張 燕，郭天鑫，于 姣，豐 帆，王 碩*

(食品營(yíng)養(yǎng)與安全教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津 300457)

離子交換固相萃取高效液相色譜聯(lián)用法檢測(cè)食品中的5-羥甲基糠醛

張 燕，郭天鑫，于 姣，豐 帆，王 碩*

(食品營(yíng)養(yǎng)與安全教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津 300457)

為提高分析方法的準(zhǔn)確性，優(yōu)化建立一種定量檢測(cè)各類食品中5-羥甲基糠醛含量的高效液相色譜方法。采用離子交換固相萃取柱代替?zhèn)鹘y(tǒng)的C18固相萃取柱進(jìn)行前處理，與高效液相色譜聯(lián)用，提高了方法的回收率和精密度。在0.01～12mg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，5-羥甲基糠醛質(zhì)量濃度和色譜峰面積線性關(guān)系好(R2=0.9998)，方法檢出限(RSN=3)為3.42μg/L。在0.1、0.5、1mg/kg 3種質(zhì)量濃度添加水平內(nèi)，5-羥甲基糠醛的添加回收率為85%～103%，RSD為0.31%～3.83%。采用該方法對(duì)13種樣品進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明該方法能夠用于食品中5-羥甲基糠醛含量測(cè)定。

5-羥甲基糠醛；離子交換固相萃??；高效液相色譜；食品

Abstract：An ion exchange solid phase extraction coupled with high performance liquid chromatographic method was presented and optimized in order to improve its sensitivity and accuracy. In this method, ion exchange solid-phase extraction column was used for pretreatment instead of conventionally used C18 solid-phase extraction column so that method recovery and accuracy could be both improved. This method exhibited a good linear relationship over the 5-hydroxymethyl-furfural (5-HMF) concentration range of 0.01 to 12 mg/L (R2=0.9998). The detection limit of this method was 3.42 μg/L. The recovery rates for 5-HMF spiked at levels of 0.1, 0.5 mg/L and 1 mg/L were between 85% and 103% with a relative standard deviation varying from 0.31%to 3.83%. Determination of 5-HMF in 13 real samples was performed using this method, and the results demonstrate that this method is applicable to determine 5-HMF in food.

Key words：5-hydroxymethyl-furfural；ion-exchange solid phase extraction；HPLC；food

隨著食品安全受到全社會(huì)普遍關(guān)注，食品中5-羥甲基糠醛成為新的研究熱點(diǎn)。5-羥甲基糠醛(5-hydroxymethylfurfural，5-HMF)，也叫5-羥甲基-2-呋喃甲醛(5-hydroxymethyl-2-furaldehyde)，是葡萄糖、果糖等單糖化合物在高溫或弱酸等條件下脫水產(chǎn)生的醛類化合物[1-5]。食品工業(yè)中美拉德反應(yīng)和焦糖化反應(yīng)也能產(chǎn)生5-HMF[6-8]。據(jù)報(bào)道，5-HMF有一定程度的毒副作用，對(duì)眼、黏膜、皮膚有刺激性，過(guò)量食用會(huì)引起中毒，造成動(dòng)物橫紋肌麻痹和內(nèi)臟損害[5-10]。有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道5-HMF的每日允許攝入量為30～60mg[11]。

國(guó)內(nèi)的研究主要集中在醫(yī)藥領(lǐng)域的葡萄糖注射液和中藥成分中5-HMF的含量檢測(cè)[12-13]，檢測(cè)方法通常為比色法、雙波長(zhǎng)法、紫外分光光度法、硫代巴比妥酸法[14]，而國(guó)外集中在食品領(lǐng)域中的檢測(cè)，如蜂蜜[15]、咖啡[16]、飲料[17]等，檢測(cè)方法有液相色譜(HPLC)、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(HPLC-MS)、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)等技術(shù)。

食品基質(zhì)復(fù)雜，對(duì)于樣品前處理的要求較高，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，依據(jù)文獻(xiàn)[18]報(bào)道的分析方法，采用C18固相萃取柱處理樣品后，5-HMF的回收率較低，本實(shí)驗(yàn)擬研究建立一種能有效提高5-HMF回收率的固相萃取前處理方法，從而提高方法的準(zhǔn)確度和靈敏度，使其可以用于多種食品中5-HMF含量的準(zhǔn)確測(cè)定。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

