鄭 杰， 吳 海 濤， 董 秀 萍,， 張 爽， 張 毛 毛， 朱 蓓 薇,

( 1.江蘇大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院， 江蘇 鎮(zhèn)江 212013;2.大連工業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院， 遼寧 大連 116034 )

0 引 言

海參屬棘皮動(dòng)物門(Echinodermata)海參綱(Holothuroidea)。我國(guó)約有可食用海參20多種[1]，以渤海海域所產(chǎn)的仿刺參(Stichopusjaponicus)為主。海參富含蛋白質(zhì)、黏多糖及海參皂苷等多種生理活性物質(zhì)，具有極高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值[2]。然而，海參具有極強(qiáng)的自溶能力，在外界環(huán)境及化學(xué)因子的刺激下，海參首先發(fā)生“吐腸”，體壁部分會(huì)發(fā)生“溶解”，甚至溶為液態(tài)[3]。這種獨(dú)特的生理現(xiàn)象給海參的保鮮、貯藏、運(yùn)輸和加工帶來(lái)諸多不便，造成極大的營(yíng)養(yǎng)損失。目前，我國(guó)海參年產(chǎn)量已超過9萬(wàn)噸，海參的自溶問題不容忽視。

一直以來(lái)，研究學(xué)者將海參的自溶視為其對(duì)外界刺激所產(chǎn)生的應(yīng)激效應(yīng)，所以從動(dòng)物學(xué)角度分析了海參自身的神經(jīng)傳導(dǎo)及自我修復(fù)能力[4-5]。對(duì)于水產(chǎn)保鮮及加工領(lǐng)域來(lái)講，通過調(diào)控海參自溶，避免不必要的營(yíng)養(yǎng)損失，并提升產(chǎn)品質(zhì)量顯得尤為重要。目前，海參自溶過程的評(píng)價(jià)體系還不完善，尚未建立海參自溶的評(píng)價(jià)指標(biāo)?；诖?，本研究旨在從主要化學(xué)成分變化的角度出發(fā)，從宏觀上分析海參的兩大化學(xué)成分——蛋白質(zhì)和糖分在自溶過程中的變化規(guī)律，以期建立海參自溶的評(píng)價(jià)指標(biāo)，為海參自溶的調(diào)控和機(jī)理研究奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

鮮活海參，購(gòu)于大連長(zhǎng)興水產(chǎn)品市場(chǎng)；牛血清蛋白，F(xiàn)luka(Switzerland)產(chǎn)品；葡萄糖，購(gòu)于天津博迪化工有限公司。試驗(yàn)所用其他試劑均為分析純。

1.2 主要儀器

UV-2100型分光光度計(jì)，UNIC，USA；PHS-3型精密pH計(jì)，上海雷磁儀器廠；Z323K型冷凍離心機(jī)，HERMLE，GERMANY；JJ 200Y型精密電子天平，美國(guó)雙杰兄弟集團(tuán)有限公司；202232S型電熱恒溫干燥箱，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋，江蘇金壇榮華儀器制造有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 自溶海參樣品的制備

鮮活海參殺死后，分別取體壁和腸兩部分，洗凈后勻漿。紫外線(30 W，0.5 m)照射30 min后，取5 g樣品，在不同溫度(4～70 ℃)、pH(2～8)、NaCl質(zhì)量濃度(0～30 mg/mL)和液料比(1～14 mL/g)的條件下，使其自溶4 h，即可分別得到相應(yīng)條件下的自溶樣品。勻漿后未經(jīng)紫外線照射誘導(dǎo)自溶的海參命名為“正常海參”。

1.3.2 TCA可溶性寡肽質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定

自溶過程采用McIIvaine’s緩沖體系。自溶時(shí)間結(jié)束后取樣，加入2倍體積的10%TCA，室溫靜置20 min，13 500 r/min離心10 min，取上清液，采用福林-酚法[6]測(cè)定，并根據(jù)牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算TCA可溶性寡肽的質(zhì)量分?jǐn)?shù)(mg/g)(干基)。

1.3.3 溶出總糖及還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定

自溶過程均采用去離子水體系。自溶完畢后取樣，13 500 r/min離心10 min，取上清液，分別采用苯酚-硫酸法測(cè)定總糖和3,5-二硝基水楊酸法測(cè)定還原糖[7]，并根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算二者的質(zhì)量分?jǐn)?shù)(mg/g)(干基)。

