談 金 鄧穗平 歐陽(yáng)健明

(暨南大學(xué)生物礦化與結(jié)石病防治研究所，暨南大學(xué)化學(xué)系,廣州 510632)

HKC細(xì)胞損傷前后對(duì)草酸鈣晶體吞噬能力的差異

談 金 鄧穗平 歐陽(yáng)健明＊

(暨南大學(xué)生物礦化與結(jié)石病防治研究所，暨南大學(xué)化學(xué)系,廣州 510632)

采用人類腎臟近端小管上皮細(xì)胞系(HKC)建立氧化性損傷模型，研究損傷前后HKC調(diào)控草酸鈣(CaOxa)結(jié)晶的差異。采用CCK-8法檢測(cè)HKC的細(xì)胞活性；利用激光共聚焦顯微鏡觀察HKC損傷后表達(dá)的晶體粘附分子骨橋蛋白(OPN)；采用倒置顯微鏡觀察HKC的形態(tài)變化；采用掃描電子顯微鏡(SEM)觀察HKC微結(jié)構(gòu)及其誘導(dǎo)的晶體；采用X射線衍射分析(XRD)表征晶體的組分。在CaOxa過(guò)飽和溶液中，正常HKC主要誘導(dǎo)形成二水草酸鈣(COD)晶體，而損傷HKC則同時(shí)誘導(dǎo)了COD和一水草酸鈣(COM)晶體。正常HKC對(duì)COD晶體有較強(qiáng)的吞噬能力，而損傷HKC的這種能力較弱；HKC損傷后表達(dá)OPN，促進(jìn)CaOxa晶體的成核和聚集，從而增加了腎結(jié)石形成的危險(xiǎn)性。

草酸鈣；細(xì)胞調(diào)控；腎結(jié)石；生物礦化

對(duì)腎結(jié)石礦物與腎小管上皮細(xì)胞之間相互作用的研究已經(jīng)較為廣泛[1-2]。盡管普遍認(rèn)為晶體對(duì)腎小管上皮細(xì)胞具有損傷作用，但是也有一些研究結(jié)果表明晶體對(duì)腎小管上皮細(xì)胞影響不大[3]。

McMartin等[1]報(bào)導(dǎo)，一水草酸鈣(COM)晶體可引起人近端腎小管細(xì)胞、大鼠近端腎小管細(xì)胞的壞死。Schepers等[3]認(rèn)為，COM晶體對(duì)豬和犬的近端腎小管細(xì)胞(LLC-PK1和MDCK-Ⅱ)具有毒害作用，但是對(duì)鼠和犬的集合管細(xì)胞 (RCCD1與MDCK-Ⅰ)沒(méi)有毒害作用。近端腎小管細(xì)胞能迅速粘附晶體，隨后內(nèi)吞晶體，1 d后內(nèi)吞晶體的細(xì)胞從細(xì)胞層中脫落；但是，集合管細(xì)胞與COM晶體共同孵育一段時(shí)間后，既沒(méi)有粘附也不會(huì)內(nèi)吞COM晶體，集合管細(xì)胞的形貌也沒(méi)有發(fā)生改變。上述結(jié)果說(shuō)明，COM晶體對(duì)腎臟中不同部位或不同類型腎小管細(xì)胞的作用不同。

例如，對(duì)于犬腎小管上皮細(xì)胞(MDCK)，實(shí)際上還可細(xì)分為兩種細(xì)胞株：MDCK-Ⅰ和MDCK-Ⅱ，這兩種細(xì)胞的性質(zhì)互不相同；而在早期的研究中，并沒(méi)有對(duì)此加以區(qū)分，因此導(dǎo)致以MDCK作為研究對(duì)象所得到的結(jié)論不一致。Verkoelen等[4]報(bào)導(dǎo)，MDCK與COM晶體作用后沒(méi)有檢測(cè)到細(xì)胞的損傷，COM晶體粘附到MDCK后被細(xì)胞內(nèi)吞，隨后從細(xì)胞層中被除去；而Thongboonkerd等[5]報(bào)導(dǎo)，COM晶體能夠損傷MDCK；Khan等[6]亦報(bào)導(dǎo)了COM晶體可以損傷MDCK，導(dǎo)致20%～30%的細(xì)胞脫落，且部分脫落細(xì)胞中內(nèi)吞有晶體。

