萬(wàn) 莉 譯，顏其貴 校

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，四川 雅安 625014）

豬瘟以前又名爛腸瘟，是由黃病毒科黃病毒屬的豬瘟病毒（CSFV）引起家豬和野豬的高度接觸傳染的嚴(yán)重傳染病。屬內(nèi)其他兩個(gè)成員為牛病毒性腹瀉病毒和綿羊邊界病病毒，也是能自然感染豬的重要?jiǎng)游锊≡⑸?。從世界各地分離的CSFV株暫被分為3個(gè)主要基因群，每一個(gè)基因群有3～4個(gè)亞群，即 1.1、1.2、1.3；2.1、2.2、2.3；3.1 和 3.2、3.3、3.4。CSFV野毒株的系統(tǒng)發(fā)生分析揭示亞群2.1a、2.1b、2.2、3.4在臺(tái)灣均確實(shí)存在。

CSFV兔化弱毒疫苗株免疫仔豬后，疫苗病毒在組織和血液能持續(xù)存在一段時(shí)間。用C株（ChineseCstrain）疫苗病毒接種仔豬，接種后2～16d（接種后天數(shù)，DPV）內(nèi)均可在扁桃體或在血液中檢測(cè)到疫苗病毒。C株可在8DPV的家豬器官中檢測(cè)到，而野豬則在9DPV可檢測(cè)到。南非使用的PAV-250疫苗株，用RT-PCR和熒光抗體試驗(yàn)（FAT）檢測(cè)均顯示，28DPV可在扁桃體中檢出。用C-株疫苗病毒肌內(nèi)注射斷奶仔豬，通過(guò)實(shí)時(shí)RT-PCR檢測(cè)，該病毒基因組可在扁桃體持續(xù)被檢測(cè)到的時(shí)間長(zhǎng)達(dá)42DPV。

采用遺傳多樣性的分子分析技術(shù)可以區(qū)分密切相關(guān)的病毒株。目前已經(jīng)成功使用RT-PCR、RT-PCR/限制性內(nèi)切酶分析、RT-PCR/核酸雜交試驗(yàn)，或?qū)崟r(shí)RT-PCR法來(lái)鑒別豬瘟病毒、牛病毒性腹瀉病毒和邊界病病毒。豬瘟病毒基因組分型也是通過(guò)使用RT-PCR及E2基因的限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性來(lái)進(jìn)行的。RT-PCR/限制性內(nèi)切酶分析用于鑒別豬瘟野毒和疫苗毒已有報(bào)道。采用RT-PCR擴(kuò)增后直接測(cè)定擴(kuò)增片段序列是對(duì)豬瘟病毒基因組遺傳進(jìn)行分析和鑒別野毒株和疫苗株目前使用最廣泛的方法。最近有學(xué)者報(bào)道，依據(jù)單個(gè)核苷酸差異設(shè)計(jì)TaqManMGB探針，采用實(shí)時(shí)熒光RT-PCR技術(shù)用來(lái)鑒別韓國(guó)野毒株和弱毒疫苗株（LOM株）。多重巢式RT-PCR和多重實(shí)時(shí)熒光RT-PCR法用來(lái)檢測(cè)和鑒別野毒株和疫苗病毒C-株亦有研究報(bào)道。

表1 用于本研究的病毒、疫苗株

當(dāng)前預(yù)防控制豬瘟廣泛采用免疫接種兔化弱毒疫苗，差異在于不同國(guó)家地區(qū)使用不同的兔化弱毒株，主要有 LPC 株（LapinizedPhilippinesCoronel）、HCLV 株（HogCholeraLapinizedVirus）、RiemsC 株（Chinese）、C株（ChineseCstrain）。 通 過(guò) 對(duì) C 株、HCLV 株、LPC 株疫苗病毒全長(zhǎng)cDNA序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，在其病毒基因組的3′NTR中均存在有12～13nt的富含T的插入序列。進(jìn)一步對(duì)兔化弱毒Porcivac株、Rovac株、俄國(guó)LK株以及原始兔化弱毒疫苗株C株的3′NTR非編碼區(qū)進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示4株疫苗病毒中均存在獨(dú)特的長(zhǎng)12～14nt富含T的插入序列。獨(dú)特的長(zhǎng)12～14nt富含T的插入序列在豬瘟病毒野毒株中缺失，極有可能是兔化弱毒疫苗株的一個(gè)遺傳標(biāo)記。因此，依據(jù)兔化弱毒疫苗株3′NTR序列差異，能夠建立一種RT-PCR技術(shù)可以快速鑒別豬瘟病毒野毒株和兔化弱毒疫苗株。本研究是依據(jù)上述原理建立的一種簡(jiǎn)單、快捷RTPCR檢測(cè)與鑒別技術(shù)，可以非常有效的應(yīng)用于豬瘟病毒感染的常規(guī)檢測(cè)診斷。同時(shí)，該方法不僅能夠提高檢測(cè)豬瘟病毒的靈敏度，而且可用于鑒別野毒株和兔化弱毒疫苗株。

