的吸附在鼻粘膜上,形成凝膠,并能抵抗鼻腔內(nèi)粘膜纖毛的清除作用,保證藥物緩慢穩(wěn)定的釋放,促進(jìn)親水性的大分子藥物的吸收。

4 殼聚糖接枝共聚物制備的溫度敏感水凝膠

接枝共聚物是在一種大分子均聚物鏈上進(jìn)行接枝,連接上另外一種均聚物大分子,所獲得的接枝共聚物保留原有分子的一些性質(zhì),同時又被賦予新的理化特性。

4.1 殼聚糖-聚-N-異丙基丙烯酰胺接枝共聚物(CS-g-PN IPAM)溫敏水凝膠

Cho等、Chen等[19,20]分別制備了 CS水溶性接枝共聚物 CS-g-PN IPAM,用于制備溫敏水凝膠。Chen等首先合成了帶有羧基末端的聚-N-異丙基丙烯酰胺分子 (PN IPAM),以 CS分子作為骨架,利用羧基和氨基分子之間反應(yīng)生成酰胺鍵,將 PN IPAM連接到 CS分子骨架上,制備得到梳狀的接枝共聚物(CS-g-PN IPAM,CPN)[Fig.5]。與 CS相比,該接枝共聚物具有更好的可逆的溫敏性,其成膠溫度為30℃。掃描電鏡觀察該凝膠內(nèi)部具有多孔的三維結(jié)構(gòu),孔徑為 10～40μm。

Cao等[21]制備了 CS-PN IPAM接枝共聚物,該共聚物具有水溶性、溫敏性,其成膠溫度為 32℃,這與人眼表面的溫度接近,因此 CS-PN IPAM作為原位成膠材料,用于眼疾治療藥物釋放載體,具有很大可行性。

圖 5 PN IPAM-COOH(a)、殼聚糖(b)和 CPN(c)的分子結(jié)構(gòu)[20]Fig.5 Molecular structures of PN IPAM-COOH(a).chitosan(b)and CPN(c)[20]

4.2 殼聚糖-聚乙二醇接枝共聚物 (CS-PEG)溫敏水凝膠

CS和聚乙二醇 (PEG)及其各種衍生物反應(yīng)生成接枝共聚物,包括 PEG酯、PEG磺酸酯、PEG酸、PEG醛、PEG丙烯酸鹽和 PEG碘化物等[22]。PEG的加入不僅能夠改善 CS的水溶性和生物相容性,而且不改變聚合物原有的溫敏性。

Bhattarai等[23]將甲氧基聚乙二醇 (mPEG)接枝到 CS的氨基上制備接枝共聚物,該共聚物可溶于水,并且具有可逆的溫敏性,37℃成膠。PEG接枝率 ＞40%時接枝共聚物可溶于水,45%～55%時能成膠,接枝率過高會抑制分子內(nèi)的疏水相互作用,阻礙成膠。成膠機(jī)理是:低溫時分子中的親水基團(tuán)同水分子形成氫鍵,共聚物溶于水中,高分子鏈呈伸展?fàn)顟B(tài),黏度低,具有流動性;溫度升高 CS分子片段間的疏水相互作用占主要地位,從而交聯(lián)成膠。

Zhang等[24]將單甲氧基醚聚乙二醇 2000 (mPEG2000)接枝到 CS上制備接枝產(chǎn)物 mPEG-g-CS,得到了接枝率分別為 22.4%、38.5%和 50.9%的產(chǎn)物 G1、G2和 G3。該接枝共聚物溶解性較 CS要好,且接枝率越高,溶解性越好,G2和 G3在中性和弱堿性條件下仍可溶。其溶液具有溫敏性,濃度在 0.9%～1.1%之間的mPEG-g-CS溶液具有良好的溫敏性能,37℃下 3～10 min成膠;而濃度大于1.3%時在室溫下流動性很差,已無明顯溫敏性;濃度小于 0.8%時,37℃下大約需要 3 h以上才能成膠;更低的濃度時,則不形成凝膠。G3制備的水凝膠包載的疏水性藥物可持續(xù)釋放一周以上。mPEG-g-CS溫敏水凝膠有望成為理想的注射式植入型藥物釋放載體。

