266071 濟(jì)南軍區(qū)青島第二療養(yǎng)院 張立營 孫英姿

250014 濟(jì)南軍區(qū)聯(lián)勤部疾病預(yù)防控制中心 趙懷龍 傅興倫

相思子毒素雙抗夾心ELISA檢測方法的建立與評價(jià)

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目的 建立相思子毒素雙抗夾心ELISA檢測方法并進(jìn)行方法學(xué)評價(jià)。方法 優(yōu)化最佳相思子毒素多抗包被濃度后建立了相思子毒素雙抗夾心ELISA檢測方法，鑒定其檢測靈敏度、線性范圍、特異性、重復(fù)性、回收率等。結(jié)果 雙抗夾心ELISA方法檢測相思子毒素的最小檢出限為1 ng/mL，標(biāo)準(zhǔn)曲線在10～100 ng/mL范圍內(nèi)線性良好。血清中加入已知量的標(biāo)準(zhǔn)毒素蛋白，測得平均回收率為89%。結(jié)論 本方法檢測相思子毒素的可測范圍廣、特異性強(qiáng)、靈敏度高、變異系數(shù)較小，表明其靈敏、特異、可靠。

相思子毒素；雙抗體夾心ELISA；方法學(xué)評價(jià)

相思子毒素(abrin)是存在于豆科植物相思子(Abrus precatorius)種子中的一種毒蛋白，與蓖麻毒素(ricin)同為Ⅱ型核糖體失活蛋白(RIP)家族成員，是迄今為止所發(fā)現(xiàn)的毒性最強(qiáng)的植物毒素之一，毒性是普通化學(xué)武器的幾百倍。相思子毒素已經(jīng)成為一個(gè)成功的天然毒素戰(zhàn)劑[1-2]。

由于相思子毒素天然資源比較豐富，制備比較容易，并且相思子毒素中毒后無特異癥狀，出現(xiàn)癥狀時(shí)已經(jīng)造成機(jī)體嚴(yán)重的器質(zhì)損害，具備生物毒素武器典型特征，因此歷來為外軍所高度重視[3]。在2001年世界生物及毒素武器大會(huì)(BTWC)上，相思子毒素再次被列入重點(diǎn)核查清單。因此，無論是從核查、應(yīng)用治療，還是從防護(hù)目的，開展對相思子毒素的研究具有十分重要的意義[4-5]。

本研究利用相思子毒素的多抗和單抗建立相思子毒素的雙抗夾心ELISA檢測方法，并對檢測方法進(jìn)行了方法學(xué)評價(jià)。本方法對建立相思子毒素檢測試劑盒具有重要的現(xiàn)實(shí)意義與應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料 相思子毒素、相思子毒素單抗和多抗由本實(shí)驗(yàn)室保存，HRP標(biāo)記的羊抗鼠抗體購自北京華美公司。

1.2 檢測過程 ①樣品稀釋：將相思子毒素進(jìn)行如下稀釋，1 μg/mL、100 ng/mL、10 ng/mL、1 ng/mL、100 pg/mL、10 pg/mL、0 g/mL。②包被：加入包被液稀釋的相思子毒素多抗 (1∶1 000稀釋)，100 μL/孔，4℃過夜。甩干包被液，PBST緩沖液洗滌液洗滌3次，3 min/次。③封閉：加入1%BSA封閉液，100 μL/孔，37℃ 60 min，甩干；PBST洗滌液洗滌3次，3 min/次。④加樣：加入相思子毒素蛋白，100 μL/孔，每個(gè)樣品重復(fù)3個(gè)孔，同時(shí)設(shè)陽性對照、陰性樣品和空白對照，37℃60 min甩干液體，洗滌液洗滌3次，3 min/次。⑤加相思子毒素單抗(1∶4 000稀釋)：100 μL/孔。37℃60 min甩干液體，洗滌液洗滌3次，3 min/次。⑥每孔加入100 μL辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG抗體 (1∶5 000)，37℃恒溫0.5 h，洗板3次(同前)，每孔加入100 μL底物溶液顯色15 min，加入2.0 mol/L H2SO4100 μL終止反應(yīng)，于酶標(biāo)儀上讀取450 nm吸收波長處的OD值。⑦結(jié)果判斷：以P(待測樣本OD值)/(陰性樣本OD值)大于2.1判為陽性。

2 結(jié)果

2.1 相思子毒素多抗包被濃度的確定 包被不同濃度相思子毒素多抗的酶標(biāo)板，在相同條件下進(jìn)行間接ELISA實(shí)驗(yàn)，結(jié)果(圖1)。當(dāng)相思子毒素多抗的包被濃度在1.0～50.0 μg/mL范圍時(shí)，OD450值呈上升趨勢；濃度高于50.0 μg/mL時(shí)OD450值趨于飽和，故相思子毒素多抗的最佳包被濃度為50.0 μg/mL。

