孫國(guó)華, 劉相全, 楊建敏, 張錫佳, 劉愛英, 譚福奕

(1. 山東省海洋水產(chǎn)研究所, 山東 煙臺(tái) 264006; 2. 山東好當(dāng)家海洋發(fā)展股份有限公司, 山東 威海264305)

海蜇養(yǎng)殖群體及自然捕獲群體ITS序列遺傳分析

孫國(guó)華1,2, 劉相全1, 楊建敏1, 張錫佳1, 劉愛英1, 譚福奕2

(1. 山東省海洋水產(chǎn)研究所, 山東 煙臺(tái) 264006; 2. 山東好當(dāng)家海洋發(fā)展股份有限公司, 山東 威海264305)

為調(diào)查海蜇( Rhopilema esculentum)自然海區(qū)群體和養(yǎng)殖群體遺傳多樣性, 對(duì)煙臺(tái)萊州灣和江蘇海州灣自然海區(qū)捕獲群體及威海養(yǎng)殖群體 24個(gè)個(gè)體的 ITS序列進(jìn)行了 PCR擴(kuò)增和序列分析, 獲得

DNA片段長(zhǎng)度在1 080～1 096 bp之間, 包括完整的ITS1, 5.8S和完整ITS2序列。結(jié)果表明, 在所測(cè)堿基序列中共發(fā)現(xiàn)26個(gè)變異位點(diǎn), 4處多堿基插入位置, 29個(gè)插入缺失位點(diǎn)。群體內(nèi)平均核苷酸差異數(shù)K和平均核苷酸多樣性指數(shù)Pi為2.179～2.750和0.002 02～0.002 54, 群體間平均核苷酸差異數(shù)K值波動(dòng)在2.797～3.031之間, 遺傳距離在0.002 30～0.002 81之間, 遺傳分化指數(shù)(Fst)值在0.032 50～0.730 8之間, 群體內(nèi)及群體間遺傳多樣性指標(biāo)數(shù)值比較相近, 群體間的遺傳距離比較小, 群體遺傳結(jié)構(gòu)相似,群體間沒有明顯的遺傳分化。

海蜇( Rhopilema esculentum); 轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS); 遺傳多樣性; 遺傳結(jié)構(gòu)

海蜇(Rhopilema esculentum)是腔腸動(dòng)物門、缽水母綱、根口水母目、根口水母科、海蜇屬的大型食用水母, 為暖水性河口種類, 分布于北自遼寧南至海南島近岸海域, 資源豐富, 經(jīng)濟(jì)價(jià)值大, 是我國(guó)重要漁業(yè)種類之一[1]。海蜇營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高, 含有豐富的蛋白質(zhì)和脂肪酸[2,3], 是深受人民喜愛的水產(chǎn)品; 并且海蜇頭、皮、腹面黑膜等部位均可入藥, 具有清熱解毒、化痰軟堅(jiān)、降壓消腫等藥用價(jià)值[4,5]。海蜇以浮游動(dòng)物為食, 食物鏈短, 種群生命周期短, 資源數(shù)量年間波動(dòng)大, 加之近幾年來(lái)海蜇價(jià)格逐年增高, 捕撈過度, 資源受到嚴(yán)重破壞[6,7]。海蜇池塘養(yǎng)殖業(yè)及增殖放流工作近幾年得到重視和發(fā)展, 但是海蜇分子生物學(xué)方面的基礎(chǔ)研究甚少, 有關(guān)群體遺傳多樣性研究尚比較欠缺。

核糖體基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(internal transcribed spacer ITS), 是位于核糖體DNA(rDNA)上18S和28S基因之間的區(qū)域片段, 主要包括內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū) 1(ITS1)、5.8S rDNA、內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)2(ITS2) , 其兩側(cè)分別是18 S RNA基因和28 S RNA基因。與核糖體DNA中的 18S、5.8S和 28S的基因組序列相比較,ITS1和ITS2作為非編碼區(qū), 承受的進(jìn)化選擇壓力較小, 相對(duì)變化較大[8], ITS區(qū)段的擴(kuò)增已普遍用來(lái)作為分類鑒定及分析近緣種和種群的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的方法[9,10], 在水產(chǎn)動(dòng)物中也有廣泛的應(yīng)用[11～13]。

本研究利用 ITS序列多態(tài)性對(duì)兩個(gè)自然海區(qū)捕獲海蜇群體和一個(gè)人工養(yǎng)殖海蜇群體進(jìn)行了遺傳結(jié)構(gòu)分析, 以期從分子水平上了解海蜇資源的遺傳背景, 為海蜇種質(zhì)資源保護(hù)及海蜇遺傳育種提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