4.3 殼聚糖-泊洛沙姆接枝共聚物溫敏水凝膠

Chung等[25]使用 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺 (NHS)作為交聯(lián)劑,將泊洛沙姆 (Pluronic)接枝到 CS分子上制備得到水溶性的共聚物[Fig.6]。與 CS相比該共聚物具有更低的成膠溫度,在 34℃附近具有可逆的溶膠-凝膠轉(zhuǎn)變。CS和 Pluronic的含量影響制備的產(chǎn)物的成膠性能,CS含量增大,成膠溫度升高,當(dāng)達(dá)到 17 wt%時,共聚物不能成膠。

圖 6 利用 EDC/NHS合成殼聚糖-泊洛沙姆共聚物的合成路線[25]Fig.6 Synthetic route of chitosan-pluronic using EDC/NHS[25]

5 殼聚糖溫敏水凝膠和微粒緩釋系統(tǒng)的結(jié)合

5.1 殼聚糖/甘油磷酸鹽溫敏水凝膠與脂質(zhì)體的結(jié)合

小分子量物質(zhì)在水凝膠的釋放速度較快,緩釋效果不夠理想,針對這一缺陷,大量研究將脂質(zhì)體加入到凝膠體系中,這樣既能將載藥的脂質(zhì)體固定在生物體某一特定部位上,又能減緩藥物的釋放速度[26-28]。

Ruel-Garie′py等[29]將包載羧基熒光素的脂質(zhì)體加入到 CS/GP中并研究其對羧基熒光素的緩釋效果。在 0～15μmol/mL范圍內(nèi),脂質(zhì)體的加入對成膠速度和凝膠強(qiáng)度有一定的促進(jìn)作用,這是因為電中性的脂質(zhì)體同 CS分子之間存在比較強(qiáng)烈的疏水作用。同 CS/GP相比,CS/GP中的脂質(zhì)體內(nèi)包載的藥物釋放速率明顯減慢,并能持續(xù)數(shù)周。影響藥物釋放速率的因素有:脂質(zhì)體大小、脂質(zhì)體中膽固醇的加入與否、釋放介質(zhì)中磷脂酶的存在與否,隨脂質(zhì)體直徑的增大,藥物的突釋效應(yīng)和釋放速率都明顯減慢。多層膜脂質(zhì)體的釋放速率更慢,7 d才釋放了6%。

5.2 殼聚糖/甘油磷酸鹽溫敏水凝膠與微納米球的結(jié)合

在 CS/GP溫敏水凝膠體系中加入微米球、納米球等粒子,能夠明顯改善水凝膠體系的溫敏性,增強(qiáng)凝膠強(qiáng)度[30]。

Xiao等[31]將殼聚糖季銨鹽納米粒加入 CS/GP溫敏水凝膠體系中,研究納米粒子對溫敏體系的影響。微納米粒子的加入不影響體系 pH值,且 37℃條件下體系成膠時間縮短,因為微納米粒子的加入,使體系中離子間相互作用的距離縮短。溶液成膠情況與微納米粒子的大小及其加入量有關(guān)。粒徑大的納米粒對成膠的促進(jìn)作用更明顯,因為粒徑大的納米粒促使高分子間發(fā)生離子交聯(lián)的幾率更大;對于同種粒徑納米粒,加入量越多,成膠時間越短,但加入量過多(0.96 g/L)時,由于離子交聯(lián)的影響,溶液的初始粘度增大(從 100 mPa·s增大到 500 mPa ·s),影響溶液的流動性,體系不具有明顯的溫敏性。納米粒的加入使得溫敏體系的凝膠強(qiáng)度有所增強(qiáng)。釋藥結(jié)果顯示,微納米粒子的加入減慢了 BSA在凝膠中的釋放速率。

