徐敬明

(重慶文理學(xué)院 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院, 重慶 永川 402168)

中國沿海10種方蟹16S rRNA基因序列分析及系統(tǒng)發(fā)育研究

徐敬明

(重慶文理學(xué)院 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院, 重慶 永川 402168)

中國沿海10種方蟹線粒體16S rRNA基因部分片段的序列長度為517 bp～533 bp。它們的核苷酸序列A、T、G、C的含量相似, A+T的含量(69.8%～76.0%)明顯高于G+C的含量; 10種方蟹的16S rRNA基因序列比對獲得541 bp的同源序列(含插入/缺失位點), 除插入/缺失位點外共檢測到146個變異位點, 其中81個為簡約信息位點。4種厚蟹與2種近方蟹的遺傳距離(0.054～0.085)都顯著小于與其他方蟹之間的遺傳距離, 甚至明顯小于與4種厚蟹原本屬于同一相手蟹科的2種相手蟹之間的遺傳距離(0.105～0.155); 而基于16S rRNA基因片段序列采用NJ法構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)也顯示, 原本屬于相手蟹科的側(cè)足厚蟹、天津厚蟹、日本仿厚蟹和伍氏仿厚蟹沒有與 2種相手蟹聚為一支, 而是最終與屬于弓蟹科的2種近方蟹聚為一大支, 且有高達(dá)99%的支持率。結(jié)果表明, 4種厚蟹與2種近方蟹的親緣關(guān)系相對較近, 而與2種相手蟹等其他方蟹的親緣關(guān)系則相對較遠(yuǎn)。因此, 研究結(jié)果支持將4種厚蟹從相手蟹科移到弓蟹科。此外, 屬于相手蟹科的 2種相手蟹聚為一支, 屬于方蟹科的白紋方蟹和屬于斜紋蟹科的瘤突斜紋蟹又各自成為一支; 表明 16S rRNA基因的分子數(shù)據(jù)支持其形態(tài)學(xué)分類結(jié)果的正確性, 提示上述4科蟹類可能分別為單系。

方蟹; 16S rRNA; 序列; 系統(tǒng)發(fā)生

方蟹是我國沿海常見的具有一定經(jīng)濟(jì)價值的蟹類, 隸屬于甲殼綱(Crustacea)、十足目(Decapoda)、方蟹科(Grapsidae), 該科又分為方蟹亞科(Grapsinae)、弓蟹亞科(Varuninae)、相手蟹亞科(Sesarminae)和斜紋蟹亞科(Plagusiinae)[1]。近來, 一些學(xué)者根據(jù)幼體形態(tài)學(xué)和分子系統(tǒng)學(xué)的研究而將方蟹科提升為方蟹總科(Grapsoidea), 其中包括原方蟹科中的 4個亞科被提升為科的方蟹科(Grapsidae)、相手蟹科(Sesarmidae)、弓蟹科(Varunidae)和斜紋蟹科(Plagusiidae)以及地蟹科(Gecarcinidae)和 2001年新建立的雕刻方蟹科(Glyptograpsidae); 并將厚蟹屬(Helice)等蟹類從相手蟹科移到弓蟹科[2～6]。

動物線粒體 DNA(mtDNA)因其分子量小、母系遺傳、比核DNA進(jìn)化速率快等特征而廣泛地應(yīng)用于進(jìn)化生物學(xué)研究中; 而mtDNA 16S rRNA基因有較高的保守性, 易于進(jìn)行 PCR引物的設(shè)計和擴(kuò)增, 非常適合于種及其以上分類階元的差異研究[7,8]。16S rRNA基因序列已被廣泛用于蟹類的分子系統(tǒng)學(xué)研究[9～14], 已有一些學(xué)者基于16S rRNA基因序列分別對美國、日本等地的部分方蟹進(jìn)行了分子系統(tǒng)學(xué)分析[2～4,15]。

本研究采用線粒體 16S rRNA基因作為分子標(biāo)記, 對產(chǎn)于中國沿海的10種方蟹進(jìn)行了序列測定和分子系統(tǒng)關(guān)系分析, 探討它們之間的遺傳差異及親緣關(guān)系, 以期為蟹類的種質(zhì)鑒定、物種保護(hù)和資源評價提供基礎(chǔ)的分子遺傳學(xué)資料, 為進(jìn)一步研究蟹類分子系統(tǒng)學(xué)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗所用標(biāo)本(包括紅螯相手蟹和褶痕相手蟹[16])的采集地點、數(shù)量及時間等信息見表1。標(biāo)本浸泡于95%乙醇或保存于-40℃冰箱中備用。