1 材料與方法

1.1 病毒、疫苗株與臨床樣本

用于該項(xiàng)研究的病毒和疫苗株在表1中列出。來(lái)自不同免疫豬場(chǎng)的248個(gè)臨床樣本，是2004～2007年間由當(dāng)?shù)貏?dòng)物疾病控制中心做常規(guī)豬瘟診斷確定的樣本并提交動(dòng)物健康研究所的。所有的扁桃體和淋巴組織樣品均使用MEM培養(yǎng)液制備成10%的懸液，采用RT-PCR檢測(cè)以及病毒分離鑒定，在樣品制備的懸液接種到細(xì)胞，培養(yǎng)2d后使用熒光抗體試驗(yàn)（FAT）進(jìn)行病毒分離檢驗(yàn)。

1.2 引物設(shè)計(jì)

從 GenBank上 下 載 72株 CSFV、11株 BDV、15株1型BVDV、8株2型BVDV的部分NS5B和3′-NTR 序 列， 使 用 MegAlign5.03 軟 件 的 ClustalV功 能進(jìn)行序列比對(duì)分析。依據(jù)72株CSFV保守的NS5B和3′-NTR序列設(shè)計(jì)兩套簡(jiǎn)并的引物，用于鑒別豬瘟野毒株和兔化弱毒疫苗株。這些引物中包含兔化弱毒疫苗株特有的富含T的插入序列。同時(shí)設(shè)計(jì)兩條上游引物，C5（5′-GTAGCAAGACTGGRAAYAGGTA-3′，Y=CorT，R=AorG；Alfort/187 株基因組位置 11874 ～ 11895bp），C3（5′-ACCCTRTTGTARATAACACTA-3′，Alfort/187株基因組位置12106～12126bp），和一條下游引C6（5′-AAAGTGCTGTTAAAAATGAGTG-3′，Alfort/187基因組位置12240～12219bp）。C5/C6引物對(duì)預(yù)計(jì)能在野毒株和兔化弱毒疫苗株中依次產(chǎn)生367bp和379bp產(chǎn)物，而C3/C6引物對(duì)預(yù)計(jì)依次產(chǎn)生135bp和147bp產(chǎn)物短片段。為了增加敏感性，C3/C6引物對(duì)作為內(nèi)源引物，結(jié)合C5/C6引物對(duì)進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增檢測(cè)。

1.3 RT-PCR和巢式 PCR擴(kuò)增

使用Trizol試劑直接從100μL的10%的組織樣品懸液、稀釋疫苗、血清樣品或細(xì)胞培養(yǎng)物中提取病毒RNA。采用一步法RT-PCR，50μL的反應(yīng)體系包括1U超耐熱DNA聚合酶、10×buffer（包括 1.5mmol的 MgCl2）、8URNA 酶抑制劑、2UAMV，每條引物10pmole，0.1mmol的 dNTP和5μL 的病毒 RNA 模板。在 GeneAmpPCRSystem9700基因擴(kuò)增儀中進(jìn)行。反應(yīng)程序?yàn)椋?2℃，反轉(zhuǎn)錄，40min；94℃，變性3min ；94℃變性40s，55℃退火40s，72℃延伸40s，30 個(gè)循環(huán) ；最后72℃延伸7min。當(dāng)需要更高靈敏度時(shí)，巢式PCR擴(kuò)增以同法進(jìn)行，1.0μLRT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物做模板，C3/C6做巢式引物。

