張曉君, 梁利國, 閻斌倫, 秦 蕾, 戚耀之

(淮海工學院 海洋學院, 江蘇省海洋生物技術重點建設實驗室, 江蘇 連云港 222005)

水產動物致病性副溶血弧菌雙重PCR檢測方法的研究

張曉君, 梁利國, 閻斌倫, 秦 蕾, 戚耀之

(淮海工學院 海洋學院, 江蘇省海洋生物技術重點建設實驗室, 江蘇 連云港 222005)

副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是多種水產養(yǎng)殖動物的主要病原菌, 尤其是可引起凡納濱對蝦幼蝦呈毀滅性死亡。本研究基于gyrB和toxR兩種基因序列設計2對特異性引物, 建立一種副溶血弧菌快速、準確的雙重PCR檢測方法, 擴增目的片段大小分別為285 bp和368 bp。結果表明在同一PCR反應體系中副溶血弧菌可同時擴增大小分別為285 bp和368 bp的2種基因片段, 兩種引物對4種其他水產動物病原菌無交叉反應; 敏感性檢測結果顯示, 該雙重 PCR最低能檢測 8.867 2×103CFU/mL菌體濃度的副溶血弧菌, 對副溶血弧菌模板DNA的檢出極限為0.029 3 mg/L; 對發(fā)病中國對蝦糠蝦幼體、水產品及蝦池養(yǎng)殖用水進行雙重PCR檢測, 呈陽性反應的樣品可分離出優(yōu)勢生長的副溶血弧菌。該實驗所建立的基于gyrB和toxR兩種基因的雙重PCR檢測方法可用于副溶血弧菌引起的水產動物疾病的快速診斷及分子流行病學的調查研究。

副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus); gyrB基因; toxR基因; 雙重PCR

副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)廣泛存在于世界各地近海岸的海水、海底沉積物及海生動物中, 該菌最早是于1950年藤野從日本大阪市發(fā)生的食物中毒病例分離, 之后世界許多國家如日本、中國、澳大利亞、印度、美國、越南、泰國、多哥、馬來西亞、新加坡、俄羅斯、巴拿馬、新西蘭、羅馬尼亞、墨西哥等均陸續(xù)報告了副溶血弧菌食物中毒或腸炎, 以日本和我國分布最廣、發(fā)病率最高, 該菌主要通過食物傳播, 最主要的是生食海產品, 此外, 該菌可引起多種水產動物(魚、蝦、蟹、貝等)的感染發(fā)病, 是一種人與水產養(yǎng)殖動物共染的病原菌。副溶血弧菌尤其是對凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)危害嚴重[1～3], 近年來多次引起江蘇贛榆縣養(yǎng)殖凡納濱對蝦幼蝦發(fā)生毀滅性死亡[4]。

副溶血弧菌傳統的檢驗方法包括形態(tài)學檢測、生理生化特征檢測和血清學鑒定等, 這些檢測手段不僅工作量大, 而且耗時長, 已遠遠不能滿足水產養(yǎng)殖生產上的診斷要求。因此選擇合適的分子靶標, 研究開發(fā)靈敏度高、特異性強的病原副溶血弧菌快速檢測方法已十分重要, 在水產養(yǎng)殖動物處于帶菌狀態(tài)或大規(guī)模爆發(fā)細菌性疾病之前能進行準確的檢測, 這是傳統方法無法比擬的。尤其是多種不同基因綜合檢測以進一步提高其準確性和特異性, 將為副溶血弧菌引起的水產動物疾病的監(jiān)測及其控制奠定良好的基礎。gyrB基因編碼的是唯一一種能誘導 DNA負超螺旋的拓撲異構酶—DNA促旋酶的 B亞單位蛋白, Yamamoto等1995年設計出通用引物可從許多革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細菌成功擴增出gyrB基因, 特別適合作為分子靶標進行細菌種間鑒別[5], gyrB 基因是副溶血弧菌DNA復制所必需的, 具有副溶血弧菌種特異性, 而且為單拷貝基因, 具設計 PCR引物的保守區(qū)域[6]。toxR基因廣泛分布于弧菌科細菌, 該基因最先是在霍亂弧菌中發(fā)現[7], 由它編碼的跨膜轉錄調控蛋白 toxR參與調控霍亂弧菌的一些主要毒力基因和外膜蛋白的表達[8]。目前 toxR基因已在副溶血弧菌[9]、創(chuàng)傷弧菌(Vibrio vulnificus)[10]、鰻弧菌(Vibrio anguillarum)[11]等很多弧菌中發(fā)現, 同時異種之間的toxR基因核苷酸序列相似性較低, 是弧菌科種間鑒定的良好分子靶標, toxR基因可在種的水平上檢測副溶血弧菌。作者報告了以編碼gyrB和編碼toxR的兩種基因為靶基因建立了快速檢測病原副溶血弧菌的雙重PCR方法, 通過特異性試驗、敏感度試驗、應用性試驗證實該方法特異性好、靈敏度高、穩(wěn)定性好、檢測耗時短, 是快速檢測副溶血弧菌的有效方法, 以期為相應疾病的診斷及流行病學研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 供試菌株來源