另外，由于不同的研究小組采用不同類型或不同來(lái)源的晶體進(jìn)行研究，亦導(dǎo)致所得到的結(jié)論不一致。例如，Aihara等[2]研究了不同濃度的磷酸鈣與LLC-PK1和MDCK-Ⅰ的相互作用，發(fā)現(xiàn)兩類細(xì)胞與磷酸鈣晶體接觸后都產(chǎn)生細(xì)胞損傷現(xiàn)象，從而促進(jìn)了晶體的粘附和結(jié)石的發(fā)展。Escobar等[7]發(fā)現(xiàn)，來(lái)自腎結(jié)石中的草酸鈣(CaOxa)晶體、磷酸鈣晶體對(duì)大鼠腎小管上皮細(xì)胞(NRK-52E)的損傷程度較小，而人工合成的上述晶體對(duì)細(xì)胞的損傷程度較大。

此外，在以往的文獻(xiàn)里，大多數(shù)情況是采用預(yù)先制備好的COM種晶與細(xì)胞作用，對(duì)二水草酸鈣(COD)晶種與細(xì)胞作用的研究很少，目前僅見(jiàn)Lieske等[8]的報(bào)道，他們采用非洲綠猴腎上皮細(xì)胞(BSC-1)與COD晶體相互作用，發(fā)現(xiàn)COD晶體的(100)晶面能夠選擇地快速粘附在BSC-1細(xì)胞上。

因此，研究細(xì)胞與尿石晶體的相互作用時(shí)，必須確定細(xì)胞的種類、晶體類型、晶體來(lái)源、以及體系中CaOxa溶液的過(guò)飽和度等。

HKC是分化良好的人類腎臟近端小管上皮細(xì)胞，存活時(shí)間長(zhǎng)、易于傳代培養(yǎng)，是研究腎毒性的一種有重要價(jià)值的體外細(xì)胞模型。HKC細(xì)胞具有腎小管上皮細(xì)胞特有的結(jié)構(gòu)和功能，能表達(dá)近端腎小管特異性標(biāo)志酶如堿性磷酸酶 (AP)、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(γ-GT)及上皮細(xì)胞分化的標(biāo)志物細(xì)胞角蛋白。

基于此，本文研究了HKC與CaOxa飽和溶液的相互作用，觀察了CaOxa晶體在正常HKC與損傷HKC上的成核、生長(zhǎng)以及與HKC的相互作用，期望為進(jìn)一步了解結(jié)石形成的細(xì)胞機(jī)制提供新的啟示。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試 劑

人類近端腎小管上皮細(xì)胞系(HKC)來(lái)自Johns Hopkins大學(xué)醫(yī)學(xué)院Racusen博士，由第二軍醫(yī)大學(xué)上海長(zhǎng)征醫(yī)院腎內(nèi)科梅長(zhǎng)林教授惠贈(zèng)。培養(yǎng)液DMEM-F12(Gibco，美國(guó))，新生牛血清(Gibco，新西蘭)，青霉素(華北制藥股份有限公司)，鏈霉素(大連美羅大藥廠)，細(xì)胞増生分析試劑盒(CCK-8)(日本同仁化學(xué)研究所)，細(xì)胞培養(yǎng)板(Iwaki，日本)。丙二醛(MDA)試劑盒(南京建成生物工程研究所)。其它試劑如 NaCl、KCl、Na2HPO4·2H2O、KH2PO4、NaHCO3均為分析純。

在D-Hanks平衡液中制備草酸鉀儲(chǔ)液(20 mmol·L-1)、氯化鈣儲(chǔ)液 (20 mmol·L-1)，pH 值調(diào)至7.4。使用前配制 cCa2+=c=0.3 mmol·L-1的CaOxa 飽和溶液。

1.2 儀 器

XL-30型環(huán)境掃描電子顯微鏡 (ESEM,Philips公司)，樣品噴金處理，測(cè)量電壓為20 kV。酶標(biāo)儀(Safire2,Tecan，瑞士)，在酶標(biāo)儀上測(cè)量吸光度值，測(cè)試波長(zhǎng)為 450 nm(檢測(cè) CCK-8)或者 532 nm(檢測(cè)MDA)。日本理學(xué)D/max 2400(Rigaku)X射線衍射儀，Cu靶，Kα 射線，石墨單色器，40 kV，30 mA，掃描范圍5°～60°。倒置顯微鏡為倒置熒光顯微鏡(IX51)(日本奧林巴斯公司)。激光共聚焦熒光顯微鏡(510 META DUO SCAN，CARL ZEISS，德國(guó))。