1.4 用RT-PCR和巢式PCR檢測(cè)實(shí)驗(yàn)感染豬的血清樣本

用含有105TCID50滴度的豬瘟野毒株（92-TC1株）的全血肌內(nèi)接種4頭8周齡的SPF豬。分別于接種0d、1d、2d、3d、5d、7d、10d 和 12d 后收集血清樣品。用 RTPCR和巢式PCR擴(kuò)增方法來(lái)決定這些樣品中是否存在豬瘟病毒。

1.5 用瓊脂糖凝膠和高效毛細(xì)管電泳分析擴(kuò)增產(chǎn)物

引物對(duì)C3/C6擴(kuò)增產(chǎn)物使用4%的瓊脂糖凝膠，引物對(duì)C3/C5擴(kuò)增產(chǎn)物使用2%的瓊脂糖凝膠分別進(jìn)行電泳分析。擴(kuò)增產(chǎn)物使用eGeneHDA-GT12系統(tǒng)電泳儀，在高效毛細(xì)管膠盒GCK-5000F上進(jìn)行分析。10.0μL擴(kuò)增產(chǎn)物與15.0μLTris-EDTA緩沖液在樣品盤中混合并自動(dòng)被上樣都到高效毛細(xì)管道中，參照eGene操作手冊(cè)進(jìn)行電泳。采用 AM420 方法，10s上樣時(shí)間和420s分離時(shí)間進(jìn)行分離。擴(kuò)增產(chǎn)物的分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和濃度參考pGEMDNA大小標(biāo)記。

1.6 敏感性和特異性試驗(yàn)

為了檢查RT-PCR和巢式PCR反應(yīng)的敏感性，將豬瘟野毒株O1030/CH/05熒光抗體實(shí)驗(yàn)滴度為103.8TCID50/mL的細(xì)胞培養(yǎng)上清液用PBS進(jìn)行10倍倍比稀釋。總的RNA從每個(gè)稀釋度中提取，用于RT-PCR和巢式PCR試驗(yàn)。在特異性試驗(yàn)中，2個(gè)BVDV-1株，2個(gè)BVDV-2株，BDV，PRRSV，PCV-2以及SIV亦采用該法做特異性檢驗(yàn)處理。

1.7 疫苗株和野毒株非編碼區(qū)3′NTR序列分析

引物對(duì)C5/C6的RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物使用QIAQuick純化試劑盒直接提純。采用BigDye終止法測(cè)序反應(yīng)試劑盒，以RT-PCR原始引物直接測(cè)定RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的DNA序列。在這個(gè)試驗(yàn)中，直接測(cè)定一個(gè)長(zhǎng)的富含T片段是不可能的，因?yàn)榛蚧瑒?dòng)的影響。為了克服該困難，使用pBAD/硫拓?fù)洚悩?gòu)酶I耐熱擴(kuò)增克隆試劑盒，對(duì)從疫苗株LPC/PRK和LPC/TS長(zhǎng)的富含T的插入序列擴(kuò)增的RT-PCR產(chǎn)物分別進(jìn)行克隆。疫苗株LPC/PRK和LPC/TS各自做10個(gè)不同的克隆質(zhì)粒，通過(guò)使用標(biāo)準(zhǔn)載體引物對(duì)其進(jìn)行DNA測(cè)序。

2 結(jié)果與分析

2.1 RT-PCR和巢式PCR的特異性

圖1 不同基因型的豬瘟病毒和4個(gè)兔化疫苗株擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳分析

通過(guò)利用引物對(duì)C5/C6，采用RT-PCR，158株豬瘟野毒株，ALD，CAP株和5株兔化疫苗株（LPC/AHRI，LPC/TS，LPC/PRK，HCLV和C株）基因序列都成功被擴(kuò)增出。正如預(yù)期所料，野毒株病毒有367bp的PCR產(chǎn)物和3個(gè)疫苗株病毒（LPC/AHRI，HCLV和C-株）有379bp的PCR產(chǎn)物。LPC/PRK和LPC/TS株病毒略大的產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠中與野毒株病毒區(qū)分開來(lái)，但是其他3個(gè)疫苗株病毒（LPC/AHRI，HCLV和C株）不能與野毒株區(qū)分開（圖1A）。通過(guò)利用引物對(duì)C3/C6，之前提到的野毒株和疫苗株的基因序列也成功被擴(kuò)增出。如預(yù)期所料，在4%瓊脂糖凝膠中，產(chǎn)生135bp的片段為野毒株，而5株疫苗病毒擴(kuò)增出范圍在147bp～177bp間的基因片段，因此疫苗病毒的產(chǎn)物能容易與那些野毒株區(qū)分開（圖1B）。為了增加靈敏度，建立巢式PCR，引物對(duì)C3/C6作為內(nèi)源引物。在巢式PCR試驗(yàn)中，158株野毒株豬瘟病毒，ALD，CAP株和5株兔化疫苗株的擴(kuò)增產(chǎn)物與前面的RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小一致（圖1C）。其他瘟病毒，包括BVDV（國(guó)家動(dòng)物疾病實(shí)驗(yàn)室），BVDV（Nose），BVDV-1（疫苗株），BVDV-2（疫苗株）和BDV，以及其他常見豬病毒，例如PRRSV，PCV-2和SIV，用這2套引物沒有擴(kuò)增出片段（資料未顯示）。