供試副溶血弧菌分離自江蘇連云港贛榆縣發(fā)病凡納濱對蝦幼蝦, 供試對照鰻弧菌(Vibrio anguil-larum)、哈氏弧菌(Vibrio harveyi)、美人魚發(fā)光桿菌即美人魚弧菌(Vibrio damsela)及愛德華氏菌(Edwardsiella tarda)均分離自海水魚, 已通過表型及分子鑒定[12～15], 本實驗室保存供用, 菌株編號及在GenBank 登錄號見表1。

表1 供試菌株及其來源Tab. 1 Origin and species of tested bacteria

1.2 細菌模板DNA的制備

試驗所需細菌模板DNA按細菌基因組DNA抽提試劑盒及煮沸兩種方法提取。細菌基因組DNA抽提試劑盒法： 取純培養(yǎng)菌分別接種于含鹽 1%的 LB肉湯中28℃培養(yǎng)16 h, 按上海賽百盛基因技術有限公司生產的小量細菌基因組DNA抽提試劑盒所述方法提取DNA, 作為PCR模板。煮沸法： 取1 mL菌液離心1 min(12 000 r/min), 棄上清, 將菌體懸浮于100 μL的滅菌蒸餾水中, 100℃煮沸10 min, 冰浴中冷卻后離心10 min(12 000 r/min), 取上清作為PCR模板。

1.3 引物設計與合成

以gyrB基因為靶基因設計副溶血弧菌的特異性檢測引物： VP-1： CGGCGTGGGTGTTTCGGTAGT;VP-2r： TCCGCTTCGCGCTCATCAATA[6]。以toxR基因為靶基因設計副溶血弧菌的特異性檢測引物：vp-toxR-F： GTCTTCTGACGCAATCGTTG; vp-toxRR： ATACGAGTGGTTGCTGTCATG[16]。兩對引物均由上海生物工程技術公司合成。

1.4 PCR各反應條件的優(yōu)化及電泳分析

以gyrB和toxR兩種基因設計的引物分別對模板進行單一擴增; 在同一次 PCR反應中, 應用同一個PCR反應程序, 用上述兩種引物同步對模板進行擴增。對PCR各循環(huán)參數和各引物濃度等進行優(yōu)化, 篩選出單一PCR及雙重PCR反應中最佳反應模式。

PCR擴增后的產物, 用1.2%瓊脂糖凝膠在80V電壓下電泳 45 min, 用凝膠成像系統觀察并拍照記錄。

1.5 雙重PCR反應的特異性檢測

以鰻弧菌、哈氏弧菌、美人魚弧菌及愛德華氏菌為對照菌株, 按上述優(yōu)化的反應條件進行 PCR擴增, 分別進行上述2對引物雙重PCR的特異性檢驗。對陽性結果進行不加模板和不加引物的陰性對照檢測。