1.3 HKC培養(yǎng)

HKC用含10%新生小牛血清的DMEM-F12培養(yǎng)液培養(yǎng)，同時(shí)加入 100 U·mL-1青霉素和 100 μg·mL-1鏈霉素。培養(yǎng)條件為37℃、5%CO2、飽和濕度。HKC傳代采用胰蛋白酶消化法。細(xì)胞達(dá)80%融合后，吸除培養(yǎng)液，用D-Hanks平衡液洗滌HKC 2次，加入0.25%胰酶消化液，置于37℃培養(yǎng)箱中3～5 min后，在倒置顯微鏡下觀察HKC的消化程度，當(dāng)細(xì)胞變圓，細(xì)胞之間出現(xiàn)孔隙且不再連接成片，表明此時(shí)細(xì)胞消化適度，加入含10%新生小牛血清的DMEM-F12培養(yǎng)液終止消化，并吹打細(xì)胞脫離瓶壁形成單細(xì)胞懸液；離心3 min(1 000 r·min-1)，棄去上清液，再加入含10%新生牛血清的DMEM-F12培養(yǎng)液，吹打細(xì)胞形成單細(xì)胞懸液，備用。

1.4 細(xì)胞的損傷和損傷程度檢測(cè)

(1)損傷HKC的活性檢測(cè)：采用CCK-8法檢測(cè)HKC的損傷[9]，以細(xì)胞活性反映HKC的損傷程度。

按細(xì)胞濃度為 1×104cell·mL-1、100 μL·hole-1接種于96孔培養(yǎng)板，加入含10%新生牛血清的DMEM-F12培養(yǎng)液孵育24 h，改用無(wú)血清DMEMF12培養(yǎng)液孵育12 h，使細(xì)胞同步化。將HKC分兩組，每組均設(shè)3個(gè)平行復(fù)孔。①對(duì)照組：只加入無(wú)血清培養(yǎng)液；② 損傷組：加入含有 0.5 mmol·L-1H2O2的無(wú)血清培養(yǎng)液，分別作用 HKC 細(xì)胞 0、0.5、1、1.5、2 h。然后，兩組細(xì)胞改用新鮮的無(wú)血清培養(yǎng)液，每孔加入 10 μL的 CCK-8，于 37℃下孵育 4 h后，用酶標(biāo)儀在450 nm處測(cè)量吸光度 (A)，各個(gè)條件下的HKC平行測(cè)定3個(gè)重復(fù)孔，求A值的平均值。

(2)HKC損傷前后丙二醛(MDA)含量檢測(cè)：按照上面方法損傷細(xì)胞后，將細(xì)胞懸浮液移入EP管內(nèi)，在4℃離心10 min。取上清液，采用南京建成生物工程研究所提供的試劑盒，用硫代巴比妥酸(TBA)法測(cè)量MDA的含量，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，比色法測(cè)定。

(3)HKC損傷前后表達(dá)的骨橋蛋白(OPN)檢測(cè)：將培養(yǎng)瓶中70%～80%融合生長(zhǎng)的HKC經(jīng)胰酶消化后，取 1 mL(濃度 1×105cell·mL-1)細(xì)胞懸浮液接種于預(yù)先鋪有蓋玻片的6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng) 24 h后，改用無(wú)血清DMEM/F12培養(yǎng)液孵育12 h，使細(xì)胞同步化。按照上面方法損傷細(xì)胞后，從孔板中取出蓋玻片，用0.01 mol·L-1的 PBS洗 3 次，每次 5 min。4%甲醛/0.1%戊二醛固定 10 min，PBS 洗 3 次(5 min×3)。加入含有羊血清的1%牛血清白蛋白(BSA)封閉液，在37℃條件下孵育20 min。甩掉多余血清，滴加OPN抗體(sc-20788，Santa Cruz)(1∶150)，于 37℃下孵育 1 h，PBS洗3次(5 min×3)。滴加FITC標(biāo)記羊抗兔IgG抗體(sc-2012，Santa Cruz)(1∶100)，放于暗處，在 37 ℃下孵育30 min，PBS充分沖洗3次(5 min×3)。使用4′，6-二脒基-2-苯基吲哚 (DAPI) 封閉液(sc-24941，Santa Cruz)封片。對(duì)照組以兔血清代替OPN抗體。于激光共聚焦熒光顯微鏡下觀察并拍攝照片。