1.2 DNA提取

從蟹類的步足和螯足中取約 50 mg肌肉, 采用傳統(tǒng)法(酚/氯仿抽提法)從肌肉組織中提取基因組DNA。將乙醇沉淀后DNA溶解入40 μL超純水, 放入4 ℃冰箱6 h, 最后-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 測序用蟹類取樣信息Tab. 1 Crabs used in sequence analysis of mitochondrial 16S rRNA gene

1.3 PCR擴(kuò)增

以 L2510 5′-CGCCTGTTTAACAAAAACAT-3′和 H3059 5′-CCGGTCTGAACTCAGATCATGT-3′為引物對16S rRNA部分片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增[17]。擴(kuò)增時的反應(yīng)體積為 25 μL, 反應(yīng)液中含 2.5 μL 10× PCR buffer, 2.0 μL dNTPs(2.5 mmol/L), 2.0 μL MgCl2(25 mmol/L), 1 μL 模板 DNA, 引物各 0.5 μL(10 μmol/L),0.2 μLTaq酶(5 U/μL), 無菌去離子水補(bǔ)足到 25 μL。PCR循環(huán)參數(shù)為： 94℃預(yù)變性1.5 min后, 94 ℃變性30 s, 49 ℃退火45 s, 72 ℃延伸1 min, 循環(huán)39次, 然后在72℃延伸5 min, 于4 ℃保存。

1.4 序列測定

PCR產(chǎn)物用含有溴化乙錠的1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測, 凝膠成像系統(tǒng)觀察、照相。對于擴(kuò)增效果良好的樣品進(jìn)行回收, 回收時用 1.0%瓊脂糖凝膠, Ta-KaRa Agarose Gel DNA Purification Kit(寶生物工程(大連)有限公司)進(jìn)行回收和純化, 純化產(chǎn)物送至上海英駿測序公司, 用ABI3730XL測序儀進(jìn)行正反鏈雙向測序。測序所用引物和PCR擴(kuò)增時的引物相同。

1.5 數(shù)據(jù)分析

首先仔細(xì)核對測序膠圖, 所有序列均由DNASTAR軟件包(DNASTAR, Inc., Madison, USA)進(jìn)行編輯、校對和比對, 并對排序結(jié)果進(jìn)行分析; 所有序列為兩端去引物后的序列。用DNASP軟件檢測變異位點數(shù)(Variable sites)、簡約信息位點數(shù)(Parsimony informative sites)。用 MEGA(Version4.0)軟件統(tǒng)計序列的堿基組成, 計算種間的遺傳距離,進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)生和分子進(jìn)化分析。所有序列之間基于Kimura-雙參數(shù)距離模型估計其遺傳距離; 用 NJ法(Neighbor-Joining)構(gòu)建分子系統(tǒng)發(fā)生樹,系統(tǒng)樹各結(jié)點的支持率以序列數(shù)據(jù)集 1 000次重復(fù)抽樣檢驗的自引導(dǎo)值(Bootstrap value)表示, 各分支上的數(shù)字為重抽樣分析得到的大于50%的支持率。

2 結(jié)果

對表1中除紅螯相手蟹和褶痕相手蟹[16]之外的9種蟹類的線粒體16S rRNA基因片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增和序列測定。每種蟹類的 3個不同個體之間序列沒有差異。它們的序列長度、堿基組成和GenBank登錄號分別見表2。由表2可見, 10種方蟹的A、T、G、C含量只有略微的差異, 表現(xiàn)為與其他蟹類相同的特點[2,14], 即 A+T含量(69.8%～76.0%)明顯高于G+C含量。

10種方蟹的16S rRNA基因序列比對獲得541 bp的同源序列(含插入/缺失位點), 除插入/缺失位點外共檢測到146個變異位點, 其中81個為簡約信息位點。

利用Kimura-雙參數(shù)法計算得到了10種方蟹種間的遺傳距離(表3)。遺傳距離顯示, 2種厚蟹和2種仿厚蟹與2種近方蟹的遺傳距離為0.054～0.085, 都顯著的小于與其他方蟹之間的遺傳距離。

以寬身大眼蟹(DLA)為外群, 基于16S rRNA基因片段序列采用NJ法構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)顯示(圖 1)： 側(cè)足厚蟹和天津厚蟹, 日本仿厚蟹和伍氏仿厚蟹首先各自聚到一起成為兩個分支, 然后二者聚到一起成為一支, 再與弓蟹科的肉球近方蟹和絨螯近方蟹聚為一支, 支持率高達(dá) 99%; 但厚蟹在形態(tài)分類上原本屬于相手蟹科。此外, 2種相手蟹聚為一支, 屬于相手蟹科; 白紋方蟹和瘤突斜紋蟹各自成為一支, 分別屬于方蟹科和斜紋蟹科。

表3 10種方蟹之間的遺傳距離Tab. 3 Interspecific genetic distances among ten Grapsoidea species