海蜇養(yǎng)殖群體于2008年7月取自山東好當(dāng)家集團(tuán)有限公司, 平均傘徑 420 mm; 江蘇野生群體于2008年8月取自海洲灣海域, 平均傘徑330 mm; 煙臺(tái)野生群體于2008年8月取自萊州灣海域, 平均傘徑360 mm。所有樣品取傘緣部組織凍存于-20℃。

1.2 DNA提取

樣品100 mg機(jī)械剪碎, 加入700 mL CTAB提取緩沖液(100 mmol/L Tris-HCl pH8.0, 20 mmol/L EDTA-Na2, 1.4 mol/LNaCl, 2% CTAB, 0.1%β-巰基乙醇)和終濃度為100 μg/mL蛋白酶K, 55℃消化3 h或37℃過夜, 等體積酚氯仿、氯仿抽提, 2倍體積乙醇沉淀, TE溶解, 4℃保存。

1.3 ITS區(qū)片段擴(kuò)增、純化與克隆測(cè)序

ITS序列擴(kuò)增使用 Heath等[14]設(shè)計(jì)的通用引物,引 物 序 列 為 ： ITSF1(5′-GGTTTCCGTAGGTGAAC-CTGCGGAAGGATC-3′)和 ITSR1(5′-GCTTTGGGCT GCAGT CCCAA GCAA CCCACTC-3′)。一次擴(kuò)增整個(gè)ITS區(qū), 包括ITS1、5.8S rRNA和ITS2。PCR反應(yīng)條件如下： 25 μL PCR反應(yīng)體系： 包含約80 ng的基因組DNA, 10 pmol的引物, 2.5 μmolMgCl2, 0.2 μmol dNTP,Taq DNA聚合酶1 U。PCR反應(yīng)條件為： 94℃ 4 min;94℃40 s, 退火溫度55℃4 0 s, 72℃延長(zhǎng)40 s, 30個(gè)循環(huán);72℃ 10 min; 4℃保溫, 每次均設(shè)空白對(duì)照。PCR產(chǎn)物1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè), 凝膠回收, PCR產(chǎn)物連接到pMD18T, 然后轉(zhuǎn)化到E.coliDH5α細(xì)胞, 37℃培養(yǎng), 涂平板, 挑克隆, 載體引物檢測(cè), 雙向測(cè)序。

1.4 序列分析用MEGA 4.0進(jìn)行同源排序比對(duì), 確定序列長(zhǎng)度;計(jì)算不同序列間的堿基組成、變異位點(diǎn)、簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)和不同地理種群的 Kimura 2-paramter遺傳距離。采用Kimura 2-paramter距離矩陣采用鄰接法(NJ)構(gòu)建單倍型分子系統(tǒng)樹, 系統(tǒng)樹中節(jié)點(diǎn)的自舉置信水平應(yīng)用自引導(dǎo)(bootstrap)估計(jì), 共 1 000次循環(huán)。用DNASP 4.50軟件計(jì)算各個(gè)群體的單倍型, 單倍型多態(tài)性, 多態(tài)位點(diǎn)數(shù), 平均核苷酸差異數(shù), 核苷酸多樣性指數(shù), 基因流Nm等。用ARLEQUIN 3.11中的分子變異分析(AMOVA)分析方法估算遺傳變異在群體內(nèi)和群體間的分布及遺傳分化系數(shù)(F-statistics,Fst), 計(jì)算并用排列測(cè)驗(yàn)法(permutation test)檢驗(yàn)Fst的顯著性(重復(fù)次數(shù)為1000)。

2 結(jié)果

2.1 擴(kuò)增序列長(zhǎng)度、結(jié)構(gòu)及堿基組成

PCR擴(kuò)增3個(gè)群體各8個(gè)個(gè)體共24條序列, 所得測(cè)序序列去載體及引物序列, 經(jīng)Clustal對(duì)位排序,ITS序列長(zhǎng)度在 1 080～1 096 bp之間, 包括完整的ITS1, 5.8S和完整ITS2序列, 圖1表示單倍型1堿基序列, 堿基 A、G、T、C和(A+T)含量分別 23.97%,25.56%, 25.98%, 24.42%和49.95%。同源片段序列對(duì)位排序和分析后, 在所測(cè)堿基序列中共發(fā)現(xiàn)26個(gè)變異位點(diǎn), 這些變異位點(diǎn)包括19個(gè)轉(zhuǎn)換位點(diǎn)(其中T/C 12處, A/G 7處)和7個(gè)顛換位點(diǎn)(其中A/T 4處, G/T 2處, A/C1處, G/C1處), 其中簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)2個(gè), 4處多堿基插入位置29個(gè)插入缺失位點(diǎn), 插入序列分別為GTCGTTCG, AACAA, GAG, TGTC/TGTCTGTC。