1.5 HKC誘導(dǎo)CaOxa晶體生長(zhǎng)及晶體的SEM和XRD檢測(cè)

按細(xì)胞濃度為 1×105cells·mL-1、1000 μL·hole-1接種于12孔培養(yǎng)板內(nèi)，孔板底部預(yù)先平鋪有大小合適的蓋玻片。用含10%新生牛血清的DMEM-F12培養(yǎng)液孵育24 h后，改用無(wú)血清DMEM-F12培養(yǎng)液孵育12 h，使細(xì)胞同步化。將HKC分為4組，每組均設(shè)3個(gè)平行復(fù)孔。①空白對(duì)照組：加入無(wú)血清培養(yǎng)液；② H2O2組：每孔加入含 0.5 mmol·L-1H2O2的無(wú)血清培養(yǎng)液，作用1 h；③ CaOxa組：加入含0.3 mmol·L-1CaOxa過(guò)飽和溶液的無(wú)血清培養(yǎng)液，置于37 ℃下分別孵育 0、0.33、3、6、12、24 h； ④ H2O2+CaOxa 組： 加入含 0.5 mmol·L-1H2O2的無(wú)血清培養(yǎng)液，37℃下孵育1 h后，吸除培養(yǎng)液，用D-Hanks清洗細(xì)胞2次，加入含0.3 mmol·L-1CaOxa過(guò)飽和溶液的無(wú)血清培養(yǎng)液，置于37℃下分別孵育0、0.33、3、12、24 h。

達(dá)到預(yù)定的結(jié)晶時(shí)間后，取出蓋玻片，用DHanks沖洗細(xì)胞2次，加入2.5%戊二醛固定細(xì)胞2 h，再用1%OsO4對(duì)細(xì)胞進(jìn)行后固定，D-Hanks沖洗3次，梯度乙醇(30%、50%、70%、90%、100%)脫水，CO2臨界點(diǎn)干燥，裝樣并將樣品噴鍍包被，在SEM下觀察細(xì)胞形態(tài)和晶體生長(zhǎng)情況。同時(shí)對(duì)蓋玻片上的晶體進(jìn)行XRD檢測(cè)，確定晶體的組分。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果與討論

2.1 H2O2對(duì)HKC的損傷及損傷程度檢測(cè)

2.1.1 H2O2對(duì) HKC 的損傷及損傷程度檢測(cè)

通過(guò)檢測(cè)H2O2對(duì)HKC的增殖抑制作用，來(lái)衡量H2O2對(duì)HKC的損傷程度，結(jié)果如圖1所示。用0.5 mmol·L-1的 H2O2作用細(xì)胞 0.5 h 后，細(xì)胞的活性為(82.1±3.1)%，表明 HKC 已經(jīng)發(fā)生明顯的損傷(P＜0.05)；作用 1 h 后，細(xì)胞活性顯著下降到(45.0±0.9)%；增加H2O2作用時(shí)間，對(duì)HKC的損傷進(jìn)一步加劇，細(xì)胞活性進(jìn)一步降低；作用2 h后，HKC活性為(35.1±0.6)%(P＜0.05)。

2.1.2 HKC 損傷后的丙二醛含量增加

在生物體內(nèi)，腎上皮細(xì)胞在病理情況下通過(guò)非酶反應(yīng)與酶促反應(yīng)產(chǎn)生大量的氧自由基。而生物膜的主要成分磷脂含有不飽和脂肪酸，氧自由基對(duì)這些不飽和脂肪酸中的不飽和鍵具有很高的親和力，從而產(chǎn)生過(guò)氧化反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞損傷，并因此形成脂質(zhì)過(guò)氧化物[10]，如醛基、酮基、羥基、羰基、氫過(guò)氧基等，其中醛類所占比例較大。丙二醛(MDA)是細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的終產(chǎn)物，其含量的多少可反映機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化的程度，也間接地反映出細(xì)胞受損傷的程度[11]。