3 討論

Schubart等[3]研究了Helice crassamtDNA的16S rRNA部分序列, 結(jié)果顯示其與弓蟹科蟹類的親緣關(guān)系最近, 建議將其從相手蟹科移到弓蟹科; Kitaura等[4]研究了三齒厚蟹(H. tridens)mtDNA的16S rRNA全序列, 孫紅英等[5]研究了天津厚蟹(Helice tientsinensis)mtDNA的 16S rRNA部分序列, 以及Schubart 等[15]研究了短螯厚蟹(H. leachii)mtDNA的12S rRNA和16S rRNA部分序列, 研究結(jié)果分別支持將天津厚蟹、三齒厚蟹和短螯厚蟹從相手蟹科移到弓蟹科。

圖1 10種方蟹及外群16S rRNA基因序列NJ系統(tǒng)樹Fig. 1 Neighbor-Joining tree for 16S rRNA gene of ten Grapsoidea species and outgroup

上述研究均僅通過對某一種厚蟹的研究來探討厚蟹的分類地位。而本研究的所有4種厚蟹與2種近方蟹的遺傳距離(0.054～0.085)都顯著的小于與其他方蟹之間的遺傳距離, 特別是 4種厚蟹與原本屬于同一相手蟹科的 2種相手蟹之間的遺傳距離達(dá)到了0.105～0.155(表3); 而基于16S rRNA基因片段序列采用 NJ法構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)(圖 1)也顯示, 原本屬于相手蟹科的側(cè)足厚蟹、天津厚蟹、日本仿厚蟹和伍氏仿厚蟹沒有與2種相手蟹聚為一支,而是最終與屬于弓蟹科的 2種近方蟹聚為一大支,且有高達(dá) 99%的支持率。此結(jié)果表明 4種厚蟹與 2種近方蟹的親緣關(guān)系相對較近, 而與 2種相手蟹等其他方蟹的親緣關(guān)系則相對較遠(yuǎn)。因此, 本研究結(jié)果支持將 4種厚蟹從相手蟹科移到弓蟹科, 從而進(jìn)一步明確了厚蟹的分類地位。從形態(tài)上來看, 厚蟹等蟹類的雄性生殖孔的位置與弓蟹科蟹類胸孔的位置相一致; 而厚蟹等蟹類從 狀幼體到大眼幼體的形態(tài)特征亦與弓蟹科蟹類相一致[3]。因此, 形態(tài)學(xué)的有關(guān)特征亦支持將厚蟹從相手蟹科移到弓蟹科。

此外, 屬于相手蟹科的2種相手蟹聚為一支, 屬于方蟹科的白紋方蟹和屬于斜紋蟹科的瘤突斜紋蟹又各自成為一支; 表明16S rRNA基因的分子數(shù)據(jù)支持其形態(tài)學(xué)分類結(jié)果的正確性[6], 提示上述4科蟹類可能分別為單系, 但這還有待于對這些科的更多蟹類進(jìn)行相關(guān)研究后才能確定。

[1] 戴愛云, 楊思諒, 宋玉枝, 等. 中國海洋蟹類[M]. 北京： 海洋出版社, 1986. 12-514.

[2] Schubart C D, Cuesta J A, Diesel R. Molecular phylogeny, taxonomy, and evolution of nonmarine lineages within the American Grapsoid crabs (Crustacea：Brachyura) [J]. Molecular Phylogenetics and Evolution, 2000, 15(2)： 179-190.

[3] Schubart C D, Cuesta J A, Felder D L. Glyptograpsidae,a new brachyuran family from Central America： larval and adult morphology and a molecular phylogeny of the Grapsoidea[J]. Journal of Crustacean Biology,2002, 22(1)： 28-44.

[4] Kitaura J, Wada K, Nishida M. Molecular phylogeny of grapsoid and ocypodoid crabs with special reference to the generaMetaplaxandMacrophthalmus[J]. Journal of Crustacean Biology, 2002, 22(3)： 682-693.

[5] 孫紅英, 周開亞, 景開顏, 等. 從線粒體 16S rDNA部分序列探討厚蟹屬的系統(tǒng)學(xué)位置[J]. 南京師大學(xué)報(自然科學(xué)版), 2002, 25(1)： 15-19.

[6] Ng P K L, Guinot D, Davie P J F. Systema brachyurorum： partⅠ . An annotated checklist of extant brachyuran crabs of the world[J]. The Raffles Bulletin of Zoology (Supplement), 2008, 17： 1-286.

[7] 徐敬明. 蟹類線粒體 DNA的研究與應(yīng)用[J]. 中國海洋大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版), 2006, 36(6)： 879-884.