1.6 PCR反應的靈敏性檢測

分別從菌液稀釋以及模板DNA稀釋兩方面來檢測方法的靈敏性。

菌液稀釋： 將濃度約為 4.54×108CFU/mL 的副溶血弧菌培養(yǎng)物, 用滅菌雙蒸水進行系列稀釋(前 3管為10倍稀釋, 第4至第13管為2倍稀釋), 菌液稀釋為(保留小數點后 4 位)： 4.54×108、4.54×107、4.54×106、2.27×106, 1.135×106, 5.675×105, 2.837 5×105, 1.418 8×105, 7.093 8×104, 3.546 9×104, 1.773 4×104, 8.867 2×103, 4.433 6×103CFU/mL, 共 13 個稀釋倍數, 按1.2所述煮沸法, 取1 mL菌液提取DNA作為PCR模板進行檢測。同時進行不加模板和不加引物的陰性對照檢測。

模板DNA稀釋： 小量細菌基因組DNA抽提試劑盒提取的副溶血弧菌基因組DNA, 從60 mg/L起2倍連續(xù)稀釋為： 60、30、15、7.5、3.75、1.875、0.937 5、0.468 8、0.234 4、0.117 2、0.058 6、0.029 3、0.014 6 mg/L, 共 13個稀釋倍數, 按上述方法進行 PCR檢測。同時進行不加模板和不加引物的陰性對照檢測。

1.7 雙重PCR檢測的應用

取連云港贛榆縣育苗場發(fā)病中國對蝦糠蝦幼體及養(yǎng)殖用水, 采取市場水產品(扇貝、雜色蛤、縊蟶、中國對蝦、玉螺、毛蚶)并勻漿, 均用營養(yǎng)肉湯增菌培養(yǎng)6 h, 增菌液煮沸法提取DNA并進行PCR擴增。PCR檢測陽性樣品按常規(guī)方法進行細菌分離及表型與分子檢測。

2 結果

2.1 單一及雙重PCR檢測方法的確定

通過對不同反應條件下 DNA擴增結果的比較,確定了副溶血弧菌的最佳PCR模式。

以gyrB基因為靶基因檢測 PCR反應條件為：94℃預變性3 min, 接 94℃變性 20 s、52℃復性 20 s、72℃延伸15 s、35個循環(huán), 然后72℃溫育5 min; 在20 μL 反應體系中含有： 水 13.4 μL, 10×PCR 緩沖液2 μL, MgCl2(25 mmol/L)1.6 μL, 4×dNTP 混合物0.4 μL, 引物各 0.2 μL, Taq DNA 聚合酶(5 U/μL)0.2 μL, 模板 DNA 2 μL。

以toxR基因為靶基因檢測 PCR反應條件為：94℃預變性 3 min, 接 94℃變性 1 min、58℃復性1 min、72℃延伸1 min、30個循環(huán), 然后72℃溫育7 min; 在20 μL反應體系中含有： 水 13.4 μL, 10×PCR緩沖液 2 μL, MgCl2(25 mmol/L)1.6 μL, 4×dNTP 混合物 0.4 μL, 引物各 0.2 μL, Taq DNA 聚合酶(5 U/μL)0.2 μL, 模板 DNA 2 μL。

以gyrB和toxR基因為靶基因同步檢測的PCR反應條件為： 94℃預變性3 min, 接94℃變性1 min、57℃復性1 min、72℃延伸1 min、30個循環(huán), 然后72℃溫育 7 min。在 40 μL反應體系中含有： 水 28.6 μL,10×PCR 緩沖液 4 μL, MgCl2(25 mmol/L)3.2 μL,4×dNTP 混合物 0.8 μL, 引物各 0.5 μL, Taq DNA 聚合酶(5 U/μL)0.4 μL, 模板 DNA 2 μL。