Zan等[32]將載有 5-氟尿嘧啶的聚羥基丁酸酯微球添加到 CS/GP溫敏水凝膠體系中,并研究其對藥物的緩釋性能。體外釋藥研究表明復(fù)合體系能夠顯著降低藥物突釋行為 (從原來的 85%降低到29%),包埋的藥物能夠持續(xù)釋放長達(dá)10個月之久。

Couto等[33]將生物玻璃納米粒加入到 CS/GP溫敏水凝膠體系中,應(yīng)用于整形外科。隨著加入的生物玻璃納米粒含量的增大,體系成膠溫度降低,這可能是由于生物玻璃納米粒影響了 CS分子之間的疏水相互作用,促進(jìn)凝膠形成。生物玻璃納米粒含量為 40%和 50%的時候成膠溫度分別為 36.9℃和36.8℃,可用于體內(nèi)注射。將該水凝膠在人工體液中孵育一段時間后能觀察到水凝膠內(nèi)部的骨狀羥基磷灰石的產(chǎn)生,隨著納米粒含量的增大和孵育時間的增長,形成的羥基磷灰石的密度增大。該可注射性凝膠體系在骨組織工程中用作臨時支架具有一定可行性。

6 殼聚糖和無機(jī)磷酸鹽制備的溫敏水凝膠

除了有機(jī)磷酸鹽(甘油磷酸鹽)外,無機(jī)磷酸鹽也可用于中和 CS溶液,制備溫敏成膠體系。

Nair等[34]在 CS溶液中加入不同濃度的磷酸氫銨(AHP)制備了 CS/AHP溫敏水凝膠。CS/AHP同CS/GP具有相似的溫敏性,但不具有可逆性。同CS/GP體系相比較,CS/AHP體系所需要的AHP量要比 GP量小,且成膠速度更快。加入 AHP后 CS體系的 pH增大,但當(dāng) pH＜7時不能成膠,在實驗研究范圍內(nèi),隨著AHP濃度的增大,37℃條件下 CS/ AHP體系的成膠時間縮短。CS/AHP具有良好的細(xì)胞相容性,可用作干細(xì)胞的載體和大分子藥物釋放載體。

Ta等[35,36]制備了 CS/K2HPO4溫敏水凝膠,該體系同 CS/GP具有相似的溫敏性。弱堿性的K2HPO4具有 GP相似的效果,低溫下能夠有效調(diào)節(jié)CS酸溶液的 pH至中性且不產(chǎn)生絮凝,而堿性較強(qiáng)的 K3PO4和呈酸性的 KH2PO4則不能用來制備 CS溫敏體系,可以看出 pH值對 CS溶液成膠與否有很大影響。pH＞6.2時體系才能成膠。但 pH過大,低溫條件下 CS分子也會立刻發(fā)生絮凝沉淀。三種磷酸鹽加入后,CS體系 pH變化如下[Table 1]:

表 1 不同摩爾比例條件下制備的殼聚糖/無機(jī)磷酸鹽混合溶液的 pH和成膠情況[35]Table 1 pH and ability to gel of chitosan/orthophosphate solutionswith differentmolar ratios of chitosan to salt[35]

CS和 K2HPO4的濃度對于成膠速度、成膠時間、藥物釋放特征都有顯著影響。一定范圍內(nèi),CS和 K2HPO4濃度的增大都能縮短成膠時間,降低成膠溫度,可以通過控制這兩個因素達(dá)到控制體系的成膠時間和溫度的目的。CS濃度明顯影響藥物突釋效應(yīng)和釋放速率,而 K2HPO4的濃度只是影響藥物的突釋效應(yīng),對藥物釋放速率影響不大。包載藥物的分子量、分子結(jié)構(gòu)以及帶電性質(zhì)也都影響藥物的釋放特征。

