任國發(fā), 于志強, 孫延楓, 馬盛韜, 羅湘凡,盛國英, 傅家謨

(1.上海大學環(huán)境與化學工程學院環(huán)境污染與健康研究所,上海 200444;2.中國科學院廣州地球化學研究所有機地球化學國家重點實驗室廣東省環(huán)境資源與保護重點實驗室,廣州 510640)

電子垃圾拆解工人血清中多溴聯(lián)苯醚代謝產物的識別及其特征

任國發(fā)1,2, 于志強2, 孫延楓1, 馬盛韜2, 羅湘凡1,盛國英1,2, 傅家謨1,2

(1.上海大學環(huán)境與化學工程學院環(huán)境污染與健康研究所,上海 200444;2.中國科學院廣州地球化學研究所有機地球化學國家重點實驗室廣東省環(huán)境資源與保護重點實驗室,廣州 510640)

隨機采集廣東省貴嶼地區(qū)從事電子垃圾拆解工人的血液樣品作為研究對象,分析多溴聯(lián)苯醚類污染物在電子垃圾拆解工人血液中可能形成的代謝產物.結果表明,BDE-209不但可以在人體內蓄積,而且還能夠發(fā)生代謝,生成的羥基代謝產物同樣能夠蓄積在體內.初步判斷,電子垃圾拆解工人血液中新發(fā)現(xiàn)的 3個高溴數(shù)的羥基聯(lián)苯醚代謝產物分別為 2個八溴羥基聯(lián)苯醚和 1個九溴羥基聯(lián)苯醚.

多溴聯(lián)苯醚;羥基多溴聯(lián)苯醚;代謝產物;氣相色譜 /質譜;血清

Abstract:Human serum sampleswere collected from an electronic waste(e-waste)dismantling site in South China and analyzed to acquire the information about the polybrominated biphenyl ethers(PBDEs)metabolites in human body.The results indicated that BDE-209 could be bioaccumulated and metabolited into hydroxylated polybrominated biphenyl ethers(OH-PBDEs)in human body.Three OH-PBDEs(two octa-brominated and one nona-brominated congeners)metaboliteswere identified in human serum of the e-waste dismantlingworkers.The higher brominated OH-PBDEsmetabolites in our study were differentfrom that in other studies.

Key words:polybrominated biphenyl ethers;hydroxylated polybrominated biphenyl ethers;metabolite;gas chromatography/mass spectrometry;human serum

多溴聯(lián)苯醚 (polybrominated diphenyl ethers,PBDEs)是一類備受關注的持久性環(huán)境有機污染物,具有一定的神經(jīng)和甲狀腺毒性、弱的環(huán)境激素作用以及致癌性,但是目前尚不明確其毒性機理[1].有研究認為,PBDEs的這些生物毒性很可能與其在生物體內代謝后形成的羥基多溴聯(lián)苯醚 (hydroxylated polybrominated diphenyl ethers,OH-PBDEs)有關[2-3].代謝是決定污染物在生命體中毒性、命運以及生物放大作用的主要因素.雖然 PBDEs的代謝產物——OH-PBDEs的持久性并不如其對應的原型化合物強,但卻具有更強的生物化學作用[2-3].OH-PBDEs在分子結構上比其原型化合物更類似于生物體內的甲狀腺激素 3,3′,5-triiodothyronine(T3)和 3,3′,5,5′-tetraiodothyronine(T4).相關的結構簡式如圖1所示.

圖1 OH-PBDEs,PBDEs,T3和 T4的結構簡式Fig.1 Chem ical structures of OH-PBDEs,PBDEs,T3 and T4

體外實驗表明,一些 OH-PBDEs和甲狀腺素轉運蛋白酶有很強的競爭性結合甲狀腺受體蛋白的能力.Hamers等[4]的研究表明 ,4-OH-BDE-42,4′-OHBDE-49,3-OH-BDE-47與 transthyretin(血液中 3種甲狀腺激素結合蛋白之一)的結合能力要比甲狀腺素強 4倍,5-OH-BDE-47與 transthyretin的結合能力也顯著高于甲狀腺素.這些外源性物質的競爭結合,勢必會造成人體的甲狀腺功能紊亂.

為了能夠更加全面地了解 PBDEs的環(huán)境命運、人體的吸收和消化能力、代謝機理,以及準確評價人體的暴露風險,就必須對這些化合物在人體內的代謝進行更加全面的研究.

