徐冰，姜岷，馬江鋒，劉樹文，侯顧偉，隋姍姍

南京工業(yè)大學生物與制藥工程學院 材料化學工程國家重點實驗室，南京 210009

工業(yè)生物技術(shù)

循環(huán)利用重組大腸桿菌細胞轉(zhuǎn)化合成丁二酸

徐冰，姜岷，馬江鋒，劉樹文，侯顧偉，隋姍姍

南京工業(yè)大學生物與制藥工程學院 材料化學工程國家重點實驗室，南京 210009

研究了回收丁二酸發(fā)酵液中的大腸桿菌進行細胞轉(zhuǎn)化的可行性，以轉(zhuǎn)化率和生產(chǎn)效率為指標，考察了不同菌體濃度、底物濃度、pH調(diào)節(jié)劑對細胞轉(zhuǎn)化的影響。發(fā)酵結(jié)果表明大腸桿菌可以在僅含有葡萄糖和pH調(diào)節(jié)劑的水環(huán)境中轉(zhuǎn)化生產(chǎn)丁二酸，并確定了最佳的轉(zhuǎn)化條件為：細胞濃度 (OD600)50，底物濃度 40 g/L，緩沖鹽為MgCO3?；趦?yōu)化好的條件，在7 L發(fā)酵罐中進行重復批次轉(zhuǎn)化，第1次轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化率和生產(chǎn)效率分別達到91%和3.22 g/(L·h)，第2次轉(zhuǎn)化的生產(chǎn)效率和轉(zhuǎn)化率達到了86%和2.04 g/(L·h)，第3次轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化率和生產(chǎn)效率分別達到了83%和1.82 g/(L·h)。關(guān)鍵詞: 丁二酸，重復批次轉(zhuǎn)化，大腸桿菌，兩階段發(fā)酵

Abstract:The possibility of reusingEscherichia colicells from the broth for succinic acid production was investigated.Using succinic acid yield and productivity as criterion, we investigated the effects of cell concentration, initial glucose concentration, different neutralizers on the bioconversion. The results revealed thatE. colicould convert glucose to succinic acid in a water solution of glucose and a neutralizer. According to the results, the optimal condition was as follows:the cell concentration was 50 (OD600), glucose concentration was 40 g/L and neutralizer was MgCO3. Under the optimum conditions, we carried out the consecutive batch bioconversion in 7 L fermenter. Succinic acid yield reached 91% with the productivity of 3.22 g/(L·h) for the first conversion. For the second conversion, succinic acid yield reached 86% with productivity of 2.04 g/(L·h). Furthermore, we achieved a high mass yield above 83% with the productivity of 1.82 g/(L·h) for the third bioconversion.

Keywords:succinic acid, consecutive batch bioconversion,Escherichia coli, two-stage fermentation

丁二酸，俗稱琥珀酸，是三羧酸循環(huán)的中間代謝產(chǎn)物，廣泛存在于動物、植物及微生物中。作為一種重要的 C4平臺化合物，丁二酸廣泛應用于化工、醫(yī)藥、食品等行業(yè)[1]。利用生物轉(zhuǎn)化可再生資源生產(chǎn)丁二酸，以其原料來源廣泛、污染小、環(huán)境友好、且在發(fā)酵過程中固定二氧化碳等優(yōu)點，近年來成為國內(nèi)外關(guān)注的熱點[2]。