7 殼聚糖溫敏水凝膠的應(yīng)用

水凝膠在低溫下呈流動的狀態(tài),而當(dāng)溫度升至人體溫度時將會變成不可流動狀態(tài),具有可注射性。低溫下在溶膠內(nèi)包載活細(xì)胞、蛋白分子或其他的藥物,注射到人體后成膠,可作為組織工程支架或智能藥物緩釋載體。

7.1 藥物釋放載體

原位作用植入型藥物釋放系統(tǒng),是經(jīng)手術(shù)植入體內(nèi)或皮下或經(jīng)穿刺導(dǎo)入皮下的控釋制劑,是一種長期給藥體系,克服了需長期用藥時傳統(tǒng)給藥方法的缺點,能長期穩(wěn)定控制靶向部位藥物濃度或血藥濃度,提高藥物的生物利用度,從而減少用量、降低副作用。藥物應(yīng)用范圍也由當(dāng)初的避孕治療擴(kuò)展到抗腫瘤、胰島素給藥、心血管疾病、眼部疾病、抗結(jié)核、骨髓炎以及疫苗等多種治療領(lǐng)域。水凝膠是親水性多聚物交聯(lián)形成的三維多孔網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),內(nèi)部含有大量的水分,其三維多孔結(jié)構(gòu)類似于人體內(nèi)部基質(zhì)的結(jié)構(gòu).宏觀上水凝膠是半固體狀態(tài)的,微觀上來看其網(wǎng)孔內(nèi)部則包含大量的水分,小分子物質(zhì)在其內(nèi)部又可以溶液狀態(tài)存在[37].水凝膠現(xiàn)在已經(jīng)被用作很多蛋白質(zhì)、藥物或者基因等的載體,作為原位作用植入型藥物釋放系統(tǒng)應(yīng)用。

CS水凝膠因其具有生物可降解性,因此植入后無需手術(shù)取出,即可被機(jī)體降解吸收,免除手術(shù)痛苦。因此常用 CS水凝膠包載一些比較敏感的蛋白類藥物如胰島素,或者生物半衰期比較短,口服不穩(wěn)定,以及全身毒副作用比較大的藥物[7,10]。釋放初期,主要是分散在凝膠網(wǎng)孔內(nèi)的藥物通過擴(kuò)散作用而釋放,后期則是連接在水凝膠網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)上的藥物通過水凝膠的溶蝕作用而被釋放出來。

本研究室吉秋霞等[38]利用 CS/HTCC/GP共混制備了溫敏水凝膠,用于奧硝唑和氯已啶的體外釋放研究,其緩釋效果明顯;大鼠股部肌肉內(nèi)原位注射結(jié)果表明,此水凝膠具有良好的組織相容性,臨床使用安全;通過建立犬牙周組織缺損病理模型,證明CS/HTCC/GP溫敏水凝膠是良好的生長因子載體,且具有較強(qiáng)的促進(jìn)牙周組織再生的作用。

Han等[39]在 CS水凝膠中包載了阿霉素和牛痘疫苗,化學(xué)療法和免疫療法同時進(jìn)行,作為抗腫瘤藥物原位釋放載體。動物實驗結(jié)果表明,水凝膠中的牛痘疫苗和阿霉素具有協(xié)同作用,能夠有效抑制腫瘤生長。

7.2 組織工程支架材料

組織工程采用可注射原位形成水凝膠.與預(yù)成型支架相比具有特定的優(yōu)勢:能填充任意形狀的缺損,并在很大程度上降低植入對機(jī)體組織的侵入性,且能與各種治療藥物混合。可注射性水凝膠材料是攜帶細(xì)胞的載體,具有攜帶細(xì)胞、促進(jìn)細(xì)胞體內(nèi)移植區(qū)滯留及增殖與分化的作用,是可注射性組織工程的重要組成部分。CS是胞外基質(zhì)類似物,CS水凝膠具有三維多孔結(jié)構(gòu),它具有生物相容性好、成膠時間及體內(nèi)降解時間可調(diào)控等優(yōu)點,在軟骨組織工程等領(lǐng)域已經(jīng)得到應(yīng)用[40-41]。

