繆曉平,鄧開(kāi)野

(仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院輕工食品學(xué)院,廣東廣州 510225)

仙人掌中抑菌活性成分的提取與分析

繆曉平,鄧開(kāi)野＊

(仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院輕工食品學(xué)院,廣東廣州 510225)

采用響應(yīng)面分析法得出仙人掌抑菌活性成分的最佳提取工藝條件為:乙醇體積分?jǐn)?shù)76.96%,料液比 1︰29.92,浸提溫度 69.40℃,浸提時(shí)間 5.19 h.對(duì)仙人掌提取物做了抗菌譜的測(cè)定,結(jié)果表明,具有較寬的抗菌譜.仙人掌提取物對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、根霉、青霉和釀酒酵母的M IC分別為 6.25 g/L、3.125 g/L、6.25 g/L、12.5 g/L和 25 g/L.對(duì)仙人掌提取物進(jìn)行穩(wěn)定性測(cè)試,結(jié)果表明仙人掌提取物的抑菌活性具有較好的熱穩(wěn)定性、對(duì)紫外光照射穩(wěn)定,pH4～6范圍內(nèi)抑菌效果穩(wěn)定.

仙人掌;抑菌;提取;響應(yīng)面分析法

0 引言

防腐劑在食品生產(chǎn)加工和儲(chǔ)藏中起著重要的作用,由于合成食品添加劑往往具有一定的毒副作用,尋找天然防腐劑已成為當(dāng)今世界食品添加劑的一大趨勢(shì).仙人掌含有豐富的類黃酮化合物、生物堿、甾類化合物、三萜類化合物及有機(jī)酸等成分[1-2],它們是各種植物中常見(jiàn)的對(duì)食品中腐敗菌及致病菌具有抑制效果的化學(xué)成分,仙人掌將成為食品天然防腐劑的重要來(lái)源之一[3].作者優(yōu)化了仙人掌中抑菌活性成分的提取條件,并對(duì)其進(jìn)行分析,為仙人掌資源在食品天然防腐劑中的開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)和技術(shù)支持.

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

原料與試劑:仙人掌,市售;乙醇、牛肉膏、蛋白胨、瓊脂粉、生理鹽水、蔗糖、葡萄糖、NaCl,廣東環(huán)凱微生物科技有限公司.

供試菌種:金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、根霉、青霉、釀酒酵母,仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院生物工程實(shí)驗(yàn)室提供.

培養(yǎng)基[4]:牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基.

主要儀器:101AS—3電熱鼓風(fēng)干燥器,上海浦東躍欣科學(xué)儀器廠;LRH—150—S恒溫恒濕培養(yǎng)箱,廣東省醫(yī)療器械廠;W201D恒溫水浴鍋,上海申順生物科技有限公司;S W—CJ—1F超凈臺(tái),蘇州凈化設(shè)備廠;YX280A手提式不銹鋼蒸汽消毒器,上海三申醫(yī)療器械有限公司;80—1型離心機(jī),上海手術(shù)器械廠.

1.2 方法

1.2.1 仙人掌抑菌活性成分提取工藝

準(zhǔn)確稱取仙人掌,洗凈切條后置烘箱中烘干,粉碎,然后與乙醇溶液混合,常溫浸提,抽濾,合并濾液減壓蒸餾,除去乙醇,并濃縮,制成 1 g/mL的仙人掌乙醇浸提液.

1.2.2 濾紙片法測(cè)定抑菌圈直徑[5]

無(wú)菌條件下將滅菌的培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中.將培養(yǎng)的供試菌種制成菌懸液,然后注入相應(yīng)的培養(yǎng)皿中,使菌液分布均勻.將浸入提取原液的濾紙片稍晾干后放入培養(yǎng)皿,每皿正三角形放置 3片,與培養(yǎng)基完全接觸.每份樣品平行接種 3個(gè)培養(yǎng)皿.培養(yǎng)箱培養(yǎng),細(xì)菌于 37℃培養(yǎng) 24 h,霉菌于28℃培養(yǎng) 48 h,酵母于 30℃培養(yǎng) 24 h,取出觀察,用游標(biāo)卡尺量取抑菌圈的直徑 (mm),求平均值.