圖2 用引物對(duì)C3/C6進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳分析

2.2 用RT-PCR檢測(cè)和鑒別臨床樣本中的野毒株和兔化弱毒疫苗株

在本研究中總共有248個(gè)臨床樣品進(jìn)行了試驗(yàn)。通過(guò)RT-PCR，樣品中有35個(gè)顯陽(yáng)性，其中9個(gè)被鑒定為野毒株（圖2），以及26個(gè)被鑒定為免疫存留的兔化弱毒疫苗株。在病毒中和試驗(yàn)（VI）中，通過(guò)熒光抗體試驗(yàn)，248個(gè)臨床樣本中只有19個(gè)對(duì)豬瘟病毒顯陽(yáng)性，10個(gè)是疫苗病毒。這些結(jié)果顯示RT-PCR試驗(yàn)比VI試驗(yàn)靈更敏。

2.3 高效毛細(xì)管電泳分析

通過(guò)利用高效毛細(xì)管電泳系統(tǒng)，引物對(duì)C5/C6擴(kuò)增出的RT-PCR產(chǎn)物很容易被分離成野毒株和疫苗株病毒，甚至差異小至12nt也被分離出。5個(gè)不同的病毒基因組代表的4株兔化疫苗株（LPC/AHRI，LPC/TS，LPC/PRK和HCLV）和野毒株豬瘟病毒的平板凝膠觀察分離效果見圖3。

2.4 RT-PCR和巢式PCR的靈敏度實(shí)驗(yàn)

在RT-PCR實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)利用引物對(duì)C5/C6和C3/C6，豬瘟病毒野毒株的檢測(cè)限制依次是6.3TCID50/mL和63TCID50/mL，顯示引物對(duì)C5/C6的RT-PCR，比用引物對(duì)C3/C6靈敏度高10倍。在巢式PCR實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)使用引物對(duì)C3/C6，檢測(cè)野毒株豬瘟病毒限制是0.63TCID50/mL，基于這些結(jié)果顯示，巢式PCR比RT-PCR靈敏度高10～100倍。