Hao等[42]制備了 CS/GP溫敏水凝膠,通過 SD大鼠肌內(nèi)注射植入,進(jìn)行組織相容性檢測;與軟骨細(xì)胞復(fù)合構(gòu)建組織工程化軟骨,觀察軟骨細(xì)胞在 CS水凝膠中的存活情況,并于體外培養(yǎng) 3周后,做相關(guān)組織形態(tài)學(xué)檢測。組織相容性檢測表明,該材料具有良好的組織相容性,植入體內(nèi) 2、4周時有少量炎性細(xì)胞浸潤,6周時材料降解明顯,8周時已經(jīng)基本降解;組織形態(tài)學(xué)檢查,觀察到軟骨陷窩樣結(jié)構(gòu),軟骨細(xì)胞具有分泌細(xì)胞外基質(zhì)的功能。Xu等[43]采用CS水凝膠在心梗部位進(jìn)行局部注射,通過對 CS水凝膠在注射部位存留及降解情況的觀察以及術(shù)后 4周的組織形態(tài)學(xué)、免疫組織化學(xué)檢查,探討其促血管生成及心肌保護(hù)作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn),與單純心梗組和PBS組比較,CS水凝膠注射組梗死壁中部和邊緣區(qū)域血管密度顯著增加,心室壁明顯增厚 (P＜0.01),為將來以 CS水凝膠為支架材料研制可注射性組織工程化心肌奠定了基礎(chǔ)。

Cho等[19]制備了水溶性 CS-g-PN IPAm衍生物,該衍生物具有類似 CS/GP的溫敏性,其成膠溫度為32℃。間充質(zhì)干細(xì)胞懸液和該高聚物溶液混合,體外、體內(nèi)分別成膠后培養(yǎng),觀察細(xì)胞的增殖分化情況。體內(nèi)注射結(jié)果表明,在培養(yǎng)的 3個月內(nèi),間充質(zhì)干細(xì)胞在體內(nèi)能分化為軟骨細(xì)胞,并逐漸生長形成軟骨組織塊,多聚體支架緩慢降解被機(jī)體吸收。另外,該凝膠對于小分子具有非常好的滲透性,這非常有利于軟骨的形成。

7.3 制備細(xì)胞單層用于特殊組織工程需要

溫敏性聚合物在組織工程等領(lǐng)域應(yīng)用前景非常好,因為其從較高溫度降低至低臨界相轉(zhuǎn)變溫度以下時,分子的親水性和疏水性狀態(tài)會發(fā)生急劇的變化,吸附生長在溫敏性聚合物表面的細(xì)胞層會自發(fā)的脫落到細(xì)胞培養(yǎng)液中,因而不需要酶等處理即可獲得細(xì)胞單層,而應(yīng)用于組織工程。傳統(tǒng)的制備方法通常會破壞細(xì)胞間連接,而上述方法操作溫和具有更大的優(yōu)勢[44],。Kushida等[45]利用化學(xué)接枝法將 PN IPAM接枝到組織培養(yǎng)用的聚苯乙烯上,并利用LCST附近多聚物親水疏水性的變化,成功地在無酶作用的條件下制備了完整的角化細(xì)胞 (Madin-Darby canine kidney(MDCK)cell)、犬的腎細(xì)胞以及肝細(xì)胞的細(xì)胞單層。

圖 7 3T3細(xì)胞在 CPN水凝膠表面37℃培養(yǎng) 7 d后長成細(xì)胞單層,20℃處理 60 min后細(xì)胞單層脫落[46]Fig.7 The formation of a detached 3T3 cell sheet after cultured on chitosan-g-poly(N-isoprorylacrylamide)hydrogel at37℃for 7 days followed by cold treatment at 20℃ for 60 min[46].