2.2 單一及雙重PCR特異性擴增結果

應用上述程序對副溶血弧菌和其他海水魚類病原菌基因組DNA(細菌基因組DNA抽提試劑盒提取)分別進行單一及雙重 PCR 擴增, 結果以gyrB基因為靶基因擴增, 副溶血弧菌株只擴增出285 bp一條帶; 以toxR基因為靶基因擴增, 副溶血弧菌株只擴增出368 bp一條帶; 以gyrB和toxR基因為靶基因同步擴增, 副溶血弧菌株擴增出285 bp和368 bp二條帶, 而其他4種海水魚類病原菌(鰻弧菌、哈氏弧菌、美人魚弧菌及愛德華氏菌)均未出現任何擴增條帶(圖1)。表明本實驗建立的副溶血弧菌PCR檢測方法具有很強的特異性。

圖1 副溶血弧菌單一及雙重PCR特異性試驗檢測結果Fig. 1 Specificity of single-dulplex PCR for detection of V.parahaemolyticusM. DL2000; 1.gyrB基因擴增片段; 2.toxR基因擴增片段; 3. gyrB和toxR基因同步擴增片段; 4～7. 4種病原弧菌對照M. DL2000; 1. amplified fragment of gyrB; 2. amplified fragment of toxR; 3. simultaneous amplified fragments of gyrB and toxR; 4～7.control of four pathogenic Vibrio sp.

2.3 菌液稀釋雙重PCR檢測的靈敏度

10倍系列稀釋菌液按 1.2所述方法煮沸提取DNA, 按2.1優(yōu)化出的雙重PCR反應條件進行檢測,結果表明在40 μL反應體系中, 模板DNA加入2 μL,菌 體 濃 度 自 4.54×108CFU/mL 至 1.773 4×104CFU/mL均可擴增出清晰條帶, 菌體濃度為8.867 2×103CFU/mL擴增條帶較暗, 菌體濃度為4.433 6×103CFU/mL未擴增出條帶(圖 2), 表明本實驗建立的雙重PCR方法檢測副溶血弧菌菌體靈敏度為8.867 2×103CFU/mL。

圖2 副溶血弧菌菌液稀釋法雙重PCR敏感性檢測結果Fig. 2 Sensitivity of dulplex PCR for detection of V. parahaemolyticus dilutionM.DL2000; 1～13.雙重 PCR 擴增片段(菌液系列稀釋： 依次為4.54×108～4.4336×103CFU/mL)M. DL2000; 1～13. amplified fragments of dulplex PCR (V. parahaemolyticus serially diluted from 4.54×108～4.4336×103 CFU/mL)

2.4 模板 DNA稀釋雙重 PCR檢測的靈敏度

細菌基因組DNA抽提試劑盒提取的DNA 2倍系列稀釋后作模板, 按2.1優(yōu)化出的雙重PCR反應條件進行檢測, 結果表明在 40 μL反應體系中, 模板DNA 加入 2 μL(質量濃度 60～0.014 6 mg/ L), 副溶血弧菌基因組DNA質量濃度在60～0.1172 mg/L 的范圍均可擴增出明亮條帶, 基因組 DNA質量濃度在0.058 6 mg/L 和0.029 3 mg/L 擴增條帶較暗淡, 基因組DNA質量濃度在0.014 6 mg/L 無擴增條帶(圖3), 表明本實驗建立的雙重 PCR方法對副溶血弧菌模板DNA的檢出靈敏度為0.029 3 mg/L 。

圖3 副溶血弧菌模板DNA稀釋法雙重PCR敏感性檢測結果Fig. 3 Sensitivity of dulplex PCR for detection of V. parahaemolyticus dilutionM. DL2000; 1～13.雙重PCR擴增片段(模板DNA 2倍系列稀釋：依次為60～0.014 6 mg/L)M. DL2000; 1～13. amplified fragments of dulplex PCR (purified chromosomal DNA of V. parahaemolyticus serially diluted 2-fold from 60～0.014 6 mg/L)

2.5 雙重PCR檢測病蝦及水產品的實驗結果

對發(fā)病中國對蝦糠蝦幼體、水產品及蝦池養(yǎng)殖用水進行副溶血弧菌雙重 PCR檢測, 共 8份樣品,其中發(fā)病中國對蝦糠蝦幼體檢測結果為陽性, 其余均為陰性(圖 4)。陽性樣品(發(fā)病中國對蝦糠蝦幼體)經細菌分離、形態(tài)及理化特性等表型生物學特性、16S rRNA與gyrB基因的分子檢測, 表明分離自發(fā)病中國對蝦糠蝦幼體的優(yōu)勢生長菌為弧菌屬的副溶血弧菌。