丁二酸的生產(chǎn)菌株有很多，主要有產(chǎn)琥珀酸放線桿菌Actinobacillus succinogenes、產(chǎn)琥珀酸曼式桿 菌 MBEL55EMannheimia succiniciproducensMBEL55E以及產(chǎn)琥珀酸厭氧螺桿菌Anaerobiospilillum succiniciproducens[3]。大腸桿菌由于遺傳背景清楚、易操作、培養(yǎng)基要求簡單和生長迅速等優(yōu)點，近年來被廣泛用于研究獲得產(chǎn)丁二酸的優(yōu)秀菌株[4]。大腸桿菌AFP111是NZN111的自發(fā)突變株，可以進行兩階段發(fā)酵，即在有氧階段生長菌體，厭氧階段發(fā)酵并積累高濃度丁二酸[5-6]。Vemuri等[6]通過優(yōu)化有氧階段的時間，獲得最終丁二酸產(chǎn)量和生產(chǎn)強度分別是99.2 g/L和1.3 g/(L·h)。姜岷等[7]通過控制有氧階段較低的糖濃度，獲得最終丁二酸產(chǎn)量和生產(chǎn)效率為101.2 g/L和1.89 g/(L·h)。重復批次發(fā)酵，即在發(fā)酵結(jié)束后回收發(fā)酵液中的細胞，轉(zhuǎn)入新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)發(fā)酵，進行重復批次生產(chǎn)。重復批次發(fā)酵可以延長菌體的發(fā)酵時間，提高產(chǎn)物的總產(chǎn)量，達到細胞重復利用的效果。重復批次發(fā)酵在乙醇生產(chǎn)過程中應用較多，如李凡等[8]利用自絮凝酵母重復批次發(fā)酵乙醇，獲得了連續(xù)生產(chǎn)高濃度乙醇的工藝。大腸桿菌發(fā)酵丁二酸后期，由于產(chǎn)物抑制作用，產(chǎn)物增加不再明顯，但是細胞仍具有較高發(fā)酵能力。因此，回收細胞，進行重復批次發(fā)酵具有重要意義。

本文根據(jù)丁二酸發(fā)酵液的主要特點，回收發(fā)酵液中菌體，進行了重復批次發(fā)酵。每批次發(fā)酵采用細胞轉(zhuǎn)化的方法，即將回收的細胞懸浮無菌水中，僅補加葡萄糖和碳酸鎂，然后進行厭氧發(fā)酵，并考察了細胞濃度、初始葡萄糖濃度、pH調(diào)節(jié)劑對細胞轉(zhuǎn)化的影響。相比于兩階段發(fā)酵，細胞轉(zhuǎn)化節(jié)約了氮源和細胞生長期的能量消耗。重復批次轉(zhuǎn)化循環(huán)利用菌體，延長丁二酸發(fā)酵時間，提高丁二酸總產(chǎn)量，有利于丁二酸的工業(yè)化生產(chǎn)。

1 材料與方法

1.1 菌株

AFP111 [F+ λ-rpoS396(Am)rph-1△(pflAB::Cam)

ldhA::Kan 95ptsG]， 由 David P. Clark 教 授(Southern Illinois University) 惠贈。

1.2 培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件

1.2.1種子培養(yǎng)基

蛋白胨 10 g/L，酵母膏5 g/L，NaCl 5 g/L，pH 7.0，121℃滅菌 15 min；卡那霉素 30 mg/L，氯霉素30 mg/L，過濾除菌后加入。

1.2.2發(fā)酵培養(yǎng)基

檸檬酸 3 g/L，Na2HPO4·7H2O 3 g/L，KH2PO48 g/L，KH2PO48 g/L，NH4Cl 0.2 g/L，(NH4)2HPO40.75 g/L，MgSO4·7H2O 1 g/L，CaCl2·2H2O 10.0 mg/L，ZnSO4·7H2O 0.5 mg/L， CuCl2·2H2O 0.25 mg/L ，MnSO4·H2O 2.5 mg/L，CoCl2·6H2O 1.75 mg/L，H3BO30.12 mg/L，Al2(SO4)31.77 mg/L，Na2MoO4·2H2O 0.5 mg/L，檸檬酸鐵 16.1 mg/L，121℃滅菌15 min；維生素 B120 mg/L，生物素 2 mg/L，卡那霉素30 mg/L，氯霉素 30 mg/L，過濾除菌后加入。

1.2.3轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基

轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基的主體是無菌水，流加葡萄糖作為碳源，并補加MgCO3、Na2CO3、NaHCO3或者CaCO3中的一種調(diào)節(jié)pH。

1.3 方法

1.3.1種子培養(yǎng)

將保存于?80℃冰箱的菌種以1%的接種量接至250 mL三角瓶裝液量為30 mL的好氧培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min過夜培養(yǎng)作為一級種子。將一級種子以1%的接種量再次轉(zhuǎn)接至30 mL好氧培養(yǎng)基中37℃、200 r/min培養(yǎng)5～6 h作為二級種子。