表1為 0.5 mmol·L-1H2O2作用于 HKC 不同時(shí)間后MDA含量的變化。可以看出：H2O2作用HKC細(xì)胞 0.5 h 后，MDA 含量從對(duì)照組的 (0.38±0.03)μmol·L-1明顯上升到 (0.86±0.06)μmol·L-1，說(shuō)明H2O2對(duì)細(xì)胞膜造成了損傷，導(dǎo)致MDA水平上升(P＜0.05)。隨著作用時(shí)間增加，MDA含量增加；當(dāng)作用2 h 時(shí)，MDA 含量達(dá)到(1.23±0.03)μmol·L-1，表明此時(shí)對(duì)細(xì)胞膜的損傷進(jìn)一步加劇。

表1 用0.5 mmol·L-1H2O2作用HKC不同時(shí)間后細(xì)胞釋放的MDA含量變化(±s)Table 1 Content change of MDA released by HKC after exposure to 0.5 mmol·L-1H2O2for different time(±s)

表1 用0.5 mmol·L-1H2O2作用HKC不同時(shí)間后細(xì)胞釋放的MDA含量變化(±s)Table 1 Content change of MDA released by HKC after exposure to 0.5 mmol·L-1H2O2for different time(±s)

*Data are mean±standard deviation of three independent experiments;*P＜0.05 compared with control without addition of H2O2at 0 h.

Time/h 0 0.5 1 1.5 2 Content of MDA/(μmol·L-1) (0.38±0.03) (0.86±0.06)* (1.063±0.06)* (1.11±0.08)* (1.23±0.03)*

2.1.3 細(xì)胞損傷后骨橋蛋白(OPN)分子檢測(cè)

HKC損傷后，會(huì)表達(dá)晶體粘附分子骨橋蛋白(OPN)。圖2為反映HKC損傷前后OPN分子表達(dá)量變化的激光共聚焦顯微鏡圖片。可看出，對(duì)照組HKC周?chē)鷽](méi)有或只有少量的綠色熒光(圖2a)，說(shuō)明沒(méi)有損傷的HKC不表達(dá)或只表達(dá)少量的OPN分子。

經(jīng) 0.5 mmol·L-1H2O2損傷 0.5 h 后，HKC 周?chē)霈F(xiàn)明顯的綠光熒光 (圖2b)，說(shuō)明HKC被損傷之后，表達(dá)了OPN分子。當(dāng)損傷時(shí)間增加至1.5 h后，綠色熒光強(qiáng)度增強(qiáng)(圖2c)，說(shuō)明HKC損傷加劇后，導(dǎo)致大量OPN分子的表達(dá)。

正常腎上皮細(xì)胞表面具有抵抗晶體粘附的性質(zhì)；但當(dāng)細(xì)胞受損傷后，細(xì)胞表面的微結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，并表達(dá)大量帶負(fù)電荷的物質(zhì)，如透明質(zhì)酸、膠原蛋白和OPN等[12-13]，這些負(fù)電荷的物質(zhì)能夠吸引鈣離子和草酸鈣晶體，是潛在的晶體粘附位點(diǎn)，被稱為晶體粘附物質(zhì)。圖2結(jié)果表明，HKC被損傷后，表達(dá)了OPN；從其綠色熒光強(qiáng)度可以看出，隨著損傷強(qiáng)度增加，OPN的表達(dá)量也增多。

2.2 損傷前后HKC與CaOxa過(guò)飽和溶液的作用

2.2.1 損傷前后HKC與CaOxa過(guò)飽和溶液作用后的活性變化

經(jīng)0.5 mmol·L-1H2O2損傷1 h后的HKC細(xì)胞，其活性為(45.0±0.9)%(圖1)；將此損傷的HKC再用0.3 mmol·L-1CaOxa過(guò)飽和溶液孵育后，其活性繼續(xù)降低，如圖3所示。隨著孵育時(shí)間增加到24 h，損傷HKC的活性從剛開(kāi)始時(shí)的(45.0±0.9)%繼續(xù)降低至(33.5±0.6)%。

相比之下，正常HKC用0.3 mmol·L-1CaOxa過(guò)飽和溶液孵育后，細(xì)胞的活性略有增加；如分別孵育3 h和24 h后，其活性分別為 (105.61.2)%和(114.12.1)%(圖3)，說(shuō)明細(xì)胞仍在繼續(xù)生長(zhǎng)。

2.2.2 正常HKC對(duì)COD晶體的內(nèi)吞作用

圖4為正常 HKC與 0.3 mmol·L-1的 CaOxa過(guò)飽和溶液孵育不同時(shí)間后誘導(dǎo)生成的晶體的SEM。可以看出，孵育0.33 h后，CaOxa晶體就已經(jīng)在HKC表面成核生長(zhǎng)(圖4a)，這些晶體具有COD的典型形貌四角雙錐形。