Chen等[46]制備了溫敏性的 CS-g-PN IPAM (CPN),在 CPN水凝膠表面培養(yǎng)細(xì)胞至形成細(xì)胞單層。利用水凝膠的溫度敏感性,低溫放置一定時間后,水凝膠轉(zhuǎn)變?yōu)橐后w狀態(tài),細(xì)胞單層自動脫落下來,收集已制備好的細(xì)胞單層應(yīng)用于其他組織工程研究[Fig.7]。該方法無需酶處理,條件溫和,收率高,細(xì)胞解吸附效率高達(dá) 80%。從凝膠表面上解吸附下來的細(xì)胞仍保持較高的活性,轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)基里可繼續(xù)分裂增殖。

8 結(jié)語

殼聚糖是一種優(yōu)良天然生物材料,通過多種制備途徑,能夠制備得到各種類型溫敏水凝膠,從而為研究和應(yīng)用提供更廣闊的空間。殼聚糖溫敏水凝膠制備條件溫和,且具有良好的生物相容性,可用作多種特殊藥物的載體,包括敏感性的蛋白藥物、生物半衰期短的藥物、口服不穩(wěn)定藥物以及全身毒副作用較大的藥物。通過包載載藥脂質(zhì)體、微球、納米球等用于小分子藥物緩釋研究,能夠明顯改善小分子藥物緩釋效果。殼聚糖溫敏水凝膠的理化、生物學(xué)性質(zhì)等都能較好地滿足細(xì)胞生長、增殖和分化的需要,可用作可注射性組織工程支架材料。但是,從研究報道中也可以發(fā)現(xiàn),目前研究制備的殼聚糖溫敏水凝膠性能方面還有些不足,如機(jī)械強(qiáng)度不夠、低溫條件下凝膠-溶膠轉(zhuǎn)變速度慢甚至不具有可逆性等。因此,制備具有良好的生物力學(xué)性能、可逆性及快速響應(yīng)性的殼聚糖基溫敏水凝膠以滿足不同需求,并最終應(yīng)用到臨床上,依然是今后研究的主要方向。

1 Xiong FH(熊富華),et al.Intelligent hydrogel.Guangzhou Chem Ind(廣州化工),2007,35:4-7.

2 Lin Y(林瑩),et al.Physical and in vitro release properties ofmethylcellulose-based thermo-sensitive hydrogels.J Tsinghua Univ,Sci Tech(清華大學(xué)學(xué)報,自科版),2006,46:22-37.

3 Zhang K(張侃),Zhang LM(張黎明).Recent Research Progress of Environmentally Responsive Hydrogels.Guangzhou Chem(廣州化學(xué)),2001,26:46-54.

4 Gekko K,Ito H.Competing solvent effects of polyols and guanidine-hydrochloride on protein stability.JB iochem, 1990,107:572-577.

5 Chenite A,et al.Novel injectable neutral solutions of chitosan for m biodegradable gels in situ.B iom aterials,2000,21: 2155-2161.

6 Ruel-Garie′py E,et al.Characterization of thermosensitive chitosan gels for the sustained delivery of drugs.Int J Phar m,2003:89-98.

7 Ruel-Garie′py E,et al.Thermosensitive chitosan-based hydrogel for the local delivery of paclitaxel.Eur J Phar m B iophar m,2004,57:53-63.

8 Ruel-Gariépy E,et al.Ther mosensitive chitosan-based hydrogel containing liposomes for the delivery of hydrophilic molecules.J Controlled Release,2002,82:373-383.

9 Zhou HY,et al.Effect ofmolecularweight and degree of chitosan deacetylation on the preparation and characteristics of chitosan thermosensitive hydrogel as a delivery system.Carbohydr Polym,2008,73:265-273.

10 Wu J,Su ZG,Ma GH.A ther mo-and pH-sensitive hydrogel composed of quaternized chitosan/glycerophosphate.Int J Phar m,2006,315:1-11.

11 Jiang TD(蔣挺大).Chitin(甲殼素).Beijing:Chemical Industry Press,2003.46-67.

12 Zhao QS,et al.Effect of organic and inorganic acids on chitosan/glycerophos phate thermosensitive hydrogel.J Sol-Gel Sci Technol,2009,50:111-118.