1 材料與方法

1.1 樣品采集及區(qū)域背景

貴嶼位于廣東省汕頭市潮陽區(qū),是全世界最大的電子垃圾拆解基地,每年在此處回收處理的電子垃圾超過百萬噸,被稱為“世界電子垃圾終點站”.在全世界數(shù)量驚人的電子垃圾中,有很大一部分是通過非法手段被運送到貴嶼進行拆解處理的.由于拆解工藝非常原始,沒有任何的安全措施,因此,在拆解處理的過程中,會產生大量的有害物質,嚴重地污染貴嶼地區(qū)的大氣、土壤、水和生物體,對當?shù)鼐用竦慕】禒顩r造成威脅.本課題組前期的研究結果表明,貴嶼地區(qū)電子垃圾拆解工人暴露于高濃度的多溴聯(lián)苯醚,尤其是十溴代聯(lián)苯醚 (BDE-209)的含量比國外從事類似職業(yè)的人群高 50～200倍[5].實驗結果引起了國外環(huán)境科學家們的廣泛關注,建議我們對多溴聯(lián)苯醚在工人體內的代謝情況進行進一步的研究.本研究隨機挑選了 20個在貴嶼地區(qū)從事電子垃圾拆解的工人血液樣品,對多溴聯(lián)苯醚在人體內的代謝產物進行了初步識別和鑒定.

1.2 樣品處理

詳細的樣品實驗室處理過程可參見文獻[6],主要包括三個步驟,分別為脂肪的提取、中性組分和極性組分的分離以及兩組分的分別去脂凈化.中性組分與極性組分的分離是成功分離鑒別出多溴聯(lián)苯醚的關鍵步驟,以下作詳細說明.提取出的脂肪恒重后用 5 mL正己烷溶解并轉移到離心管中,加入10 mL 0.5 mol/dm3KOH的乙醇和水 (1∶1)的混合堿液,振蕩,離心分離,取出無機相.此時目標化合物中的極性組分在堿溶液的作用下轉變?yōu)槠潲}溶液進入到無機組分,目標化合物中的中性組分停留在正己烷相中.再用 8 mL上述混合堿液萃取一次正己烷相,合并兩次所得的無機相溶液,用 10 mL正己烷反萃取一次,兩次所得正己烷相合并.至此,中性組分和極性組分分離,分離出的無機相組分再加入6 mol/dm3的鹽酸溶液約 2 mL,震蕩搖勻,調節(jié) pH<5,還原極性目標化合物.由于 PBDEs在生物體內的代謝產物主要是一些含羥基的化合物,這些化合物如果直接用破壞性去脂方法除脂,可能和濃硫酸起反應,使回收率過低甚至完全被破壞,所以一般都要對該類化合物進行衍生化后再去脂凈化.本實驗中還原后的極性組分參照中性組分的提取方法濃縮富集,所不同的是,在提取時采用的萃取劑為正己烷和甲基叔丁基醚 (9∶1)混合溶液.為提高儀器的分析靈敏度,極性組分分離后采用重氮甲烷將其衍生化為對應的甲氧基,取代多溴聯(lián)苯醚進行分析.

1.3 色譜質譜條件

DB-5HT高溫毛細管柱 (15 m×0.25 mm×0.25 μm);載氣為 He,采用恒流模式,柱流量為 1.2 mL/min,無分流進樣,進樣量為 1μL;進樣口溫度 280℃.柱始溫 110℃(1 min),以 12℃/min程序升至210℃(1 min),5℃/min升至 250℃(3 min),0.5℃/min升至 275℃(5 min),15℃/min升至 300℃(5 min).

負化學電離源 (negative chemical ionization,NCI):反應氣為甲烷,離子源溫度 200℃,四極桿溫度 150℃,界面溫度 300℃.儀器分析時,采用全掃描和選擇離子同時監(jiān)測模式,全掃描檢測離子質量范圍為M/Z 300～950,選擇離子質量分別為 79.0,81.0,406.7,408.7,486.7,488.7.

圖2 工人血液樣品和高溴數(shù)多溴聯(lián)苯醚標樣的色譜圖Fig.2 Chromatography of a electron ic waste dismantling worker sample and the higher PBDEs standard

2 實驗結果和討論

2.1 多溴聯(lián)苯醚在人體內的蓄積代謝

本課題組前期的研究結果表明,貴嶼地區(qū)電子垃圾拆解工人暴露于高濃度的多溴聯(lián)苯醚,尤其是十溴代聯(lián)苯醚 (BDE-209)的含量比國外從事類似職業(yè)的人群高 50～200倍[5].代謝是污染物離開生命體的一種重要途徑,動物實驗表明,PBDEs可以在動物體內代謝成羥基代謝產物.本研究對工人血清中 PBDEs可能的羥基代謝產物進行了分析,識別出3種不同于以往文獻報道的高溴代多溴聯(lián)苯醚羥基代謝產物.由于具體結構信息還不明確,以下分別以M 1,M 2,M 3表示,如圖2所示.