1.3.4 數(shù)據(jù)分析

為了避免海參個(gè)體差異所引起的各成分的組間差別，更好地反映各主要化學(xué)成分的變化情況，在分析海參自溶過程中主要化學(xué)成分的溶出情況時(shí)，以各組正常海參中TCA可溶性寡肽和總糖為1，計(jì)算各自溶樣品主要化學(xué)成分的溶出倍數(shù)。此外，由于還原糖為總糖的一部分，計(jì)算還原糖的溶出倍數(shù)時(shí)以相應(yīng)的正常海參總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為基數(shù)。在分析各因素對(duì)海參主要化學(xué)成分變化的影響時(shí)，以主要化學(xué)成分的相對(duì)溶出率表示，即TCA可溶性寡肽相對(duì)溶出率、總糖相對(duì)溶出率及還原糖相對(duì)溶出率。計(jì)算公式為

化學(xué)成分相對(duì)溶出率=

式中，化學(xué)成分分別指TCA可溶性寡肽、總糖及還原糖。

2 結(jié)果與分析

2.1 海參自溶過程中主要化學(xué)成分的溶出情況

本研究分別考察了紫外線誘導(dǎo)的海參體壁和海參腸在自溶過程中其主要化學(xué)成分的變化情況，目的在于比較二者的不同之處，為海參加工提供必要的理論依據(jù)。由圖1可見，隨著自溶過程的進(jìn)行，與新鮮海參相比，體壁和腸中的TCA可溶性寡肽、總糖及還原糖的溶出量逐漸提高，至4 h時(shí)達(dá)到平臺(tái)期。其中，TCA可溶性寡肽的溶出量分別提高至正常組水平的(2.02±0.16)和(4.16±0.07)倍，總糖的溶出量分別提高了33.3%和36.5%。此外，海參體壁在自溶中溶出還原糖的量極低；而海參腸在自溶中溶出的糖類主要以還原糖為主，且還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)提高了55.2%(4 h)。由此可見，在自溶過程中，海參體壁和腸的蛋白質(zhì)均發(fā)生顯著降解，海參體壁總糖溶出率較高，海參腸內(nèi)多糖降解顯著。因此，在進(jìn)一步研究中，分別考察這些方面的變化情況。

自溶條件：TCA可溶性寡肽：McIIvaine’s緩沖體系，50 ℃、pH 7.0(A)或pH 5.0(B)、25 mg/mL NaCl(A)或0 NaCl(B)及液料比3∶1；溶出總糖和還原糖：去離子水體系，50 ℃(A)或40 ℃(B)、液料比8∶1及0 NaCl

2.2 不同pH下海參自溶過程中主要化學(xué)成分的溶出情況

pH對(duì)海參體壁和腸自溶過程中蛋白質(zhì)的降解、總糖溶出和多糖的降解有顯著的影響(圖2)。海參體壁在不同pH條件下自溶時(shí)，TCA可溶性寡肽和總糖溶出量的變化趨勢(shì)基本一致，均在pH 6.0時(shí)相對(duì)較高。對(duì)于海參腸自溶來(lái)講，在酸性條件下TCA可溶性寡肽溶出量相對(duì)較高，而還原糖的變化趨勢(shì)恰好相反，二者分別于pH 5.0和7.0時(shí)達(dá)到最大值。

2.3 不同溫度下海參自溶過程中主要化學(xué)成分的溶出情況

海參體壁和腸自溶過程中大分子蛋白質(zhì)的降解程度均受溫度變化的影響，且TCA可溶性寡肽溶出量變化趨勢(shì)相似，均在溫度為50 ℃時(shí)達(dá)到最大值(圖3)。同時(shí)，海參腸自溶過程中還原糖的溶出也隨溫度的升高而發(fā)生變化，溫度為40 ℃時(shí)溶出量最大。然而，海參體壁中總糖的溶出基本不受溫度變化的影響。

自溶條件：TCA可溶性寡肽：McIIvaine’s緩沖體系，50 ℃、4 h、25 mg/mL NaCl(A)或0 NaCl(B)及液料比3∶1；溶出總糖和還原糖：去離子水體系， 50 ℃(A)或40 ℃(B)、4 h、液料比8∶1及0 NaCl

自溶條件：TCA可溶性寡肽：McIIvaine’s緩沖體系，pH 6.0(A)或pH 5.0(B)、4 h、25 mg/mL NaCl(A)或0 NaCl(B)及液料比3∶1；溶出總糖和還原糖：去離子水體系，4 h、液料比8∶1及0 NaCl

2.4 不同NaCl質(zhì)量濃度下海參自溶過程中主要化學(xué)成分的溶出情況

NaCl能激活某些蛋白酶，從而促進(jìn)大分子蛋白質(zhì)的降解。蝦肉在自溶過程中TCA可溶性寡肽的質(zhì)量分?jǐn)?shù)受NaCl質(zhì)量濃度的影響，質(zhì)量濃度為25 mg/mL時(shí)，蛋白質(zhì)的降解相比NaCl質(zhì)量濃度為0時(shí)更加明顯[8]。本研究發(fā)現(xiàn)，NaCl對(duì)海參體壁蛋白質(zhì)降解有一定影響，在20 mg/mL時(shí)，TCA可溶性寡肽的溶出量相對(duì)較高，但對(duì)海參腸卻無(wú)影響(圖4)，海水中NaCl約為30 mg/mL，這可能與海參的生長(zhǎng)環(huán)境有關(guān)。NaCl對(duì)自溶過程中體壁總糖的溶出無(wú)明顯影響，但腸還原糖的溶出卻隨NaCl質(zhì)量濃度的不斷增加而逐漸降低。