13 CheniteA,et al.Rheological characterisation of thermogelling chitosan/glycerol-phosphate solutions.CarbohydrPolym, 2001,46:39-47.

14 Ganji F,et al.Gelation time and degradation rate of chitosanbased injectable hydrogel.J Sol-Gel Sci Technol,2007,42: 47-53.

15 Zhang CL(張長亮).Research on the Scaffold in Bone Tissue Engineering Formed by Injectable and Temperature Sensible Chitosan Hydrogel.Tianjin:Tianjin University(天津大學(xué)),MsD.2005.

16 DangJM,et al.Temperature-responsive hydroxybutyl chitosan for the culture of mesenchymal stem cells and intervertebral disk cells.B iom aterials,2006,27:406-418.

17 Tang YF,et al.Rheological characterisation of a novel thermosensitive chitosan/poly(vinyl alcohol)blend hydrogel.Carbohydr Polym,2007,67:491-499.

18 Wu J,et al.A ther mosensitive hydrogel based on quaternized chitosan and poly(ethylene glycol)for nasal drug delivery system.B iomaterials,2007,28:2220-2232.

19 Cho JH,et al.Chondrogenic differentiation of human mesenchymal stem cells using a thermosensitive poly(N-isopropylacrylamide)and water-soluble chitosan copolymer.B iom aterials,2004,25:5743-5751.

20 Chen JP.Cheng TH.Thermo-Responsive Chitosan-graft-poly (N-isopropylacrylamide)Injectable Hydrogel for Cultivation of Chondrocytes andMeniscus Cells.M acromol B iosci,2006, 6:1026-1039.

21 Cao YX,et al.Poly(N-isopropylacrylamide)-chitosan as ther mosensitive in situ gel-forming system for ocular drug delivery.J Controlled Release,2007,120:186-194.

22 DengL,et al.Investigation on the properties ofmethoxy poly (ethylene glycol)/chitosan graft co-polymers.J B iom ater Sci Polym Ed,2007,18:1575-1589.

23 BhattaraiN,et al.PEG-grafted chitosan as an injectable thermosensitive hydrogel for sustained protein release.J Controlled Release,2005,103:609-624.

24 Zhang Y W(章永旺),et al.Preparation and characterization Of a new inj ectablethermosensitive hydrogel for sustained drug release.J Beijing UnivNat Sci(北京化工大學(xué)學(xué)報,自科版),2007,34:535-539.

25 Chung HJ,et al.Synthesis and characterization of Pluronic? grafted chitosan copolymer as a novel injectable biomaterial.CurrAppl Phys,2005,5:485-488.

26 BochotA,et al.Liposomes dispersed within a thermosensitive gel:a new dosage for m for ocular delivery of oligonucleotides.Phar m Res,1998,15:1364-1369.

27 PaavolaA.et al.Controlled release injectable liposomal gelof ibuprofen for epidural analgesia.Int J Phar m,2000,199:85-93.

28 WeinerAL,et al.Liposome-collagen gelmatrix:a novel sustained drug delivery system.J phar m sci,1985,74:922-925.

29 Ruel-Garie′py E,et al.Ther mosensitive chitosan-based hydrogel containing liposomes for the delivery of hydrophilic molecules.J Controlled Release,2002,82:373-383.

30 Zhang XZ,Chu CC.Fabrication and characterization of microgel- impregnated.thermosensitivePN IPAAm hydrogels.Polym er,2005,46:9664-9673.

31 Xiao L(肖玲 ),et al.Fabrication and characterization of quaternized chitosan nanoparticals impregnated chitosan thermo-sensitive hydrogels.J W uhan Univ,Nat Sci(武漢大學(xué)學(xué)報,理學(xué)版),2007,53:179-183.