倒置顯微鏡觀察表明，孵育3 h后，HKC開(kāi)始覆蓋在其誘導(dǎo)的COD晶體表面上，表明此時(shí)HKC已經(jīng)開(kāi)始內(nèi)吞晶體。SEM進(jìn)一步顯示，被HKC覆蓋后的COD晶體，會(huì)在HKC的不斷作用下逐漸分解成尺寸較小的微晶(圖4b中箭頭所示)；且隨著孵育時(shí)間的增加，越來(lái)越多的COD晶體被分解形成尺寸更小的微晶(圖4c、4d中箭頭所示)。在此過(guò)程中，正常HKC的活性變化不大。該結(jié)果與Lieske等[8]研究BSC-1細(xì)胞與COD晶體相互作用的結(jié)果相似。

盡管有一些文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)[14-15]，CaOxa晶體對(duì)培養(yǎng)的腎小管上皮細(xì)胞產(chǎn)生損傷作用。但是，在這些文獻(xiàn)里采用的CaOxa晶體均為COM晶體。COM晶體與COD晶體對(duì)腎細(xì)胞的病理學(xué)行為不同，COD晶體是腎結(jié)石成分的另外一種礦物相，其含量比COM晶體少[16]；加上HKC還可以內(nèi)吞一部分COD晶體，因此，總體來(lái)看，COD晶體對(duì)腎細(xì)胞生長(zhǎng)的影響不大。即：相比COM晶體，在尿液中形成較多的COD晶體被認(rèn)為有利于減少形成結(jié)石的風(fēng)險(xiǎn)[17]。

正常HKC能夠抵御由一定量CaOxa晶體所造成的損傷，這可能是由于正常HKC誘導(dǎo)生成的主要為COD晶體、且晶體尺寸較小、數(shù)量較少所致。Lieske等[18-20]報(bào)導(dǎo)，COM晶體在15 s內(nèi)即可粘附在BSC-1細(xì)胞上面，隨后被BSC-1細(xì)胞內(nèi)吞，且被內(nèi)吞的COM晶體沒(méi)有對(duì)BSC-1細(xì)胞的生長(zhǎng)產(chǎn)生不利影響，反而促進(jìn)BSC-1細(xì)胞的增殖。

一般認(rèn)為，與遠(yuǎn)端腎小管上皮細(xì)胞 (如MDCKⅠ)和集合管細(xì)胞(如RCCD1)相比，近端腎小管上皮細(xì)胞(如LLC-PK1)對(duì)粘附在其表面的晶體的內(nèi)吞能力較強(qiáng)，且是一種主動(dòng)攝取的過(guò)程，因此，沒(méi)有觀察到MDCKⅠ與RCCD1對(duì)晶體的內(nèi)吞現(xiàn)象。這是腎臟上皮細(xì)胞的一種保護(hù)性機(jī)制，可以除去細(xì)胞表面潛在的晶體成核和生長(zhǎng)位點(diǎn)。從圖4c和圖4d可以看到，COD晶體被HKC內(nèi)吞，這正是HKC對(duì)腎結(jié)石形成的防御機(jī)制[21]。

2.3 損傷的HKC對(duì)COD晶體的內(nèi)吞能力減弱

損傷的HKC與0.3 mmol·L-1的CaOxa過(guò)飽和溶液孵育不同時(shí)間后，其誘導(dǎo)生成的晶體形貌如圖5所示?？梢钥闯?，在0.33 h內(nèi)，便有較多的草酸鈣晶體在損傷的HKC表面形成(圖5a)；但一直孵育到24 h(圖5d)，均很少發(fā)現(xiàn)損傷HKC內(nèi)吞晶體的現(xiàn)象。這與細(xì)胞內(nèi)蛋白激酶的活性有關(guān)。蛋白激酶在細(xì)胞的內(nèi)吞作用中起著重要調(diào)控作用[22]，細(xì)胞受到損傷后，蛋白激酶的活性降低，從而減弱了細(xì)胞的內(nèi)吞作用。