由于缺少相關標準品,如何證明發(fā)現(xiàn)的 3個化合物是 PBDEs的代謝產物成為本研究的關鍵.首先,通過過程空白實驗和基質加標實驗證明,這些新化合物并非是實驗過程引入,或者是 PBDEs在樣品處理和儀器分析過程中發(fā)生化學反應生成的新物質.其次,色譜分析表明,這 3個化合物在非極性毛細管色譜柱上的保留時間均低于十溴聯(lián)苯醚,分列于 3個九溴聯(lián)苯醚兩側.結合工人血清樣品中 BDE-209的濃度顯著高于其他研究人群,我們初步分析工人血清樣品中發(fā)現(xiàn)的這 3個代謝產物的前驅體為BDE-209.據(jù)此可以得出,BDE-209不但可以在人體內蓄積,而且還能夠發(fā)生代謝,生成的羥基代謝產物同樣能夠蓄積在體內.

為了獲得這些代謝產物盡可能多的結構信息,將 3份樣品混合,重新過酸性硅膠小柱凈化,采用相同的色譜參數(shù)對合并的樣品進行全掃描分析,掃描離子質量范圍為 M/Z 300～950.在 NCI模式下,含鹵聯(lián)苯醚類化合物一般是從醚鍵發(fā)生斷裂,分別形成兩個含有醚氧鍵的碎片峰.本研究發(fā)現(xiàn)的 3個化合物都遵循這一原則,質譜譜圖如圖3所示.

圖3中,盡管在 NCI全掃描模式下各化合物產生的分子碎片信息較少,化合物M 1依然產生了許多特征的碎片離子,其主碎片峰由醚鍵斷裂形成.一個主碎片峰為苯環(huán)上含有 1個醚氧鍵 4個溴原子(406.6/408.6);另一個主碎片峰苯環(huán)上除含有 1個醚氧鍵和 4個溴原子,還包含了 1個 OCH3取代基 (436.6/438.6).此外,高質量數(shù)逐級脫溴的離子碎片峰也非常明顯,推測M 1為含有 8個溴原子的多溴聯(lián)苯醚甲氧基取代物,每個單環(huán)上分別包含 4個溴原子.M 2的質譜特征與M 1類似,其主碎片峰也是醚鍵斷裂后的兩個特征離子分峰 (406.5/408.5,438.5/440.5),與M 1所不同的是分子離子和高質量數(shù)逐級脫溴形成的碎片離子不明顯,推測M 2也是一個含有 8個溴原子的多溴聯(lián)苯醚甲氧基取代物.相同色譜條件下,M 3保留時間介于 3個九溴聯(lián)苯醚和 BDE-209之間 (見圖2),暗示 M 3可能是一個含有9個溴原子的多溴聯(lián)苯醚甲氧基取代物.NCI質譜特征表明,M 3的主碎片峰為苯環(huán)上含有 1個醚氧鍵和 5個溴原子的離子 (486.4/488.4).醚鍵斷裂后形成的另一個半分子離子峰 (438.7)屬于第三強峰,暗示該粒子不穩(wěn)定,繼續(xù)斷裂形成苯環(huán)上含有1個醚氧鍵和 4個溴原子 (408.4/410.4)的碎片穩(wěn)定性更強,屬于第二強峰.盡管 NCI質譜給出的結構信息還不是很全面,由M 3主碎片離子的斷裂規(guī)律也可以進一步推測M 3是一個含有 9個溴原子的多溴聯(lián)苯醚甲氧基取代物.圖4給出了M 1,M 2,M 3可能的結構簡式.