1.2.3 最小抑制濃度M IC的測(cè)定[6]

取若干只滅菌試管,順序編號(hào),以適合供試菌生長(zhǎng)的液體培養(yǎng)基將被測(cè)的仙人掌提取物進(jìn)行一系列對(duì)倍稀釋 ,濃度分別為 100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.56 g/L,同時(shí)設(shè)空白對(duì)照組.各試管加入菌懸液 50μL,培養(yǎng)箱培養(yǎng),細(xì)菌于 37℃培養(yǎng) 24 h,霉菌于 28℃培養(yǎng) 48 h,酵母于 30℃培養(yǎng) 24 h,取出觀察判定結(jié)果,以含藥量低而無(wú)肉眼可見(jiàn)菌生長(zhǎng)的一管含藥量為藥物對(duì)該菌的M IC.

1.2.4 仙人掌提取物穩(wěn)定性試驗(yàn)[7]

1.2.4.1 溫度對(duì)仙人掌提取物抑菌活性的影響

以大腸桿菌為指示菌,將仙人掌提取物分別置于 40℃、60℃、80℃、100℃水浴和 12l℃濕熱條件下,熱處理 30 min,對(duì)照樣置于 30℃,用濾紙片法來(lái)測(cè)定其抑菌圈,試驗(yàn)重復(fù) 3次.

1.2.4.2 pH值對(duì)仙人掌提取物抑菌活性的影響

用不同 pH值的磷酸緩沖溶液分別調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的 pH值為 2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0共 6個(gè)梯度,以大腸桿菌為指示菌,用濾紙片法來(lái)測(cè)定其抑菌圈直徑,試驗(yàn)重復(fù) 3次,同時(shí)以未添加提取物的緩沖液培養(yǎng)基為空白對(duì)照,根據(jù)抑菌圈大小來(lái)判斷提取物的酸堿穩(wěn)定性.

1.2.4.3 UV對(duì)仙人掌提取物抑菌活性的影響

取仙人掌提取液若干份,將其置于紫外燈下分別照射 5 min、10 min、15 min、20 min、25 min、30 min后,原液作為對(duì)照,以大腸桿菌為指示菌,測(cè)定其抑菌效果,重復(fù) 3次.

2 結(jié)果與分析

2.1 響應(yīng)面分析法優(yōu)化仙人掌抑茵活性成分的提取工藝

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,選取乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、提取溫度、提取時(shí)間各因素的最優(yōu)試驗(yàn)范圍,研究按照表1的因素與水平,以抑菌圈直徑(大腸桿菌)為響應(yīng)值,采用響應(yīng)面分析法對(duì)其進(jìn)行優(yōu)化,以確定仙人掌抑茵活性成分最佳提取條件.結(jié)果見(jiàn)表2、表3.

表1 試驗(yàn)因素與水平

表2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表3 回歸方程各項(xiàng)的方差分析

根據(jù)表2試驗(yàn)結(jié)果,由 Design-Expert軟件得出的抑菌圈直徑 (大腸桿菌)是關(guān)于 4因素的二次回歸擬合方程:

抑菌圈直徑 (大腸桿菌)=14.86+0.71A-0.030B+0.11C+0.18D-0.072AB-0.88AC-0.35AD+0.42BC+0.39BD-0.15CD-0.79A2-0.60B2-0.44C2-0.97D2.

根據(jù)方差分析可知,所建立的模型顯著,失擬項(xiàng)不顯著,說(shuō)明該模型與實(shí)際情況擬合很好,可預(yù)測(cè)最佳提取條件.AC、AD、BC、BD、CD之間的交互作用也很顯著,由 F檢驗(yàn)可以得到各因素對(duì)提取條件影響的主次順序是:乙醇體積分?jǐn)?shù) ＞液料比＞浸提時(shí)間 ＞浸提溫度.