3 討論

傳統的副溶血弧菌檢測方法需做分離培養(yǎng)、形態(tài)學及多項生理生化特征檢驗, 方法繁瑣、耗時長,不能滿足快速、準確檢測的現實需要。由于副溶血弧菌具有多種表型、血清型[17]和產毒型菌株[18,19],因此針對溶血素設計的引物和探針不能同時檢測所有的致病性菌株[20,21], 本試驗是根據副溶血弧菌的gyrB和toxR兩種基因序列設計2對特異性引物, 通過進行雙重 PCR反應體系及反應條件優(yōu)化, 雙重PCR的特異性和敏感性實驗, 建立了一種副溶血弧菌快速、準確的雙重 PCR檢測方法, 以進一步提高檢測的準確性和特異性。

圖4 糠蝦幼體及水產品的雙重PCR檢測結果Fig. 4 Results of dulplex PCR for detection of V. parahaemolyticus from diseased shrimps and aquatic productsM.DL2000; 1.毛蚶; 2.扇貝; 3.糠蝦幼體; 4.雜色蛤; 5.縊蟶; 6.中國對蝦; 7.玉螺; 8.養(yǎng)殖用水; 9.未增菌糠蝦幼體M.DL2000; 1. Scapharca subcrenata; 2. Argopectens irradias;3. mysis; 4. Ruditapes philippinarum; 5. Sinonovacula constricta;6. Fenneropenaeus chinensis; 7. Neverita; 8. agricultural water;9. bacterial no-enrichment mysis

多重PCR的反應條件將顯著影響反應的可行性,在該雙重 PCR反應體系中, 兩個 PCR片段分別為285bp和368bp, 通過對引物用量和PCR擴增條件優(yōu)化, 二種引物的最佳工作濃度為0.125 mmol/L, 最佳退火溫度為57℃。說明了要使多重PCR反應體系中每一目的片段都得到最佳擴增結果, 適當的引物濃度是十分重要的, PCR最重要的循環(huán)參數是退火溫度, 退火溫度即使有輕微的變化也會影響多重 PCR反應的效果, 本實驗在退火溫度為58℃時, 285 bp條帶擴增不出, 退火溫度為56.5℃時, 368 bp條帶擴增不出, 退火溫度為57℃時, 2條目的基因擴增條帶均較為清晰,多重PCR擴增效率最佳。

單一及雙重 PCR的特異性試驗結果表明, 僅對所檢測的副溶血弧菌可擴增出大小分別為285 bp和368 bp的 2個基因片段, 對水產動物其他病原細菌(鰻弧菌、哈氏弧菌、美人魚弧菌及愛德華氏菌)的檢測均呈陰性反應, 說明設計的引物對病原副溶血弧菌具有良好的特異性, 該方法可用于副溶血弧菌引起的疾病的診斷及分子流行病學調查。

本實驗從菌體濃度及DNA濃度兩方面進行了雙重 PCR靈敏度檢測, 結果顯示, 該試驗所設計的 2對特異性引物及PCR檢測方法對病原副溶血弧菌的菌體濃度檢出極限為 8.867 2×103CFU/mL, 對模板DNA的檢測靈敏度為0.029 3 mg/L, 結果顯示兩方面的檢測結果有一定差異, 可能原因是, 菌體濃度計算采用菌落計數方法, 該方法菌體計數具有一定誤差。有關水產動物病原細菌PCR靈敏度檢測已多有記述, 余俊紅等[22]報道用PCR方法檢測花鱸感染鰻弧菌的靈敏度為5×10-4mg/L, 張鳳萍等[23]報道用PCR方法檢測刺參腐皮綜合征病原燦爛的靈敏度為0.5 μg/L, 繞靜靜等[24]報道用多重 PCR檢測致病性嗜水氣單胞菌靈敏度為 10 mg/L , 本試驗建立的雙重 PCR方法, 其靈敏度能夠滿足臨床副溶血弧菌株檢測的需要。

[1] 周永燦, 張木, 陳學芬, 等. 養(yǎng)殖對蝦細菌性紅體病的初步研究[J]. 海洋科學, 2003, 27 (5)： 61-65.

