吳發(fā)明，李敏，俸世洪，王兵，齊景梁

（成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥材標(biāo)準化教育部重點實驗室，四川 成都 611137）

不同產(chǎn)地火麻仁的蛋白電泳分析

吳發(fā)明，李敏*，俸世洪，王兵，齊景梁

（成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥材標(biāo)準化教育部重點實驗室，四川 成都 611137）

目的：鑒定不同產(chǎn)地火麻仁，并探討火麻仁的遺傳多樣性。方法：利用SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)，對不同外觀性狀的火麻仁進行蛋白電泳聚類分析。結(jié)果：火麻仁蛋白電泳圖譜表現(xiàn)出可觀察到的譜帶18條，其中7條較明顯的譜帶為共有譜帶，另外11條譜帶具有多態(tài)性，反映了火麻仁的遺傳多樣性。結(jié)論：火麻仁蛋白穩(wěn)定且具有豐富的遺傳多樣性，實驗結(jié)果可為準確鑒定藥用火麻仁提供輔助依據(jù)。

大麻；火麻仁；SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳

火麻仁為?？浦参锎舐镃annabis sativaL.的干燥成熟果實，為傳統(tǒng)的常用中藥，具潤腸通便功能，用于血虛津虧，腸燥便秘［1］。火麻仁也是重要的油料作物，其原植物的干皮在紡織原料中占有舉足輕重的地位［2］。全國各地根據(jù)油用、麻用等各種用途將其分為幾大類，不同地區(qū)用途不同，所選用的品種也不同，結(jié)果出現(xiàn)了其種質(zhì)復(fù)雜、品種眾多、產(chǎn)地混亂的現(xiàn)象［3］。

蛋白質(zhì)作為基因的直接穩(wěn)定產(chǎn)物，能反映生物DNA組成上的差異。種子蛋白是植物體中有高強度基因表達的一類，且能在種子內(nèi)積累大量而不降解的蛋白質(zhì)，其電泳譜帶具有高度穩(wěn)定性、專一性和疊加性。種子蛋白作為遺傳標(biāo)記常被用于種屬間關(guān)系、種下遺傳多樣性分析、品種鑒定及植物繁育系統(tǒng)的鑒別［3］。本實驗采用SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳方法，對全國不同產(chǎn)地、外觀性狀不同的火麻仁進行了蛋白電泳分析研究，為準確鑒定火麻仁藥材提供理論依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 材料

火麻仁20個樣品均于2008年收自全國不同產(chǎn)地。樣品來源見表1，均由成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥鑒定教研室李敏教授鑒定為?？浦参锎舐镃annabis sativaL.的干燥成熟果實。

四甲基乙二胺（TEMED）、甲醇、冰醋酸、重蒸水、鹽酸、甘油等；丙烯酰胺（Acr）、甘氨酸、過硫酸銨（AP）、α-巰基乙醇、N，N′-甲叉雙丙烯酰胺（Bis）、十二烷基磺酸鈉（SDS）、Tris堿、考馬斯亮藍R250。

表1 火麻仁樣品來源

1.2 儀器

DDY-6B型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀、30-B型電泳槽、離心機、電子天平、離心管、水浴鍋、移液槍、搖床等。

2 方法

2.1 供試品溶液的制備

取火麻仁樣品0.1g，去除果皮，加4倍稀釋濃縮膠緩沖液，研磨勻漿，靜置過夜，采用10 000r·min－1離心5min，取上清液，然后加入同等體積的樣品處理液，沸水浴3min，再以8 000r·min－1離心5min，4℃保存?zhèn)溆茫?，5］。

2.2 電泳

采用SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳法，分離膠10%，濃縮膠5%，垂直平板電泳，加樣量為25μL。電極緩沖液為Tris-Cly（pH 8.3）系統(tǒng)，起始電壓75V，在指示劑進入分離膠后改為150V，恒壓電泳，待指示劑至膠板下沿1cm左右停止電泳［5］。

2.3 染色、脫色

將取出的膠板浸泡在固定液中15min，以固定蛋白組分。倒去固定液，用重蒸水漂洗膠板，加入適量的考馬斯亮藍染色液染色40min（或搖床15min）即可，直至譜帶清晰出現(xiàn)。倒去染色液，用重蒸水漂洗多次，加入少量的脫色液脫色，不斷替換脫色液，連續(xù)多次脫色直至譜帶背景清晰。完全脫色則需要振蕩過夜［5］。

2.4 分析

電泳圖譜見圖1。根據(jù)電泳結(jié)果計算出每個品種各譜帶的Rf值，用0、1表示電泳譜帶的有無，在相同值位置上有蛋白質(zhì)譜帶的記為1，無帶記為0，結(jié)果見表2。采用NTSYS2.1統(tǒng)計分析軟件進行聚類分析，獲得聚類分析圖，見圖2。