1.3.2兩階段發(fā)酵

兩階段發(fā)酵的培養(yǎng)基采用發(fā)酵培養(yǎng)基，在 7 L發(fā)酵罐 (BioFlo 110 fermenter；New Brunswick ScientificCo.，Edison，N.J.) 中進行，裝液量3 L，接種量 5%，溫度 37℃。有氧階段控制葡萄糖初始濃度20 g/L，當菌體濃度達到20 (OD600)，此時發(fā)酵液中葡萄糖濃度為零，流加800 g/L葡萄糖，控制菌體的相對生長速率為 0.7/h，直到菌體濃度達到 30(OD600)，10 mol/L NaOH調(diào)至pH 6.8；厭氧階段通無菌CO2，通氣量0.5 L/min，并且加入間歇性添加MgCO3調(diào)至pH 6.4～6.8之間，采用分批補糖方式，控制初始糖為40 g/L，當葡萄糖濃度低于10 g/L，補加至40 g/L。

1.3.3細胞回收

兩階段發(fā)酵結(jié)束，收集發(fā)酵液，離心獲得細胞(5 000 r/min，10 min，4℃)，用雙蒸水懸浮后轉(zhuǎn)入發(fā)酵罐進行轉(zhuǎn)化實驗。

1.3.4細胞轉(zhuǎn)化

在 7 L發(fā)酵罐 (BioFlo 110 fermenter；New Brunswick ScientificCo.，Edison，N.J.) 中細胞懸浮液，并補加無菌水至總體積為3 L，溫度37℃，轉(zhuǎn)速200 r/min，通無菌CO2，通氣量0.5 L/min，碳酸鎂調(diào)至pH 6.4～6.8之間。采用分批補糖方式，控制初始糖濃度為40 g/L，當葡萄糖濃度低于10 g/L，補加至40 g/L。

1.3.5分析方法

葡萄糖的測定：生物傳感分析儀 (SBA240C，山東省科學院生物研究所)。

菌體密度的測定：紫外可見分光光度計(Spectrumlab 752S) 于600 nm處測定吸光值 (OD600)。

發(fā)酵液中有機酸的測定：高效液相(Ultimate3000，Dionex，America；Alltech 反相 Prevail有機酸色譜柱；流動相：25 mmol/L KH2PO4；pH 2.5；流動相流速：1 mL/min；紫外檢測波長：215 nm；進樣量 20 μL；柱溫為 25℃)。

1.3.6酶活測定

磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶 (PCK) 酶活測定條件及反應體系見文獻[9]。

2 結(jié)果

2.1 細胞轉(zhuǎn)化的可行性

考察菌體細胞在轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中的發(fā)酵能力，對細胞轉(zhuǎn)化和厭氧發(fā)酵的結(jié)果進行比較。有氧階段結(jié)束后，取出一部分發(fā)酵液，離心回收菌體，并進行細胞轉(zhuǎn)化，剩余發(fā)酵液進行厭氧發(fā)酵。葡萄糖的消耗速率小于0.5 g/(L·h) 時，終止轉(zhuǎn)化和發(fā)酵，主要數(shù)據(jù)見表1。

表1 兩階段發(fā)酵和細胞轉(zhuǎn)化產(chǎn)酸比較Table 1 Production of succinic acid by dual-phase fermentation and bioconversiona

從表1中可知，回收的細胞可以在轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中細胞轉(zhuǎn)化生產(chǎn)丁二酸。雖然最終丁二酸的濃度降低，但是收率和生產(chǎn)強度與厭氧發(fā)酵相當。表明細胞在簡單的水環(huán)境中仍然能保持細胞活性及胞內(nèi)丁二酸合成相關(guān)酶的活力。

2.2 葡萄糖濃度對全細胞轉(zhuǎn)化的影響

轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中分別添加20、32、40、52、68、87 g/L葡萄糖，轉(zhuǎn)化結(jié)束后測定丁二酸產(chǎn)量、乙酸產(chǎn)量及丁二酸轉(zhuǎn)化率的變化，結(jié)果見圖1。

由圖1可知，隨著葡萄糖濃度的提高，丁二酸的終濃度也增加，但轉(zhuǎn)化率下降。當葡萄糖的濃度高于52 g/L，丁二酸產(chǎn)量增加不再明顯，且轉(zhuǎn)化率下降明顯，乙酸積累增加。因此，控制葡萄糖的濃度低于 52 g/L，有利于提高細胞轉(zhuǎn)化的效率和保持細胞的活性。

圖1 不同初糖濃度對細胞轉(zhuǎn)化的影響Fig.1 Effects of initial glucose concentration on production of succinic acid bioconversion using in sealed serum bottle.