圖3 高效毛細(xì)管電泳分析豬瘟病毒（CSFV）野毒株和兔化疫苗株的富含T的插入序列片段

圖4 豬瘟病毒3′NTR富含T的插入序列片段的核苷酸比對(duì)排列（從Alfort/187基因組位置12106bp～12185bp）

2.5 野毒株與兔化弱毒疫苗株基因組3′NTR核苷酸序列

從248個(gè)臨床樣本中獲得的9個(gè)野毒株和8個(gè)疫苗型豬瘟病毒的RT-PCR產(chǎn)物用C5和C6做測(cè)序引物進(jìn)行序列測(cè)定。DNA測(cè)序結(jié)果顯示9株野毒株豬瘟病毒屬于豬瘟病毒2.1a亞群，而8株疫苗病毒是屬于1.1亞群（資料沒有顯示）的LPC株。除此之外，亞群1.1（LPC/AHRI，LPC/PRK和LPC/TS）的3個(gè)疫苗株和4個(gè)不同基因型（2.1亞群的92-TC1，2.1b亞群的90-YL1，2.2亞群的84-KS1，3.4亞群的85-12A）的野毒株亦都測(cè)定序列。這7株的序列提交到GenBank，依次為85-12A（EU107748），84-KS1（EU107749），92-TC1（EU107750），90-YL1（EU107751），LPC/AHRI（EU107752），LPC/TS（EU107753），和 LPC/PRK（EU107754）。RT-PCR 產(chǎn)物直接測(cè)序結(jié)果顯示野毒株基因組缺乏富含T的插入序列，而疫苗株LPC/AHRI含有一個(gè)長(zhǎng)12bp富含T的插入序列。10個(gè)不同質(zhì)粒克隆測(cè)序的結(jié)果顯示LPC/PRK和LPC/TS依次含有一個(gè)大小在32～42個(gè)和27～36個(gè)核苷酸間富含T的插入序列。含有最長(zhǎng)為42bp和36bp的富含T的插入序列的2個(gè)克隆分別來(lái)源于LPC/PRK和LPC/TS。通過(guò)使用上游和下游引物對(duì)它們進(jìn)行測(cè)序，并用這兩個(gè)引物獲得了鑒定結(jié)果。疫苗株LPC/AHRI，LPC/PRK和LPC/TS的富含T的插入序列的一個(gè)序列對(duì)比顯示，這3株疫苗株富含T 的插入序列長(zhǎng)度分別是 12bp、36bp、42bp（圖 4）。

包括在這個(gè)排列里的22個(gè)序列加入如下：Alfort/187（X8739），ALD（D49532），Shimen（AF092448），Alfort/Tubingen（J04358），Bresci（M31769），GXWZ02（AY367767），85-12A（EU107748），84-KS1（EU107449），92-TC1（EU107752），LPC/PRK 疫 苗 株（EU107754），LPC/TS 疫苗（EU107753），LPC/AHRI疫苗株（EU107752），HCLV疫苗株（AF531433），C株疫苗株（Z46258），俄國(guó)LK疫苗株（AF026718），俄國(guó)CS疫苗株（AF099102），Porcivac疫苗株（AF026714），Povac疫苗株（AF026717），Riems疫苗株（U45477），Riem疫苗株（AY259122），和Riems疫苗株（U45456）。

3 討論

豬瘟是具有高度接觸傳染性并保持常態(tài)的致死性的豬病。豬瘟兔化弱毒株，例如C株，LPC和HCLV，幾乎完全能誘導(dǎo)對(duì)豬瘟的保護(hù)。因?yàn)槿醵疽呙缰昴茉谝呀?jīng)種的豬體內(nèi)持續(xù)一長(zhǎng)段時(shí)間，它們會(huì)干擾用實(shí)驗(yàn)室診斷檢測(cè)豬瘟野毒株。在臺(tái)灣，為了防制豬瘟，已經(jīng)強(qiáng)制執(zhí)行弱毒疫苗的接種工作，因此鑒別野毒株和疫苗株是實(shí)驗(yàn)室診斷豬瘟必備的、重要的能力。RT-PCR之后測(cè)序或用限制性酶切是目前在臺(tái)灣用于檢測(cè)豬瘟并排除疫苗病毒干擾的主要方法。在本實(shí)驗(yàn)中，為了簡(jiǎn)化豬瘟鑒別診斷方法，我們基于疫苗株富含T的插入序列建立了一種一步法單管RT-PCR檢測(cè)技術(shù)，可同時(shí)檢測(cè)和鑒別豬瘟病毒野毒株和疫苗株。該技術(shù)中RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物能通過(guò)普通瓊脂糖凝膠電泳(圖1B，1C，2)或自動(dòng)高效毛細(xì)管電泳進(jìn)行分析，后者為快速鑒別豬瘟病毒野毒株和疫苗株提供高分辨率和快速分析(圖3)。臨床試驗(yàn)結(jié)果顯示248個(gè)臨床樣本中的26個(gè)樣本(10.5%)通過(guò)RT-PCR被鑒別為疫苗病毒。類似的結(jié)果在以前的研究實(shí)驗(yàn)中獲得，133個(gè)野外臨床分離樣品中的18個(gè)(13%)來(lái)源于疫苗免疫接種豬群，用多重巢式RT-PCR檢測(cè)顯示C株疫苗弱毒的存在。因此，在使用豬瘟活疫苗的國(guó)家，在常規(guī)豬瘟診斷程序中應(yīng)該考慮檢測(cè)到疫苗病毒的可能性。