面包、咖啡、蜂蜜、葡萄酒、醬油、麻花、薯片等食品均購(gòu)于當(dāng)?shù)爻校?-羥甲基糠醛(純度99%)Sigma公司；甲醇、乙腈、乙酸乙酯(色譜純) 天津康科德科技有限公司；乙酸鋅、亞鐵氰化鉀等(均為國(guó)產(chǎn)分析純)。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-20A高效液相色譜儀 日本島津公司；HYPERSIL ODS-2 C18(4.6mm×250mm，5μm)色譜柱、HyperSep Retain PEP固相萃取柱、HyperSep C18固相萃取柱 美國(guó)Thermo公司；Milli-Q超純水儀 美國(guó)Millipore公司；QL-901型渦旋振蕩器 海門市其林貝爾儀器制造有限公司；KQ-500B型超聲波離心機(jī) 昆山市超聲儀器有限公司；SPE固相萃取裝置 美國(guó)Supelco公司；AGT Cleanert PCX固相萃取柱 天津艾杰爾公司。

1.3 方法

1.3.1 系列濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

稱取5-羥甲基糠醛標(biāo)準(zhǔn)品40mg(精確至0.0001g)，用超純水溶解并定容于100mL容量瓶里，制成0.4mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，再用超純水稀釋成0.01、0.1、0.4、1、4、8、12mg/L工作溶液。

1.3.2 液相色譜條件

色譜柱：HYPERSIL ODS-2 C18(4.6mm×250mm，5μm)；UV檢測(cè)器：檢測(cè)波長(zhǎng)284nm；流動(dòng)相：甲醇-水(15:85，V/V)；柱溫35℃；流速0.6mL/min；進(jìn)樣量20μL。

1.3.3 樣品制備

分別取5g(精確至0.001g)咖啡、面包、蜂蜜、麻花和薯片樣品溶于少量超純水中，添加1 mL乙酸鋅(150g/L)和1mL亞鐵氰化鉀(300g/L)，振蕩提取3min，再經(jīng)超聲波提取10min，轉(zhuǎn)入離心管中離心10min(5000r/min)，轉(zhuǎn)移澄清液于50mL容量瓶里；沉淀物再經(jīng)超純水提取一次，合并上清液，用超純水定容于50mL容量瓶里。從容量瓶里取樣品澄清液10mL過(guò)SPE固相萃取。

準(zhǔn)確吸取葡萄酒10mL，超聲波脫氣10min，脫氣樣品過(guò)SPE固相萃取。

準(zhǔn)確吸取醬油5 m L，用乙酸乙酯經(jīng)振蕩提取兩次，合并提取液并定容至50mL，取10mL溶液過(guò)SPE固相萃取。

1.3.4 固相萃取方法

離子交換固相萃取柱使用前，首先用5mL甲醇過(guò)萃取柱，接著用5mL超純水淋洗萃取柱，保持萃取柱濕潤(rùn)，上樣10mL(控制流速每?jī)擅?滴)，5mL純水淋洗除雜，10mL甲醇洗脫，氮吹至干，用0.5mL流動(dòng)相溶解，過(guò)0.45μm針筒式濾膜，待HPLC分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件優(yōu)化

通過(guò)優(yōu)化流動(dòng)相組分、比例和流速，觀察對(duì)應(yīng)的色譜峰型，當(dāng)流動(dòng)相組分為甲醇-水(15:85，V/V)，等濃度洗脫，流動(dòng)相流速0.6mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)284nm時(shí)，5-HMF標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜峰圖形最好，見(jiàn)圖1。如果流動(dòng)相的流速過(guò)大，出峰時(shí)間早，基質(zhì)干擾影響大，不利于實(shí)際樣品的測(cè)定。

圖1 5-HMF標(biāo)準(zhǔn)溶液液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of 5-HMF standard solution

2.2 線性關(guān)系和檢出限

系列質(zhì)量濃度的5-HMF標(biāo)準(zhǔn)溶液依次經(jīng)優(yōu)化的高效液相色譜條件進(jìn)行分析，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、對(duì)應(yīng)色譜峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見(jiàn)圖2。檢測(cè)方法在0.01～12mg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性回歸方程為y=217584x+4051，R2=0.9998。根據(jù)3倍信噪比計(jì)算得到方法檢出限為3.42μg/L。

圖2 5-HMF標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of 5-HMF

2.3 固相萃取柱的選擇

實(shí)驗(yàn)比較了3種固相萃取柱，C18固相萃取柱、PEP固相萃取柱和PCX離子交換固相萃取柱。C18是以硅膠為基質(zhì)的未封端的反相萃取柱，是極性和非極性化合物萃取的通用型固定相；PEP官能化聚苯乙烯-二乙烯苯萃取柱，表面同時(shí)具有親水性和憎水性基團(tuán)，對(duì)各類極性和非極性化合物具有較均衡的吸附作用，其吸附能力強(qiáng)于C18鍵合硅膠；PCX是以陽(yáng)離子交換混合機(jī)理的水可浸潤(rùn)型聚合物為基質(zhì)的萃取柱，提供雙重保留模式，即離子交換與反相保留。分別對(duì)上樣量和凈化條件(洗雜、洗脫條件)進(jìn)行優(yōu)化。以5-HMF標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸附動(dòng)力曲線為評(píng)價(jià)指標(biāo)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PCX離子交換固相萃取柱吸附效果最好，PEP固相萃取柱次之，C18固相萃取柱效果最差，見(jiàn)圖3。