自溶條件：TCA可溶性寡肽：McIIvaine’s緩沖體系，50 ℃、pH 6.0(A)或pH 5.0(B)、4 h及液料比3∶1；溶出總糖和還原糖：去離子水體系，50 ℃(A)或40 ℃(B)、4 h及液料比8∶1

2.5 不同液料比條件下海參自溶過程中主要化學(xué)成分的溶出情況

隨著液料比的提高，海參體壁TCA可溶性寡肽和海參腸還原糖的溶出率先增大后減小，說明在一定的液料比條件下，體壁蛋白質(zhì)和腸大分子糖類的降解程度最大(圖5)。體壁自溶過程中總糖的溶出不受液料比變化的影響，而腸自溶過程中蛋白質(zhì)的降解程度卻隨著液料比的增大而逐漸減小。說明在利用自溶產(chǎn)業(yè)化開發(fā)海參腸多肽類產(chǎn)品時(shí)，可不必添加過多的溶劑，利用其自身的水分即可。

自溶條件：TCA可溶性寡肽：McIIvaine’s緩沖體系，50 ℃、pH 6.0(A)或pH 5.0(B)、4 h及25 mg/mL NaCl(A)或0 NaCl(B)；溶出總糖和還原糖：去離子水體系，50 ℃(A)或40 ℃(B)、4 h及0 NaCl

3 討 論

一般來(lái)講，水產(chǎn)品的自溶與內(nèi)源酶關(guān)系密切，海參內(nèi)源酶可能也參與到海參的自溶過程中。自溶體系的pH對(duì)內(nèi)源酶和底物的結(jié)構(gòu)、解離狀態(tài)及結(jié)合狀態(tài)都會(huì)產(chǎn)生影響[9]。研究發(fā)現(xiàn)，海參體壁組織蛋白酶B和L的最適反應(yīng)pH分別為5.5和5.0[10-11]；海參腸道β-1,3-葡聚糖酶的最適反應(yīng)pH為5.0～6.0[12-13]，接近海參自溶過程中體壁TCA可溶性寡肽及腸還原糖相對(duì)溶出率達(dá)到最大時(shí)的pH。溫度對(duì)內(nèi)源酶的活力也有重要影響，海參體壁半胱氨酸蛋白酶、組織蛋白酶B和L的最適反應(yīng)溫度均在50 ℃左右[10-11,14]，接近海參自溶過程中體壁TCA可溶性寡肽相對(duì)溶出率達(dá)到最大時(shí)的溫度；而海參腸β-1,3-葡聚糖酶的最適反應(yīng)溫度為40 ℃[12-13]，也接近于自溶過程中海參腸還原糖相對(duì)溶出率達(dá)到最大時(shí)的溫度。此外，自溶過程中海參腸還原糖的溶出隨著NaCl質(zhì)量濃度的不斷增加而逐漸降低，這可能由于NaCl可降低海參腸中可降解多糖的糖苷酶的活性所引起的。另外，海參自溶過程受液料比的影響，是因?yàn)檫m宜的液料比決定著自溶過程中可能起作用內(nèi)源酶的濃度[15]。液料比小，酶分子不能自由移動(dòng)；液料比大，酶濃度小，這兩種條件下，酶均不能與大分子蛋白質(zhì)和碳水化合物充分接觸，從而得不到充分的降解。關(guān)于各種內(nèi)源酶與海參自溶的關(guān)系還有待于進(jìn)一步的系統(tǒng)研究。

4 結(jié) 論

在海參體壁和腸自溶過程中，兩大營(yíng)養(yǎng)成分——蛋白質(zhì)和糖類均發(fā)生不同程度的變化?？偨Y(jié)海參自溶過程中(4 h)主要成分的變化規(guī)律如下：①不論海參體壁還是海參腸，自溶中TCA可溶性寡肽的溶出率均提高，并且受溫度、pH的影響；②海參體壁的自溶過程中，總糖的溶出率增加，但僅受pH的影響；③海參腸的自溶中，還原糖溶出率提高，并且受溫度、pH和NaCl濃度的影響。因此，可以利用TCA可溶性寡肽溶出率作為海參自溶過程的評(píng)價(jià)指標(biāo)，同時(shí)，還可采用還原糖溶出率作為海參腸自溶過程的評(píng)價(jià)指標(biāo)。