圖3 化合物M 1,M 2,M 3的 NCI全掃描質譜圖Fig.3 NC Imass spectrum of com pound M 1,M 2,M 3

圖4 BDE-209在人體血液中可能形成的代謝產物Fig.4 Tentatively identif ied BDE-209 metabolites in serum

2.2 代謝產物的確定

本課題組合成了大量甲氧基多溴聯(lián)苯醚,采用不同極性的柱系統(tǒng)對所合成的標樣與樣品中發(fā)現(xiàn)的代謝產物進行共柱分析.經(jīng)對比發(fā)現(xiàn),樣品中檢出的M 1,M 2分別為兩個鄰位被羥基取代的化合物,即 6-OH-BDE-199和 6-OH-BDE-196,而 M 3為鄰位被羥基取代的九溴多溴聯(lián)苯醚,即 6′-OH-BDE-206,如圖5所示.從文獻資料可知,自然源生成的羥基多溴聯(lián)苯醚的羥基均位于醚鍵的鄰位,由動物代謝實驗獲得的代謝產物的羥基多取代醚鍵的間位或對位.而本研究中發(fā)現(xiàn)的這 3個代謝產物均為鄰位取代產物,與上述結論并不一致,具體原因還有待深入研究.

圖5 樣品、樣品和混合標樣共注的色譜圖Fig.5 Chromatography of sample and sample sp iked w ith standard m ix

通常多溴聯(lián)苯醚在動物體內有兩種代謝方式:脫溴還原成低溴數(shù)聯(lián)苯醚和催化氧化后插入羥基化形成羥基衍生物.基于本研究中所發(fā)現(xiàn)代謝產物,BDE-209在工人體內的代謝途徑只可能為脫溴/羥基化產生代謝,而且該代謝方式在其他動物實驗中也有發(fā)現(xiàn).在老鼠暴露于 BDE-47的實驗中,Marsh等[7]在老鼠糞便中發(fā)現(xiàn)了 3種含有 3個溴原子的羥基多溴聯(lián)苯醚代謝產物.Qiu等[8]在經(jīng)口和靜脈注射暴露于DE-71工業(yè)品的實驗室大鼠血清中,同樣發(fā)現(xiàn)了可以定量的 4-OH-BDE-17和 2-OH-BDE-28兩種含有 3個溴原子的羥基多溴聯(lián)苯醚代謝產物.工業(yè)品DE-71中含有 3個溴原子的 PBDEs只有 BDE-28,且其含量非常少.事實上,理論上也不存在 BDE-28直接代謝成 4-OH-BDE-17的可能,這進一步說明了這些低溴代謝產物可能是由更高溴數(shù)的多溴聯(lián)苯醚 (如BDE-47等),經(jīng)脫溴 /羥基化形成的代謝產物.

2.3 國內外相關研究對比

印地安娜大學 Hites[9]課題組和斯德哥爾摩大學的Bergman[10]課題組均對人體內多溴聯(lián)苯醚的代謝進行過相關研究報道.Bergman[10]課題組研究對象是尼加拉瓜地區(qū)一個廢物處理廠的兒童.由于經(jīng)濟貧困,這些兒童大多從一出生就生活在廢品處理廠,盡管只有 11～15歲,其平均工作年限卻長達6 a之久.研究人員發(fā)現(xiàn),這些兒童的血液中 PBDEs原型化合物是對照區(qū)兒童的 20～50倍.同時還發(fā)現(xiàn)了有 19種 OH-PBDEs存在,且 OH-PBDEs的含量和原型化合物的含量有正相關性.通過與標樣比對,對其中的 6種 OH-PBDEs代謝產物進行了鑒定,這 6種代謝產物包括 4個對位取代、1個鄰位取代和 1個間位取代產物.由于自然界中天然存在的 OHPBDEs只有鄰位取代產物,因此,該研究可以說明PBDEs可在人體內代謝并蓄積在血液中.然而,同樣由于缺少必要的標樣,該研究未對 7個溴原子以上的高溴代謝產物進行識別.通過簡單的計算保留時間以及出峰情況,可初步分析得出該研究所給出色譜圖中未識別的高溫區(qū)的兩個代謝產物 (見圖6中圈內標注)可能與本研究中的M 1和M 2相對應.Qiu等[9]利用采自印第安納波利斯州一個醫(yī)院內 20個懷孕婦女和新生兒臍帶血液,分析了血液中PBDEs原型及其代謝產物,從中發(fā)現(xiàn)了 7種羥基代謝產物,分別為 4-OH-BDE-42,3-OH-BDE-47,5-OHBDE-47,6-OH-BDE-47,4′-OH-BDE-49,5′-OH-BDE-99,6′-OH-BDE-99,另外還發(fā)現(xiàn)了 3種溴酚類化合物.該研究還發(fā)現(xiàn),多溴聯(lián)苯醚羥基代謝物的蓄積量和原型類化合物處于同一濃度水平.綜合兩項研究成果,共同之處主要是在人體樣品中發(fā)現(xiàn)了低溴數(shù)的多溴聯(lián)苯醚 (4溴和 5溴),這和所研究的目標人群體內多溴聯(lián)苯醚的內暴露情況相一致,其研究對象體內都是以低溴數(shù)多溴聯(lián)苯醚如 BDE-47,BDE-99占主導地位.而本研究中工人血清中高溴數(shù)代謝產物占主導,這與所研究人群的暴露特點也相一致.本研究中工人血液中的 BDE-209含量非常高,甚至高出其他職業(yè)暴露人群許多倍.