[2] 樊景鳳, 宋立超, 王斌, 等. 一株引起凡納濱對蝦紅體病的病原菌—副溶血弧菌的初步研究[J]. 海洋科學, 2006, 30(4)： 40-44.

[3] 沈文英, 陽會軍, 尹軍霞. 南美白對蝦的病害及防治研究現狀[J]. 水利漁業(yè), 2004, 24 (1)： 58-60.

[4] 張曉君, 陳翠珍, 閻斌倫, 等. 凡納濱對蝦病原副溶血弧菌的表型及分子特征[J]. 海洋與湖沼, 2009,40(5)： 654-661.

[5] Yamamoto S, Harayama S. PCR amplification and direct sequencing of gyrB genes with universal primers and their application to the detection and taxomonic analysis of Pseudomonas putida strains[J]. Applied and Environmental Microbiology, 1995, 61(3)：1 104-1 109.

[6] Venkateswaran K, Dohmoto N, Harayama S. Cloning and nucleotide sequence of the gyrB gene of Vibrio parahaemolyticus and its application in detection of this pathogen in shrimp[J]. Applied and Environmental Microbiology, 1998, 64(2)： 681-687.

[7] Miller V L, Mekalanos J J. Synthesis of cholera toxin is positively regulated at the transcriptional level by toxR[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 1984, 81 (11)： 3 471-3 475.

[8] Miller V L, Mekalanos J J. A novel suicide vector and its use in construction of insertion mutations： osmoregulation of outer membrane proteins and virulence determinants in Vibrio cholerae requires toxR[J].Journal of Bacteriology, 1988, 170 (6)： 2 575-2 583.

[9] Lin Z, Kumagai K, Baba K, et al. Vibrio parahaemolyticus has a homolog of the Vibrio cholerae toxRS operon that mediates environmentally induced regulation of the thermostable direct hemolysin gene[J]. Journal of Bacteriology, 1993, 175 (12)： 3 844-3 855.

[10] Lee S E, Shin S H, Kim S Y, et al. Vibrio vulnificus has the transmembrane transcription activator toxRS stimulating the expression of the hemolysin gene vvhA[J].Journal of Bacteriology, 2000, 182 (12)： 3 405-3 415.

[11] Okuda J, Nakai T, Chang P S, et al. The toxR gene of Vibrio (Listonella) anguillarum controls expression of the major outer membrane proteins but not virulence in a natural host model[J]. Infection and Immunity, 2001,69 (10)： 6 091-6 101.

[12] 張曉君, 秦國民, 閻斌倫, 等. 半滑舌鰨病原鰻利斯頓氏菌表型及分子特征研究[J]. 海洋學報, 2009,31(5)： 1-11.

[13] 張曉君, 秦國民, 陳翠珍, 等. 龍膽石斑魚源美人魚發(fā)光桿菌的生物學特性與系統發(fā)育學分析[J].漁業(yè)科學進展, 2009, 30(3)： 38-43.

[14] 張曉君, 房海, 陳翠珍, 等. 致病性哈氏弧菌生物學及分子特征[J]. 中國獸醫(yī)學報, 2009, 29(9)： 1 120-1 124.

[15] 陳翠珍, 房海, 張曉君, 等. 牙鲆與大菱鲆病原遲鈍愛德華氏菌生物學特性及系統發(fā)育分析[J]. 高技術通訊, 2005, 15(10)： 82-88.

[16] Kim Y B, Okuda J, Matsumoto C, et al. Identification of Vibrio parahaemolyticus strains at the species level by PCR targeted to the toxR gene[J]. Jonurnal of Clinical Microbiology, 1999, 37, 1 173-1 177.