2.3 菌體濃度對細胞轉(zhuǎn)化的影響

控制轉(zhuǎn)化過程中細胞濃度 (OD600) 在19、38、55、70、86，轉(zhuǎn)化結(jié)束后測定丁二酸轉(zhuǎn)化率及生產(chǎn)效率，結(jié)果如圖2所示。

由圖2可知，隨著轉(zhuǎn)化體系中細胞濃度的增加，丁二酸的生產(chǎn)強度增加，但是產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率不斷降低。當細胞濃度 (OD600) 大于55時，產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率降低明顯，且乙酸產(chǎn)量增加。因此，控制細胞濃度 (OD600)在50左右，既有利于提高丁二酸生產(chǎn)效率，又保持了較高的轉(zhuǎn)化率。

圖2 不同細胞濃度對細胞轉(zhuǎn)化的影響Fig.2 Effects of initial cell concentration on production of succinic acid by bioconversion in sealed serum bottle.

2.4 不同緩沖鹽對轉(zhuǎn)化的影響

細胞轉(zhuǎn)化過程中，加入 Na2CO3、NaHCO3、MgCO3、CaCO3調(diào)節(jié)pH，控制初糖濃度在20 g/L，結(jié)果見表2。

由表2可以看出，MgCO3作為pH調(diào)節(jié)劑時，丁二酸的生產(chǎn)強度和收率最大。Na2CO3和NaHCO3效果相近，但由于1分子Na2CO3可以和2分子H+反應，其用量較NaHCO3少。使用CaCO3時，細胞利用葡萄糖的能力大幅下降，有大量殘?zhí)恰?/p>

表2 不同緩沖鹽對全細胞轉(zhuǎn)化的影響Table 2 Influence of the neutralizers on whole-cell bioconversion

2.5 發(fā)酵罐中試驗

基于優(yōu)化好的轉(zhuǎn)化條件，在7 L發(fā)酵罐中試驗，考察轉(zhuǎn)化次數(shù)對結(jié)果的影響。當葡萄糖的消耗速率小于0.5 g/(L·h)，停止轉(zhuǎn)化，回收細胞進行下一次轉(zhuǎn)化?？紤]到細胞濃度降低的影響，重復進行 3次轉(zhuǎn)化，結(jié)果如圖3。

圖3 發(fā)酵罐中轉(zhuǎn)化次數(shù)對轉(zhuǎn)化的影響Fig.3 Time course of cell apoptosish and production of organic acids with in a stirred bioreactor by whole-cell conversion.

由圖3可以看出，第1次轉(zhuǎn)化，丁二酸的生產(chǎn)效率和轉(zhuǎn)化率分別達到3.22 g/(L·h)和91%，丁二酸最終濃度達到67.7 g/L，細胞濃度略有降低。第2次轉(zhuǎn)化，丁二酸生產(chǎn)效率和轉(zhuǎn)化率分別是 2.04 g/(L·h)和86%，最終的丁二酸濃度達到45.6 g/L，發(fā)酵液中殘存20 g/L的葡萄糖，但是細胞濃度 (OD600) 降低明顯。第 3次轉(zhuǎn)化，丁二酸的生產(chǎn)效率和轉(zhuǎn)化率持續(xù)降低，分別是1.82 g/(L·h) 和83%，丁二酸最終濃度為36 g/L。由于細胞濃度 (OD600) 降到了25，因此終止轉(zhuǎn)化。

2.6 酶活測定

從7 L發(fā)酵罐中試驗可以看出，隨著重復轉(zhuǎn)化次數(shù)的增加，菌體的發(fā)酵能力逐漸降低。為了考察菌體發(fā)酵能力降低的原因，在厭氧階段和每次轉(zhuǎn)化初期，分離發(fā)酵液中的細胞，測定丁二酸代謝途徑中主要酶PCK的活性。

酶活測定的結(jié)果顯示，厭氧發(fā)酵初期PCK的活性為1.96 U/mg，第1次和第2次轉(zhuǎn)化初期PCK的活性分別為1.24 U/mg和0.75 U/mg，最后1次轉(zhuǎn)化初期PCK的活性為0.42 U/mg，呈逐漸下降的趨勢。