一般來講,異型物質在人體內特定生物酶的作用下可形成極性較強的代謝產物,增加其水溶性,從而更容易排出體外.然而,本研究卻發(fā)現(xiàn),BDE-209的這些代謝產物同樣會蓄積在人體血液中,一種可能的解釋便是這些新生成的羥基代謝產物能夠與血液中的某些轉運蛋白酶產生可逆結合作用.體外染毒實驗表明,一些低溴數(shù) OH-PBDEs能夠和體內甲狀腺素產生很強的競爭反應.Hamers等的體外共培養(yǎng)實驗表明[4],4-OH-BDE-42,4′-OH-BDE-49,3-OH-BDE-47和 transthyretin(血液中 3種甲狀腺激素結合蛋白之一)的結合能力要比甲狀腺素強4倍.OH-PBDEs在人體內的蓄積和競爭反應勢必會造成人體甲狀腺功能紊亂,說明這些代謝產物在生命體內具有比原型化合物更強的生物毒性.

圖6 混合血液樣品中極性組分的 GC/M S譜圖[10]Fig.6 GC-M S chromatogram show ing the presence of OH-PBDEs in the phenolic fraction of human blood[10]

3 結 束 語

本研究對貴嶼地區(qū)電子垃圾拆解工人血液中可能形成的多溴聯(lián)苯醚代謝產物進行了分析,研究結果表明:

(1)研究發(fā)現(xiàn)BDE-209不但可以在人體內蓄積,而且還能夠發(fā)生代謝,生成的羥基代謝產物同樣也能夠蓄積在體內.初步判斷電子垃圾拆解工人血液中發(fā)現(xiàn)的這 3個高溴數(shù)的羥基聯(lián)苯醚代謝產物,分別為 2個八溴羥基聯(lián)苯醚 (OH-BDE-199 OH-BDE-196)和 1個九溴羥基聯(lián)苯醚 (OH-BDE-206),這 3種新發(fā)現(xiàn)的化合物可能是BDE-209在人體特定生物蛋白酶的作用下通過脫溴/羥基化形成的代謝產物.

(2)和國外相關研究進行對比,本研究中發(fā)現(xiàn)的代謝產物主要是高溴數(shù)取代的羥基代謝產物,和國外相關研究明顯不同,原因與不同人群暴露于多溴聯(lián)苯醚同系物的模式不同有關.國外研究的人群體內蓄積的都是低溴數(shù)多溴聯(lián)苯醚如 BDE-47,BDE-99占主導地位,而本研究中的人群暴露的最大特點是BDE-209占主導地位.

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(編輯:丁嘉羽)

Prelim inary Study of Hydroxylated Polybrom inated D iphenyl Ether s(OH-PBDEs)M etabolites in Human Serum of Electron ics D ismantling W orker s

REN Guo-fa1,2, YU Zhi-qiang2, SUN Yan-feng1, MA Sheng-tao2, LUO Xiang-fan1,SHENG Guo-ying1,2, FU Jia-mo1,2
(1.Institute of Environmental Pollution and Health,School of Environmental and Chemical Engineering,Shanghai University,Shanghai200444,China;(2.State Key Laboratory of Organic Geochemistry,Guangdong Key Laboratory of Environment and Resources,Guangzhou Institute of Geochemistry,Chinese Academy of Sciences,Guangzhou 510640,China)

X 503.1

A

1007-2861(2010)05-0441-06

10.3969/j.issn.1007-2861.2010.05.001

2010-06-28

國家重點基礎研究發(fā)展計劃 (973計劃)資助項目 (2008CB418205);上海高校選拔培養(yǎng)優(yōu)秀青年教師科研專項基金資助項目(SHU09015)

傅家謨 (1933～),男,研究員,中國科學院院士,博士生導師,研究方向為環(huán)境污染與人體健康、大氣、水體和沉積物等環(huán)境介質中毒害有機污染物分布特征、遷移轉化與治理技術等.E-mail:fujm@gig.ac.cn