圖1 相思子毒素多抗包被濃度的確定

2.2 檢測方法的靈敏度和線性范圍的確定 將相思子毒素進(jìn)行梯度稀釋，在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，采用以上雙抗體夾心ELISA法測定相思子毒素。得出雙抗體夾心ELISA法測定相思子毒素的檢出限為1 ng/mL。當(dāng)相思子毒素的濃度在10～100 ng/mL范圍時(shí)，相思子毒素濃度與吸光度之間呈線性關(guān)系，線性回歸方程為y=0.049x+0.407 (即A=0.407C+0.049)，線性相關(guān)系數(shù)r=0.997 6。在此濃度范圍內(nèi)，相思子毒素可進(jìn)行定量分析。

2.3 檢測方法的特異性分析 用優(yōu)化的檢測體系分別檢測相思子毒素、蓖麻毒素和蒴蓮根毒素，以驗(yàn)證該檢測體系的特異性。結(jié)果表明，檢測相思子毒素時(shí)，隨著相思子毒素濃度增加，OD450值呈增加趨勢。而檢測相思子毒素和蒴蓮根毒素時(shí)，OD450值與相思子毒素濃度為零時(shí)的OD450值接近，表明該方法對相思子毒素具有很好的特異性。

2.4 檢測方法的重復(fù)性分析 采用變異系數(shù)表示法，在同一次測定中對3個(gè)濃度水平的樣品分別重復(fù)測定3次計(jì)算批內(nèi)變異系數(shù)。分別測定3個(gè)濃度水平的樣品在3個(gè)不同批次測定之間的變異系數(shù)(批間變異系數(shù))，結(jié)果(表1)。

表1 重復(fù)性測定結(jié)果

2.5 回收率的分析 向血液樣品中分別添加5、10、20 ng/mL的相思子毒素，每個(gè)濃度做3個(gè)平行，同時(shí)做3個(gè)空白對照，測定相思子毒素含量，計(jì)算回收率，結(jié)果(表2)。

表2 回收率測定結(jié)果

3 討論

相思子毒素是從豆科藤本植物相思子(Abrus precatorius)的種子中提取的一種劇毒性高分子蛋白毒素，其含量約占種子2.8%～3.0%。相思子毒素存在4種同族毒素(isoabrins)，即abrin-a、abrin-b、abrin-c、和abrin-d，相對分子質(zhì)量介于63～67 ku之間，它們由不同的基因所編碼，但同屬于一個(gè)多基因家族；其中abrin-b、abrin-c由于其B鏈凝集活性低而只有較弱的細(xì)胞毒性作用；而abrin-a、abrin-d則有極強(qiáng)的細(xì)胞毒性，小鼠的LD50為0.04 μg/kg，成年人攝入的致死劑量為5.0～7.0 μg/kg，其毒性強(qiáng)度是蓖麻毒素(小鼠LD503.0 μg/kg)的70多倍，已被列為潛在的重要毒素戰(zhàn)劑和生物恐怖病原物質(zhì)之一[6-7]。

目前檢測相思子毒素的方法通常有免疫分析法和生物質(zhì)譜法。生物質(zhì)譜法需要使用昂貴的基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜或電噴霧質(zhì)譜，目前普及還較困難。而免疫分析法具有靈敏度高、便于檢測生物樣品等優(yōu)點(diǎn)。其中，酶聯(lián)免疫技術(shù)由于操作簡便、方法快速、儀器相對簡單等優(yōu)點(diǎn)應(yīng)用日益廣泛[8-10]。

本研究利用相思子毒素的單抗和多抗建立了相思子毒素的雙抗夾心ELISA檢測方法，能在幾小時(shí)內(nèi)檢測幾十到上百個(gè)樣品，且不需要復(fù)雜的儀器設(shè)備，樣品預(yù)處理簡單，檢測成本低，檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠，在現(xiàn)場監(jiān)控和基層檢測中有著廣闊的推廣應(yīng)用前景。

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Objective To establish a double antibody sandwich ELISA method for detection of abrin and analyze the methodology. Methods After the optimal coating concentration of polyclonal antibody of abrin was optimized；a double antibody sandwich ELISA method was established.Detection sensitivity，linear range，specificity，repeatability and recovery rate were assayed.Results The minimal detection limit of abrin was 1 ng/mL and the linearity of standard curve was fine in the range of 10 to 100 ng/mL.The average recovery was 89%when the known amounts of standard toxin protein was added into blood samples.Conclusion This method for detection of abrin is sensitive，specific and reliable because of its wide measure range，high sensitivity，good specificity，small coefficient of variability.

Abrin；Double antibody sandwich ELISA；Methodological evaluation

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