圖3 3種固相萃取材料的動(dòng)態(tài)吸附飽和容量曲線Fig.3 Dynamic adsorption saturation capacity curve for three kinds of solid-phase extraction materials

因此選擇PCX固相萃取柱作為樣品前處理柱，分別對(duì)淋洗除雜、溶劑洗脫條件進(jìn)行優(yōu)化。實(shí)驗(yàn)分別比較了純水、10%、20%及30%甲醇溶液的淋洗除雜效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)10%、20%、30%甲醇溶液均能不同程度地洗下目標(biāo)物，而純水沒(méi)有，故選擇純水洗雜。分別選用甲醇、乙腈、乙酸乙酯做洗脫劑，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，乙腈洗脫效果略低于甲醇，乙酸乙酯洗脫后在紫外有干擾，故選擇甲醇作為5-HMF洗脫液。優(yōu)化后所得固相萃取純化條件為上樣體積10mL、5mL純水洗雜、10mL甲醇洗脫。

2.4 樣品添加回收率和精密度

為了評(píng)價(jià)所建立方法的精密度，實(shí)驗(yàn)選擇咖啡、面包、蜂蜜和葡萄酒4種樣品，分別添加0.1、0.5、1mg/kg 3種質(zhì)量濃度的5-HMF標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，經(jīng)SPE前處理后，用高效液相色譜儀檢測(cè)，每種質(zhì)量濃度平行測(cè)定3次，計(jì)算添加回收率和RSD值，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。在3個(gè)添加水平上，5-HMF的回收率為85%～103%，RSD值為0.31%～3.83%，說(shuō)明方法準(zhǔn)確度和精密度均能達(dá)到常規(guī)定量方法的要求，能夠準(zhǔn)確用于食品中5-HMF含量的測(cè)定。

表1 各樣品添加回收率和RSDTable 1 Recovery rates of each sample and corresponding relative standard deviations

2.5 實(shí)際樣品測(cè)定

分別選擇市售的2種咖啡、2種面包、2種蜂蜜、2種葡萄酒、3種不同品牌的醬油、麻花和薯片，樣品經(jīng)所優(yōu)化建立的離子交換固相萃取前處理后，基質(zhì)干擾減少，提高了樣品檢測(cè)靈敏度，便于HPLC定量分析檢測(cè)，測(cè)得各樣品中5-HMF的含量見(jiàn)表2。圖4為醬油樣品色譜圖。

圖4 醬油樣品HPLC色譜圖Fig.4 HPLC chromatogram of soy sample

表2 各樣品中5-HMF的含量Table 2 5-HMF content in each sample

3 結(jié) 論

通過(guò)對(duì)不同種類樣品的固相萃取柱前處理?xiàng)l件和液相色譜分析條件的優(yōu)化，研究建立了定量檢測(cè)各類食品中5-HMF含量的離子交換固相萃取-液相色譜檢測(cè)方法。在質(zhì)量濃度0.01～12mg/L范圍，高效液相色譜檢測(cè)方法線性良好(R2=0.9998)，靈敏度高，方法檢出限為3.42μg/L，樣品添加回收率達(dá)85%～103%，RSD為0.31%～3.83%。與C18固相萃取柱相比，采用離子交換固相萃取柱凈化，提高了5-HMF回收率。用所建立方法對(duì)多種食品進(jìn)行了測(cè)定，除葡萄酒和薯片中未檢出5-HMF外，其他熱加工食品均含有不同量的5-HMF，有關(guān)5-HMF生成機(jī)理還需深入探討。

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Development of Ion-exchange Solid Phase Extraction and High Performance Liquid Chromatography for the Determination of 5-Hydroxymethyl-furfural in Food

ZHANG Yan，GUO Tian-xin，YU Jiao，F(xiàn)ENG Fan，WANG Shuo*
(Key Laboratory of Food Nutrition and Safety, Ministry of Education, Faculty of Food Engineering and Biotechnology,Tianjin University of Science and Technology, Tianjin 300457, China)

R155.5

A

1002-6630(2010)18-0212-04

2009-12-25

“十一五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2008BAD91B04)

張燕(1970—)，女，教授，博士，研究方向?yàn)槭称钒踩c檢測(cè)。E-mail：yzhang@tust.edu.cn

*通信作者：王碩(1969—)，男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称钒踩c檢測(cè)。E-mail：s.wang@tust.edu.cn