[8] 呂國慶, 李思發(fā). 魚類線粒體 DNA多態(tài)研究和應(yīng)用進(jìn)展[J]. 中國水產(chǎn)科學(xué), 1998, 5(3)： 94-103.

[9] Schubart C D, Diesel R, Hedges S B. Rapid evolution to terrestrial life in Jamaican crabs[J]. Nature, 1998,393： 363-365.

[10] Schubart C D, Neigel J E, Felder D L. The use of the mitochondrial 16S rRNA gene for phylogenetic and biogeographic studies of Crustacea[J]. Crustacean Issues, 2000, 12： 817-830.

[11] 邱高峰, 徐巧婷, 王麗卿, 等. 四種絨螯蟹分子分類與系統(tǒng)發(fā)育[J]. 動物學(xué)報, 2001,47(6)：640-647.

[12] Weinberg J R, Dahlgren N D, Halanych K M. Genetic differences within and between species of deep-sea crabs (Chaceon)from the North Atlantic Ocean[J].Biological Bulletin, 2003, 204： 318-326.

[13] 孫紅英, 周開亞, 楊小軍. 從線粒體 16S rDNA序列探討絨螯蟹類的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系[J]. 動物學(xué)報, 2003,49(5)： 592-599.

[14] Harrison J S. Evolution, biogeography, and the utility of mitochondrial 16S and COI genes in phylogenetic analysis of the crab genus Austinixa (Decapoda： Pinnotheridae)[J]. Molecular Phylogenetics and Evolution, 2004, 30： 743-754.

[15] Schubart C D, Cannicci S, Vannini M, et al. Molecular phylogeny of grapsoid crabs (Decapoda, Brachyura)and allies based on two mitochondrial genes and a proposal for refraining from current superfamily classification[J]. Journal of Zoological Systematics and Evolutionary Research, 2006, 44 (3)： 193-199.

[16] 徐敬明, 張俊麗, 方華華, 等. 相手蟹屬兩種蟹類線粒體16S rRNA基因序列的比較[J]. 水產(chǎn)科學(xué), 2006,25(9)： 443-447.

[17] Bouchon D, Souty-grosset C, Raimond R. Mitochondrial DNA variation and markers of species identity in two penaeid shrimp species： Penaeus monodnn Fabricius and P. japonicus Bate[J]. Aquiculture, 1994, 127：131-144.

Molecular phylogeny of grapsoid crabs (Crustacea, Decapoda)based on partial sequences of mitochondrial 16S rRNA gene from China

XU Jing-ming
(College of Life Science and Technology, Chongqing University of Arts and Sciences, Chongqing 402168,China)

Jan., 22, 2010

Grapsoid crabs; 16S rRNA; Sequence; Phylogeny

Partial sequences of mitochondrial 16S rRNA gene of ten species crabs of Grapsoidea from the coast of China were determined and subjected to phylogenetic analysis. The lengths of sequences were from 517 to 533bp.The A, T, G and C contents of them were similar, and AT contents(69.8%～76.0%)were higher than GC contents.Furthermore, the 541bp homologous segments were analyzed. The results showed that there were 146 variable sites and 81 parsimony-information sites in the nucleotides. The genetic distances between four species, Helice latimera,H. tientsinensis, Helicana japonica and H. wuana, and two species, Hemigrapsus sanguineus and H. penicillatus,were from 0.054 to 0.085, which were much smaller than that (0.105～0.155) between the four species of Helice and Helicana and two species of Chiromantes haematocheir and Parasesarma plicatum. However, the four species of Helice and Helicana and the two species of C. haematocheir and P. plicatum had been believed to belong to family Sesarmidae. Topological structure of the molecular phylogenetic tree constructed by 541bp homologous segments with Neighbor-Joining method showed that the four species of Helice and Helicana eventually were clustered into a distinct clade (99% confidence level) with the two species of H. sanguineus and H. penicillatus. But, the two species of Hemigrapsus belonged to family Varunidae. Therefore, the results supported that the four species of Helice and Helicana were transferred from Sesarmidae to Varunidae. In addition, the two species of C. haematocheir and P. plicatum that belong to family Sesarmidae were clustered into a distinct clade, and two other distinct clades were formed by Grapsus albolineatus and Plagusia squamosa that belong to families Grapsidae and Plagusiidae respectively. The results revealed that Grapsidae, Sesarmidae, Varunidae and Plagusiidae should be monophyletic, respectively.

Q178.53;Q953

A

1000-3096(2010)10-0013-05

2010-01-22;

2010-05-19

重慶文理學(xué)院引進(jìn)人才專項(200803)

徐敬明(1963-), 男, 山東日照人, 博士, 教授, 研究方向：動物分子與生理生態(tài), E-mail： xjingming@163.com

(本文編輯：梁德海)