為了僅能擴(kuò)增豬瘟病毒不同基因型而不擴(kuò)增出與之密切相關(guān)的2個(gè)其他瘟病毒(BVDV和BDV)，基于豬瘟病毒基因組保守區(qū)設(shè)計(jì)了2套簡(jiǎn)并引物。5個(gè)不同基因型的豬瘟病毒，包括158個(gè)野毒株豬瘟(2.1a，2.1b，2.2和3.4亞群)，ALD和CAP株(1.1亞群)以及5個(gè)兔化疫苗株(1.1亞群)能被擴(kuò)增，而且用這2套引物可以鑒別野毒株和疫苗株，而且沒有從其他瘟病毒（如BVDV-1,BVDV-2和BDV）為模板中觀察到擴(kuò)增產(chǎn)物，或者以其他常見豬病病毒（如PRRSV，PCV-2和SIV）為模板中觀察到擴(kuò)增產(chǎn)物。這表明所設(shè)計(jì)的RT-PCR引物是高特異性的。在敏感性試驗(yàn)中，RT-PCR的引物對(duì)C5/C6和C3/C6能夠各自在一個(gè)病毒滴度為6.3和63TCID50/mL時(shí)分別檢測(cè)豬瘟病毒野毒株。而且，C3/C6能夠被用作巢式PCR的內(nèi)源引物而獲得更高的靈敏度。該巢式PCR檢測(cè)限制提高到0.63TCID50/mL。野毒株實(shí)驗(yàn)感染的豬，在用RT-PCR檢測(cè)免疫接種后3d和用巢式PCR檢測(cè)免疫接種后2d的樣品時(shí)，被檢測(cè)出豬瘟病毒顯陽(yáng)性。該試驗(yàn)表明本方法是高靈敏的而且能檢測(cè)病毒早期感染。

基于單個(gè)核苷酸間差異設(shè)計(jì)特異的TaqManMGB探針，韓國(guó)建立一步法實(shí)時(shí)熒光RT-PCR用于檢測(cè)疫苗型和野毒株豬瘟病毒。韓國(guó)LOM弱毒疫苗株在233nt位置有一個(gè)T，但是韓國(guó)野毒株病毒和大多數(shù)豬瘟病毒在相同的位置有一個(gè)G。因此，通過(guò)特異的TaqManMGB探針可能鑒別它們。但是，兔化豬瘟疫苗株，例如LPC，HCLV，C株和RiemC，所有的都在233nt位置含有一個(gè)G，因此上述實(shí)時(shí)熒光RT-PCR似乎不適合用于鑒別野毒株和兔化弱毒疫苗株。另一研究報(bào)道基于在一個(gè)特異性引物的3′末端的2個(gè)核苷酸間差異(GT對(duì)AC)而建立的多重巢式PCR用于檢測(cè)和鑒別野毒株和C株。但是，LPC株和野毒株豬瘟病毒有相同的AC等位基因。因此，之前描述的這些引物似乎不適合用于鑒別LPC疫苗株和野毒株豬瘟病毒。最近亦有報(bào)道建立實(shí)時(shí)熒光定量多重RT-PCR用于檢測(cè)和鑒別野毒株與C株疫苗弱毒。然而，若干臺(tái)灣的野毒株(P97和0406/TWN)顯示探針序列內(nèi)存在多態(tài)性。因此，這些臺(tái)灣的野毒株很可能不能使用實(shí)時(shí)熒光定量多重RT-PCR檢測(cè)?，F(xiàn)有研究報(bào)道顯示，有7個(gè)疫苗株病毒基因組3′NTR具有12～14nt富含T的插入序列，同時(shí)沒有相關(guān)報(bào)道顯示野毒株基因組中存在這類插入序列。結(jié)果顯示，本試驗(yàn)所建立的RT-PCR技術(shù)至少能用于3個(gè)兔化弱毒疫苗株檢測(cè)，即LPC，HCLV和C株。RiemC疫苗株是一個(gè)適應(yīng)細(xì)胞培養(yǎng)的HCLV株衍生毒株。GenBank已有的三個(gè)RiemC疫苗株序列顯示富含T的插入序列區(qū)域存在差異。其中一個(gè)Riem疫苗株(U45477)缺乏富含T的插入序列；另外一個(gè)Riem疫苗株(AY259122)含有一個(gè)富含T的插入序列和一個(gè)缺失位點(diǎn)點(diǎn)；第三個(gè)Riem疫苗株(U45456)含有一個(gè)28bp富含T的插入序列(圖4)。因此，該檢測(cè)技術(shù)能否用于RiemC疫苗株檢測(cè)尚需進(jìn)一步研究。