32 Zan J,et al.Preparation of Thermosensitive Chitosan Formulations Containing 5-Fluorouraci/Poly-3-hydroxybutyrate MicroparticlesUsed as Injectable DrugDelivery System.Chin J Chem Eng,2006,14:235-241.

33 Couto DS,et al.Development of bioactive and biodegradable chitosan-based injectable systems containing bioactive glass nanoparticles.Acta B iom aterialia,2009,5:115-123.

34 NairLS,et al.Development of Injectable Ther mogelling Chitosan-Inorganic Phosphate Solutions for Biomedical Applications.B iomacrom olecules,2007,8:3779-3785.

35 Ta HT,et al.Chitosan-dibasic orthophosphate hydrogel:A potential drug delivery system.Int J Phar m,2009,371:134-141.

36 Ta HT,et al.A chitosan-dipotassium orthophosphate hydrogel for the delivery ofDoxorubicin in the treatmentof osteosarcoma.B iomaterials,2009,30:3605-3613.

37 Tanaka Y,et al.Novel hydrogels with excellent mechanical perfor mance.Prog Poly Sci,2005,30:1-9.

38 JiQX,et al.Injectable ther mosensitive hydrogel based on chitosan and quaternized chitosan and the biomedical properties.J M ater Sci,M aterM ed,2009,20:1603-1610.

39 Han HD,et al.A chitosan hydrogel-based cancer drug delivery system exhibits synergistic antitumor effects by combining with a vaccinia viral vaccine.Int J Phar m,2008,350:27-34.

40 Yeo Y,et al.Photocrosslinkable hydrogel for myocyte cell culture and injection.J B iom ed M ater Res.PartB,2007,81: 312-322.

41 Xu B(徐斌),et al.Development of Chitosan Hydrogel and the Effect of C2C12 Adhesion and Support.J B iom ed Eng Res(生物醫(yī)學(xué)工程研究),2008,27:121-124.

42 Hao T(郝彤),et al.Reconstruction of tissue engineered cartilage using temperature-responsive chitosan hydrogel.M ed J Chin PLA(解放軍醫(yī)學(xué)雜志),2007,32:500-502.

43 Xu B(徐斌),et al.Exper imental studies on local injection with chitosan hydrogel on infarcted area of rat heart.M ed J Chin PLA(解放軍醫(yī)學(xué)雜志),2007,32:493-495.

44 Kikuchi A,Okano T.Nanostructured designs of biomedical materials:applications of cell sheet engineering to functional regenerative tissues and organs.J Controlled Release,2005, 101:69-84.

45 KushidaA,et al.Temperature-responsive culture dishes allow non-enzymatic harvest of differentiated Madin-Darby canine kidney(MDCK)cell sheets.J B iom ed M ater Res,2000,51: 216-223.

46 Chen JP,Yang TF.Applications of chitosan-based ther mosensitive copolymers for harvesting living cell sheet.Appl Surf Sci,2008,255:297-300.

The Progress and Application of Thermosensitive Hydrogel Based on Chitosan and ItsDerivatives

KANG Chuan-zhen,CHENG Xiao-jie,CHEN Xi-guang＊
College of M arine Life Science.Ocean University of China.Q ingdao 266003,China

Chitosan-based thermosensitive hydrogel could undergo a liquid-solid phase transfor mation when injected from room temperature environment to human body.Cells,proteins and other drugs could be incorporated into the hydrogel and their in situ fixation or release could be realized.So this hydrogel could be applied to cell transplantation for tissue repair and drug delivery.In this paper,the development of chitosan-based thermosensitive hydrogel is introduced,and its application in tissue engineering and drug delivery are reviewed in detail.

chitosan;glycerophosphate;ther mosensitive hydrogel;drug delivery;tissue engineering

R944.1+5

A

1001-6880(2010)05-0919-09d

2009-10-09 接受日期:2009-11-24

科技部國際合作重點項目 (2008DFA31640);教育部博士點基金項目 (20070423013)

＊通訊作者 Tel:86-532-82032215;Email:xgchen@ouc.edu.cn