綜上所述，在海參加工、貯運(yùn)過程中，要保證海參的鮮活狀態(tài)時(shí)，需要控制自溶，應(yīng)限制在較低的溫度，pH可以控制在偏堿性范圍內(nèi)，而且要盡量避免陽(yáng)光的照射，避免紫外線對(duì)海參體壁和海參腸自溶產(chǎn)生誘導(dǎo)作用。在加工即食海參等制品時(shí)，溫度要超過60 ℃以上，以抑制海參自溶酶活性，進(jìn)而保證產(chǎn)品具有良好的形態(tài)。利用自溶時(shí)，可采用紫外線誘導(dǎo)，溫度應(yīng)控制在37～60 ℃，pH應(yīng)控制在4～7，這常作為多種活性成分開發(fā)的前處理工序，再輔以不同的外源酶可制備海參多肽、海參黏多糖等。利用海參自身內(nèi)源酶系的作用，可大大提高生物活性物質(zhì)的提取率，并節(jié)約生產(chǎn)成本。

[1] 廖玉麟. 我國(guó)的海參[J]. 生物學(xué)通報(bào), 2001, 35(9):1-4.

[2] 楊陽(yáng). 海參的食療價(jià)值[J]. 山東食品科技, 2003(7):18.

[3] ZHU Beiwei, ZHENG Jie, ZHANG Zongshen, et al. Autophagy plays a potential role in the process of sea cucumber body wall “melting” induced by UV irradiation[J]. Wuhan University Journal of Natural Sciences, 2008, 13(2):232-238.

[4] SAN MIGUEL-RUIZ J E, GARCA-ARRARS J E. Common cellular events occur during wound healing and organ regeneration in the sea cucumberHolothuriaglaberrima[J]. BMC Developmental Biology, 2007, 7(1):115.

[5] MURRAY G, GARCIA-ARRARAS J E. Myogenesis during holothurian intestinal regeneration[J]. Cell and Tissue Research, 2004, 318(3):515-524.

[6] LOWRY O H, ROSEBROUGH N J, FARR A L, et al. Protein measurement with the folin phenl reagent[J]. The Journal of Biological Chemistry, 1951, 193(1):265-275.

[7] 張惟杰. 糖復(fù)合物生化研究技術(shù)[M]. 杭州:浙江大學(xué)出版社, 1999:10-12.

[8] EAKPETCH P, BENJAKUL S, VISESSANGUAN W, et al. Autolysis of pacific white shrimp (Litopenaeusvannamei) meat: characterization and the effects of protein additives[J]. Journal of Food Science, 2008, 73(2):S95-S103.

[9] 孔美蘭,吉宏武,章超樺. 羅非魚下腳料自溶條件的初步探討[J]. 湛江海洋大學(xué)學(xué)報(bào), 2005, 25(4):27-31.

[10] 趙露露,董秀萍,于蕾,等. 海參體壁組織蛋白酶B酶學(xué)性質(zhì)的研究[J]. 食品研究與開發(fā), 2008, 29 (8):5-9.

[11] ZHU Beiwei, ZHAO Lulu, SUN Liming, et al. Purification and characterization of a cathepsin L-like enzyme from the body wall of the sea cucumberstichopusjaponicus[J]. Bioscience Biotechnology Biochemistry, 2008, 72(6):1430-1437.

[12] 趙軍崗,董秀萍,朱蓓薇,等. 海參腸道β-1, 3-葡聚糖酶的提取條件及其酶學(xué)性質(zhì)[J]. 大連輕工業(yè)學(xué)院學(xué)報(bào), 2007, 26(4):289-293.

(ZHAO Jun-gang, DONG Xiu-ping, ZHU Bei-wei, et al. Extraction and properties of β-1,3-glucarase from gut of sea cucumber[J]. Journal of Dalian Institute of Light Industry, 2007, 26(4):289-293.)

[13] ZHU Beiwei, ZHAO Jungang, YANG Jingfeng, et al. Purification and partial characterization of a novel β-1, 3-glucanase from the gut of sea cucumber stichopusjaponicus[J]. Process Biochemistry, 2008, 43(10):1102-1106.

[14] QI Hang, DONG Xiuping, CONG Lina, et al. Purification and characterization of a cysteine-like protease from the body wall of the sea cucumberstichopusjaponicus[J]. Fish Physiology and Biochemistry, 2007, 33(2):181-188.

[15] 曹文紅,章超樺,洪鵬志,等. 響應(yīng)面法優(yōu)化南美白對(duì)蝦蝦頭自溶工藝的研究[J]. 中國(guó)食品學(xué)報(bào), 2009, 9(1):158-164.