本研究中發(fā)現(xiàn)LPC/PRK和LPC/TS株富含T的插入序列比之前報(bào)道的更長(zhǎng)。為了確定LPC/PRK和LPC/TS疫苗株富含T的插入序列的精確長(zhǎng)度，將這些疫苗株的RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物克隆制備質(zhì)粒并進(jìn)行測(cè)序工作。結(jié)果顯示LPC/PRK和LPC/TS株富含T的插入序列分別長(zhǎng)32～42nt和27～36nt。結(jié)合高效毛細(xì)管電泳分析的結(jié)果確定了最長(zhǎng)序列是它們基因組里富含T的插入序列，LPC/PRK 株是 42nt，LPC/TS 株是 36nt。我們?cè)?LPC/ 中國(guó)疫苗病毒的衍生毒株基因組中發(fā)現(xiàn)42nt與36nt兩個(gè)不同長(zhǎng)度的富含T的插入序列片段(圖4)。臺(tái)灣豬瘟兔化弱毒疫苗株最開始是在20世紀(jì)50年代研究生產(chǎn)的。在LEDERLE實(shí)驗(yàn)室里，在兔體中已經(jīng)歷大約250次連續(xù)傳代的一個(gè)兔化豬瘟病毒變異Rovac株由Coronel交給了Lee，1952年由Lee從菲律賓引入臺(tái)灣。由于這個(gè)變異株接種豬表現(xiàn)了嚴(yán)重的接種后反應(yīng)，而且甚至死于明顯的豬瘟，為了獲得一個(gè)安全的疫苗株，病毒需要通過(guò)兔體更長(zhǎng)的連續(xù)傳代。在超過(guò)800次傳代后，適應(yīng)兔體的病毒已經(jīng)完全失去了其毒力，而且變成一個(gè)保護(hù)豬瘟安全有效的疫苗。這個(gè)病毒被指定為L(zhǎng)PC株或LPC/中國(guó)株，而且種毒保存在動(dòng)物健康研究所(AHRI)中用于活疫苗的制造。LPC/TS疫苗株來(lái)源于LPC/中國(guó)疫苗株，經(jīng)過(guò)在PK-15(豬腎細(xì)胞)的10代細(xì)胞系適應(yīng)后在一個(gè)有限稀釋度克隆2次，隨后在該細(xì)胞系里增長(zhǎng)21代。為什么原始LPC/中國(guó)株含有一個(gè)長(zhǎng)12nt富含T的插入序列，但是它的衍生毒株LPC/TS含有一個(gè)長(zhǎng)36nt富含T的插入序列？追溯疫苗發(fā)展的過(guò)程，發(fā)現(xiàn)富含T的插入序列加入在有限稀釋克隆期間發(fā)生而不是在組織培養(yǎng)中連續(xù)傳代時(shí)發(fā)生的。LPC/PRK疫苗株一個(gè)長(zhǎng)42nt富含T的插入序列也是在有限稀釋克隆間獲得的。因?yàn)長(zhǎng)PC/中國(guó)疫苗病毒在兔體中經(jīng)歷了1050次連續(xù)傳代，沒有考慮疫苗病毒統(tǒng)一傳代次數(shù)問(wèn)題。事實(shí)上，疫苗含有幾個(gè)攜帶不同長(zhǎng)度富含T的插入序列的不同病毒顆粒。攜帶了長(zhǎng)為36nt、42nt富含T的插入序列、適應(yīng)組織培養(yǎng)的兩個(gè)兔化疫苗病毒，是在疫苗準(zhǔn)備期間意外被選擇的。LPC/TS株在PK-15細(xì)胞系中增值到107.3TCID50/mL，而且病毒滴度比生長(zhǎng)在PK-15細(xì)胞中LPC/中國(guó)株更高。富含T的插入序列的功能可能增加病毒滴度，以及使得有限稀釋的克隆篩選過(guò)程中更容易。

綜上所述，本研究所建立的簡(jiǎn)捷一步法RT-PCR，能夠提供一個(gè)快速、靈敏診斷技術(shù)用于特異性檢測(cè)豬瘟病毒，同時(shí)能夠鑒別野毒株感染和接種兔化弱毒疫苗株。