根據(jù)所建立的數(shù)學(xué)模型應(yīng)用響應(yīng)面設(shè)計(jì)法優(yōu)化出其最佳提取條件:乙醇體積分?jǐn)?shù) 76.96%,料液比 1︰29.92,浸提溫度 69.40℃,浸提時(shí)間 5.19 h,此時(shí)抑菌圈直徑 (大腸桿菌)為 14.9362 mm.在上述預(yù)測(cè)工藝參數(shù)條件下,取乙醇體積分?jǐn)?shù)77%,液料比 1︰30,浸提溫度 69℃,浸提時(shí)間 5 h,做 3次平行試驗(yàn),實(shí)測(cè)抑菌圈直徑 (大腸桿菌)為 14.91 mm,與預(yù)測(cè)值無(wú)顯著差異.這一結(jié)果證實(shí)試驗(yàn)優(yōu)化的工藝參數(shù)是可行的.

2.2 最佳提取條件下仙人掌提取物抗菌譜研究

最佳提取條件下,仙人掌提取物對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、根霉、青霉、釀酒酵母的抑菌圈直徑見(jiàn)表4,由此可以看出仙人掌提取物對(duì)細(xì)菌、霉菌和釀酒酵母都有很強(qiáng)的抑制效果,其抗菌譜較寬.

表4 仙人掌提取物的抑菌直徑 mm

2.3 最低抑菌濃度(M IC)

仙人掌提取物對(duì)供試菌的M IC測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表5.

表5 仙人掌提取物對(duì)供試菌的M IC的測(cè)定

從表5可以看出,仙人掌提取物對(duì)金黃色葡萄球菌的M IC為 6.25 g/L,對(duì)大腸桿菌的M IC為3.125 g/L,對(duì)根霉的 M IC為 6.25 g/L,對(duì)青霉的M IC為 12.5 g/L,對(duì)釀酒酵母的 M IC為 25 g/L.由此可知,仙人掌對(duì)供試菌有較強(qiáng)的抑制作用.

2.4 仙人掌提取物穩(wěn)定性的研究

2.4.1 溫度對(duì)仙人掌提取物抑菌活性的影響

以大腸桿菌為指示菌,測(cè)定不同溫度下仙人掌提取物的抑菌活性,結(jié)果見(jiàn)圖 1.

圖1 溫度對(duì)仙人掌提取物抑菌活性的影響

由圖 1可以看出,仙人掌提取物經(jīng)不同溫度處理后抑菌活性差別不大,基本保持原有的抑菌活性,即使在 121℃處理 30 min后仍具有較高活性.這表明仙人掌提取物的抑菌活性具有較好的熱穩(wěn)定性.

2.4.2 pH對(duì)仙人掌提取物抑菌活性的影響

以大腸桿菌為指示菌,研究不同 pH對(duì)仙人掌提取物抑菌活性的影響,結(jié)果見(jiàn)圖 2.

圖2 pH對(duì)仙人掌提取物抑菌活性的影響

大腸桿菌在緩沖液對(duì)照組和加入提取物的不同 pH值培養(yǎng)基中生長(zhǎng)幾乎趨勢(shì)相同,仙人掌提取物的抑菌效果受 pH的影響,酸性條件下的抑菌效果較好,在堿性條件下,提取物抑制菌體能力均有所下降,在 pH4～6范圍內(nèi),仙人掌提取物對(duì)菌體的抑制作用較高且穩(wěn)定性很好.2.4.3 UV對(duì)仙人掌提取物抑菌活性的影響

以大腸桿菌為指示菌,研究紫外光照射對(duì)仙人掌提取物抑菌活性的影響,結(jié)果見(jiàn)圖 3.