3 討論

本實驗首先考察了細胞轉(zhuǎn)化發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的可行性，結(jié)果表明回收的細胞可以在簡單的水環(huán)境中轉(zhuǎn)化葡萄糖合成丁二酸，表明細胞能夠維持整個丁二酸生產(chǎn)途徑相關(guān)酶的活性。相比于兩階段發(fā)酵，離心細胞進行細胞轉(zhuǎn)化，其丁二酸生產(chǎn)效率都有所下降。原因可能是離心過程中對細胞產(chǎn)生了一定的破壞，以及外部環(huán)境的改變導致其發(fā)酵能力降低。

通過對葡萄糖初始濃度的考察，表明隨著葡萄糖初始濃度的增加，丁二酸的轉(zhuǎn)化率降低，乙酸的產(chǎn)率增加。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能是高濃度葡萄糖會產(chǎn)生高滲透壓，葡萄糖利用酶系活性降低[10]，代謝途徑中的關(guān)鍵酶受到抑制使代謝途徑改變生成其他物質(zhì)[11-12]，比如乙酸。高濃度的細胞可以產(chǎn)生較高的生產(chǎn)效率，但是會加速細胞衰亡，導致細胞發(fā)酵能力降低[13]。另外高濃度的細胞需要大量的能量來維持細胞的活性，更多的碳源轉(zhuǎn)向能量合成的相關(guān)途徑，比如從丙酮酸到乙酸途徑，因而乙酸的產(chǎn)量增加。

影響轉(zhuǎn)化的另外一個重要因素是 pH調(diào)節(jié)劑的種類。本文考察了轉(zhuǎn)化過程中幾種不同緩沖鹽的效果，結(jié)果表明 MgCO3的效果最好。因為 Mg可以和丁二酸結(jié)合生成絡(luò)合物，減小了丁二酸的濃度，進而減小了細胞內(nèi)外的滲透壓和產(chǎn)物抑制作用[14]。另外丁二酸的合成需要固定大量的二氧化碳，而MgCO3分解生成的二氧化碳可以增加發(fā)酵液中二氧化碳的溶解度，有助于丁二酸的合成。

在重復轉(zhuǎn)化過程中，隨著轉(zhuǎn)化次數(shù)的增加，丁二酸的最終濃度、生產(chǎn)效率和轉(zhuǎn)化率逐漸降低。細胞濃度減小是導致生產(chǎn)效率降低的主要原因之一；重復的離心對細胞造成傷害，也會降低其發(fā)酵能力；另外，丁二酸合成途徑中的關(guān)鍵酶是在有氧階段誘導的，在長期的厭氧環(huán)境中逐漸失去部分活性。酶活測定結(jié)果顯示，在厭氧發(fā)酵初期，PCK的活性較高，但隨著轉(zhuǎn)化次數(shù)的增加，其活性逐漸減低。

本文主要研究了在僅含有葡萄糖和 MgCO3的培養(yǎng)基中，利用發(fā)酵液中回收細胞轉(zhuǎn)化葡萄糖生產(chǎn)丁二酸，并進行了重復批次轉(zhuǎn)化。重復批次轉(zhuǎn)化策略延長了厭氧發(fā)酵時間，增加了產(chǎn)物的總產(chǎn)量，提高了總的生產(chǎn)效率。

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Reuse of recombinantEscherichia colito produce succinic acid by bioconversion

Bing Xu, Min Jiang, Jiangfeng Ma, Shuwen Liu, Guwei Hou, and Shanshan Sui

State Key Laboratory of Materials-Oriented Chemical Engineering,College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering,Nanjing University of Technology,Nanjing210009,China

Received:March 11, 2010;Accepted:July 19, 2010

Supported by:National Basic Research and Development Program of China (973 Program) (No. 2011CB707405), National Natural Science Foundation of China (No. 21076105), State Key Laboratory of Materials-Oriented Chemical Engineering, “Qinglan Project” of Jiangsu Province, “The Six Talent Summit” of Jiangsu Province (No. 06-A-047).

Corresponding author:Min Jiang. Tel: +86-25-83172078; Fax: +86-25-83172075; E-mail: jiangmin@njut.edu.cn

國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃 (973計劃) (No. 2011CB707405)，國家自然科學基金項目 (No. 21076105)，材料化學工程國家重點實驗室基金，江蘇省“青藍工程”，江蘇省“六大人才高峰”(No. 06-A-047) 資助。