[17] Venkateswaran K, Kurusu T, Satake M, et al. Comparison of a fluorogenic assay with a conventional method for rapid detection of Vibrio parahaemolyticus in seafoods[J]. Applied and Environmental Microbiology, 1996, 62： 3 516-3 520.

[18] Baba K, Shirai H, Terai A, et al. Analysis of the tdh gene cloned from a tdh gene- and trh gene-positive strain of Vibrio parahaemolyticus[J]. Microbiology and Immunology, 1991, 35： 253-258.

[19] Honda T, Iida T. The pathogenicity of Vibrio parahaemolyticus and the role of the thermostable direct hemolysin and related hemolysins[J]. Reviews in Medical Microbiology, 1993, 4：106-113.

[20] Nishibuchi M, Doke S, Toizumi S, et al. Isolation from a coastal fish of Vibrio hollisae capable of producing a hemolysin similar to the thermostable direct hemolysin of Vibrio parahaemolyticus[J]. Applied and Environmental Microbiology, 1988, 54： 2 144-2 146.

[21] Nishibuchi M, Khaemomanee V I, Honda T, et al. Comparative analysis of the hemolysin genes Vibrio cholerae non-O1, Vibrio mimicus, and Vibrio hollisae are similar to the tdh gene of Vibrio parahaemolyticus[J]. FEMS Microbiology Letters, 1990, 55： 251-256.

[22] 余俊紅, 陳吉祥, 厲 云, 等. 聚合酶鏈反應(PCR)檢測花鱸鰻弧菌感染[J]. 黃渤海海洋, 2002, 20(2)：60-64.

[23] 張鳳萍, 王印庚, 李勝忠, 等. 應用PCR方法檢測刺參腐皮綜合征病原-燦爛弧菌[J]. 海洋水產研究,2008, 29(5)： 100-106.

[24] 繞靜靜, 李壽菘, 黃克和, 等.致病性嗜水氣單胞菌多重 PCR檢測方法的建立[J]. 中國水產科學, 2007,14(5)： 749-755.

Detection of pathogenic Vibrio parahaemolyticus isolated from aquatic animals by dulplex PCR

ZHANG Xiao-jun, LIANG Li-guo, YAN Bin-lun, QIN Lei, QI Yao-zhi
(College of Ocean, Key Laboratory of Oceanic Biotechnology of Jiangsu, Huaihai Institute of Technology,Lianyungang 222005, China)

Dec., 4, 2009

Vibrio parahaemolyticus; gyrB gene; toxR gene; dulplex PCR

V. parahaemolyticus is a significant pathogen for the aquaculture industry, particularly devastating impact on cultivated Litopenaeus vannamei. In this study, two pair of specific primers was designed that allowed amplification of 285 bp and 368bp gene fragments based on gyrB and toxR genes. A simple dulplex polymerase chain reaction (PCR) that will detect V. parahaemolyticus were established. Consequently, two PCR primers could simultaneously amplify 285 bp and 368bp gene fragments from chromosomal DNA of V. parahaemolyticus in one PCR reaction, and no cross reaction was detected in 4 other pathogenic Vibrio species tested. The results of sensitivity of dulplex PCR showed that the two primers could detect V. parahaemolyticus at a level of as few as 8.8672×103CFU/mL, and detect purified chromosomal DNA at a level of as few as 0.0293 mg/L . Dominant V.parahaemolyticus could be isolated from the positive sample of dulplex PCR through detecting mysis, aquatic products and tank water samples. The PCR protocol amplifying gyrB and toxR gene fragments of the V. parahaemolyticus was established and could be useful in the specific and rapid diagnose of the disease caused by V.parahaemolyticus.

S941

A

1000-3096(2010)10-0007-06

2009-12-04;

2010-01-11

江蘇省水產三項工程項目(PJ2010-58); 江蘇省自然科學基金項目(BK2009163); 淮海工學院江蘇省海洋生物技術重點建設實驗室研究基金項目(2008HS016)

張曉君(1969-), 河北秦皇島人, 教授, 博士, 電話：0518-85895251, E-mail： zxj9307@163.com

(本文編輯： 梁德海)