由圖 3可以看出,隨紫外光照射時(shí)間的增加,仙人掌提取物的抑菌活性有所下降之后,有一定的提高,然后基本維持不變.由此可見(jiàn)仙人掌提取物對(duì)紫外光具有較高的穩(wěn)定性.

3 結(jié)論

采用濾紙片法,以抑菌圈直徑為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn),大腸桿菌為指示菌,優(yōu)化提取工藝.采用響應(yīng)面分析法得出最佳提取工藝條件為:乙醇體積分?jǐn)?shù)76.96%,料液比 1︰29.92,浸提溫度 69.40 ℃,浸提時(shí)間 5.19 h.對(duì)仙人掌提取物做了抗菌譜的測(cè)定,結(jié)果表明它具有較寬的抗菌譜.仙人掌提取物對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、根霉、青霉和釀酒酵母的 M IC分別為 6.25 g/L、3.125 g/L、6.25 g/L、12.5 g/L和 25 g/L.

對(duì)仙人掌提取物進(jìn)行穩(wěn)定性測(cè)試,結(jié)果表明仙人掌提取物的抑菌活性具有較好的熱穩(wěn)定性、對(duì)紫外光照射穩(wěn)定,pH4～6范圍內(nèi)抑菌效果穩(wěn)定.

[1] 彭百承,李萍.仙人掌研究概況[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥,1999,10(2):149-150.

[2] 董穎蘋(píng),黃瓊,黃先群,等.藥用植物仙人掌的研究進(jìn)展 [J].貴州農(nóng)業(yè)科學(xué),2001,29(2):63-65.

[3] 王釗,林琳,鮑世銓.我國(guó)海南仙人掌的成分分析及開(kāi)發(fā)前景[J].天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā),2000,13(1):44-48.

[4] 黃秀梨.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo) [M].北京:高等教育出版社,1994.

[5] 姚淑敏.蘆薈提取物抑菌作用的研究[J].食品科學(xué),2002,23(4):137-139.

[6] 郭志堅(jiān),郭書(shū)好,何康明.黃柏葉中黃酮醇甙含量測(cè)定及其抑菌實(shí)驗(yàn)[J].暨南大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2002,23(5):64-66.

[7] 吳傳茂,吳周和,曾瑩,等.從植物中提取天然防腐劑的研究 [J].食品科學(xué),2000,30(5):24-27.

EXTRACTION AND ANALYSIS OF ANTIBACTER IAL ACTIVE COMPONENTS OFOPUNTIA FICUS-IND ICA

M IAO Xiao-ping,DENG Kai-ye
(College of L ight Industry and Food Technology,Zhongkai University of Agriculture and Engineering,Guangzhou510225,China)

The paper studied the optimal extraction conditions of antibacterial active components ofOpuntia ficus-indicaby response surface analysis,and deter mined the antibacterial spectra of the extract.The results showed that the optimal extraction conditions were as follows:ethanol volume fraction 76.96%,solid-liquid ratio 1︰ 29.92,extraction temperature 69.40℃,and extraction time 5.19 hours;and the extract had wide antibacterial spectra.TheM ICs of theOpuntia ficus-indicaextract againstStaphylococcus aureus,Escherichia coli,Rhizopus,PenicillumandSaccharom ycetewere 6.25 g/L,3.125 g/L,6.25 g/L,12.5 g/L and 25 g/L,respectively.The results of the stability test of theOpuntia ficus-indicaextract showed that theOpuntia ficus-indicaextract had better thermal stability,UV irradiation stability,and stable antibacterial effect in the pH range of 4 to 6.

Opuntia ficus-indica;antibacterial;extraction;response surface analysis

TS201.2

B

1673-2383(2010)06-0058-04

2010-06-10

繆曉平 (1985-),男,廣東汕尾人,碩士研究生,研究方向?yàn)榘l(fā)酵工程.

＊通信作者