表2 火麻仁樣品SDS-PAGE蛋白條帶的Rf值

圖1 火麻仁蛋白電泳圖譜

圖2 火麻仁蛋白電泳圖譜聚類圖

3 結(jié)果

火麻仁的蛋白電泳圖譜共表現(xiàn)出較為明顯的譜帶18條，其中7條最為明顯的譜帶為共有譜帶，體現(xiàn)火麻仁原植物種內(nèi)的一致性；另外的11條譜帶各樣品在有無和顏色深淺度上表現(xiàn)出明顯的多態(tài)性，反映了不同產(chǎn)地火麻仁水溶性蛋白質(zhì)的種類和含量存在差異。

從聚類結(jié)果可以看出，地域上比較接近的火麻仁在遺傳性狀上基本相近，如第一類1和10號兩個樣品都產(chǎn)自四川；第二類中3、9、11號樣品都產(chǎn)自甘肅，8和15號樣品均產(chǎn)自山西，6號樣品產(chǎn)自陜西，均為北方產(chǎn)樣品，除此之外，其他樣品均產(chǎn)自西南地區(qū)的四川、貴州、云南三??；第三大類16號樣品比較特殊，單獨為一類；第四類17、18、19號樣品均產(chǎn)自甘肅西北地區(qū)。

4 討論

火麻仁藥材的蛋白質(zhì)種類是穩(wěn)定的。這可能與植物在長期的生育中是靠種子來保持植物的遺傳特性相關(guān)。利用蛋白質(zhì)種類和含量的不同，鑒別果實及種子類藥材，在理論上是有根據(jù)的。

目前對火麻仁的比較研究基本還停留在表現(xiàn)型水平，雖然外觀形狀是遺傳主要標(biāo)記之一，但它無法明確各火麻仁的遺傳關(guān)系?；鹇槿实鞍纂娪窘Y(jié)果既反映了火麻仁原植物種內(nèi)的一致性，也反映了不同產(chǎn)地火麻仁之間存在著的遺傳多樣性?？梢娡ㄟ^長期的地域性人工選育馴化、栽培，使得火麻仁的外觀性狀和內(nèi)在基因都在各地域內(nèi)發(fā)生了較大的變化，各基因控制的優(yōu)良性狀在不同產(chǎn)地形成了不同表型，突顯了植物體內(nèi)在基因和外在性狀之間的關(guān)系和環(huán)境因素對基因和外觀性狀的影響，同時也反映了長期的引種栽培造成了大麻品種的嚴重混亂，蛋白電泳從內(nèi)在基因上對各產(chǎn)地大麻的親緣關(guān)系進行分類，具有科學(xué)性、客觀性。本實驗以外觀性狀為基礎(chǔ)，從分子水平上為藥用火麻仁品種鑒定和育種提供基礎(chǔ)理論依據(jù)。

［1］國家藥典委員會.中國藥典（一部）［S］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：74.

［2］趙銘森，康紅梅.關(guān)于發(fā)展大麻產(chǎn)業(yè)的研究［J］.安徽農(nóng)學(xué)通報，2007，13（10）：128-129.

［3］張濤.我國大麻種植利用情況分析［J］.云南警官學(xué)院學(xué)報，2008，4（69）：38-40.

［4］孫稚穎，周鳳琴，郭慶梅.山東產(chǎn)不同農(nóng)家品種瓜蔞的種子蛋白電泳分析［J］.時珍國醫(yī)國藥，2005，16（12）：1224-1225.

［5］汪家政，范明.蛋白技術(shù)手冊［M］.北京：科學(xué)出版社，2000：77-100.

Analysis of Cannabis Semen Properties and Protein Electrophoresis from Its Different Habitats

Wu Faming，Li Min，F(xiàn)eng Shihong，WangBing，Qi Jingliang
（College of pharmacy，Chengdu University of TCM，The Ministry of Education Key Laboratory of Standardization of Chinese crude drug，Chengdu Sichuan611137，China）

Objective：To Identify the species and affinities of cannabis semen from different habitats，and investigate the relationships between heredity diversity and apparent property.Methods：Apply the SDS-polyacrylamide electrophoresis technology for the first time to take protein electrophoresis cluster analysis on the cannabis semen varied from apparent property.ResultsEighteen obvious spectral bands could be observed in the cannabis semen protein electrophoretogram，among which seven obvious and shared bands manifest inter-species consistency in cannabis semen.And the other eleven bands manifest the genetic polymorphism of cannabis semen.ConclusionProtein of cannabis semen is stable and it has heredity diversity in abundance.The experimental result can provide theoretical support for the identification of medicinalCannabis sativaL..

Cannabis sativaL.；Cannabis semen；SDS-polyacrylamide electrophoresis

*李敏，E-mail：028limin＠163.com

2010-02-28）