在損傷HKC誘導(dǎo)生成的CaOxa晶體中，不但形成聚集的晶體簇，而且COM晶體的比例顯著增加。圖6為損傷HKC誘導(dǎo)生成的CaOxa晶體的XRD圖。可以看到，XRD圖中同時(shí)出現(xiàn)了歸屬于COM和COD晶體的衍射峰，且COM晶體的衍射峰強(qiáng)度高于COD晶體，圖中晶面間距d=0.618、0.309和0.224 nm分別歸屬于COD晶體的 (200)、(400)和(213)晶面，d=0.593、0.365和0.297 nm分別歸屬于COM 的(101)、(020)和(202)晶面。

從圖2可以看出，HKC受損傷后，在其表面表達(dá)OPN。OPN是一種帶負(fù)電的分泌型的糖基化磷酸化蛋白，廣泛分布于多種組織和細(xì)胞中，其相對(duì)分子質(zhì)量約為44 kDa[23]，含有約300個(gè)氨基酸殘基，其中酸性氨基酸如天冬氨酸殘基、谷氨酸殘基和絲氨酸殘基約占總氨基酸量的一半。因此，OPN分子中含有豐富的酸性結(jié)構(gòu)域，這些酸性結(jié)構(gòu)域能與游離的Ca2+相結(jié)合，并可以粘附表面帶正電荷的COM晶體，促進(jìn)晶體在細(xì)胞表面的滯留[24-25]。因此，細(xì)胞受到損傷后，細(xì)胞吞噬晶體的能力顯著減弱(圖5)，導(dǎo)致大量晶體滯留在腎小管內(nèi)，引起晶體的聚集，甚至堵塞腎小管。

相比表面具有較高正電荷密度的COM晶體，COD晶體表面電荷密度很低，COD表面負(fù)電荷密度較高的部位僅處在其錐體的2個(gè)頂端[26-27]，在這兩個(gè)頂端上由于草酸根的突出而帶負(fù)電。損傷的HKC表面由于表達(dá)了OPN等酸性分子而帶負(fù)電，因此，COD晶體與損傷HKC的作用較弱。

上述結(jié)果提示，通過(guò)研究不同晶相的CaOxa晶體與不同性質(zhì)的細(xì)胞作用，有助于闡明腎石病復(fù)雜的病理學(xué)過(guò)程。

3 結(jié) 論

以氧化性損傷的HKC體系為模型，研究了CaOxa過(guò)飽和溶液與HKC的相互作用。結(jié)果表明，CaOxa晶體在正常HKC和受損傷HKC表面的成核和聚集行為存在差異。正常HKC主要誘導(dǎo)COD晶體形成，并對(duì)COD晶體的內(nèi)吞能力較強(qiáng)，而損傷HKC的內(nèi)吞能力減弱。損傷HKC促進(jìn)COM的成核和聚集，因此，HKC受損傷后，增加了草酸鈣結(jié)石形成的危險(xiǎn)性。

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Difference of Endocytosis to Calcium Oxalate Crystals by HKC Cells before and after Injury

TAN Jin DENG Sui-Ping OUYANG Jian-Ming＊
(Institute of Biomineralization and Lithiasis Research,Jinan University,Guangzhou 510632)

An oxidative injury model of human kidney proximal tubule epithelial cell line (HKC)was used to investigate the difference of crystallization of calcium oxalate(CaOxa)modulated by HKC before and after injury.Cell viability was examined by using Cell Counting Kit (CCK-8)assay;the change of expression of crystal adherent molecule osteopontin (OPN)on HKC after injury was observed by laser confocal microscope;the morphological change of HKC was observed by inverted microscope;the microstructure of HKC and the crystals induced by HKC were observed by means of scanning electron microscopy (SEM);the crystal component was characterized by X-ray diffraction (XRD).Calcium oxalate dihydrate (COD)crystals were mainly induced from CaOxa supersaturated solution by normal HKC,while COD crystals and calcium oxalate monohydrate(COM)crystals were simultaneously induced by injured HKC.The endocytosis of normal HKC to COD crystals was strong,but weak for injured HKC.After expression of OPN,the injured HKC can promote nucleation and aggregation of CaOxa crystals.It increases the risk of urolithiasis formation.

calcium oxalate;cell modulation;kidney stones;biomineralization

R69；R329；O614.23+1

A

1001-4861(2010)12-2131-07

2010-07-12。收修改稿日期：2010-08-17。

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.20971057)。

＊通訊聯(lián)系人。E-mail：toyjm@jnu.edu.cn，Tel：020-85223353

談 金，男，26歲，碩士研究生；研究方向：生物無(wú)機(jī)化學(xué)。