圖1 海蜇轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)核苷酸序列Fig. 1 ITS nucleotide sequences of Rhopilema esculentum

2.2 三群體ITS序列的多態(tài)性分析

不計(jì)入插入缺失位點(diǎn), 26個(gè)變異位點(diǎn)定義了17個(gè)單倍型, 在 17種單倍型中, 群體間共享單倍型有2個(gè), 占單倍型總數(shù)的11.8%。單倍型2分別為煙臺(tái),江蘇和養(yǎng)殖群體共有, 單倍型 12分別為煙臺(tái), 江蘇群體所共有, 其他單倍型僅為某一個(gè)體獨(dú)有(表 1)。僅以29個(gè)插入缺失位點(diǎn)計(jì)算, 24條序列歸為9個(gè)單倍型, 共享單倍型5個(gè), 其中單倍型Ⅱ和單倍型Ⅳ為 煙臺(tái)、江蘇和養(yǎng)殖3個(gè)群體所共有(表2)。

表1 海蜇3個(gè)群體ITS序列變異位點(diǎn)及定義單倍型Tab. 1 Variable nucleotide positions in ITS region of 17 haplotypes and number of individuals of each haplotype found in each locality

表2 海蜇3個(gè)群體ITS插入缺失位點(diǎn)及定義單倍型Tab. 2 Insertion-Deletion polymorphysm and the number of each haplotype in Rhopilema esculentum populations

2.3 海蜇各群體內(nèi)及群體間遺傳多樣性分析

用DnaSP4.0軟件對(duì)海蜇各群體的遺傳多樣性參數(shù)進(jìn)行計(jì)算, 結(jié)果列入表3。數(shù)據(jù)顯示, 在3個(gè)群體中, 煙臺(tái)和江蘇自然捕獲群體的單倍型(Nhap)要多于養(yǎng)殖群體, 3個(gè)群體中江蘇自然捕獲群體的堿基多態(tài)位點(diǎn)(S)比例是最高的。在平均核苷酸差異數(shù)K和平均核苷酸多樣性指數(shù)Pi這兩個(gè)指標(biāo)上由ITS基因片段核苷酸序列反映出來(lái)的群體遺傳多樣性指數(shù)的絕對(duì)值水平不高, 3個(gè)群體數(shù)值比較相近, 江蘇自然捕獲群體遺傳多樣性相對(duì)而言比較高, 平均核苷酸差異數(shù)K和平均核苷酸多樣性指數(shù)Pi分別為 3.214和 0.004 29。

各群體之間的相關(guān)遺傳參數(shù)進(jìn)行計(jì)算結(jié)果列入表 4。群體間平均核苷酸差異數(shù)K值波動(dòng)在2.797～3.031之間, 群體間平均每位點(diǎn)核苷酸替代數(shù)(Dxy)與居群間每位點(diǎn)凈核苷酸替代數(shù)(Da)的值相應(yīng)也不是很高。K值、Dxy值和Da值的數(shù)據(jù)顯示海蜇3個(gè)群體間遺傳多樣性指標(biāo)的差異不大。

表3 海蜇各群體內(nèi)的遺傳多樣性參數(shù)Tab. 3 Summary of genetic diversity of different Rhopilema esculentum populations

表4 海蜇各群體間遺傳多樣性參數(shù)及遺傳分化系數(shù)Tab. 4 Summary of genetic diversity between different Rhopilema esculentum populations and Fst

2.4 海蜇 3個(gè)群體間遺傳距離及群體遺傳分化

海蜇3個(gè)群體間遺傳距離在0.002 30～0.002 81之間, 遺傳差異AMOVA分析結(jié)果顯示, 3個(gè)群體間兩兩比較的遺傳分化指數(shù)(Fst)值在 0.032 50～0.730 8之間(表4), 三群體間遺傳分化系數(shù)Fst=0.058 02, 表明在整個(gè)遺傳變異中群體間占 5.802%, 其余的遺傳變異來(lái)源于群體內(nèi), 群體內(nèi)具有程度較高的遺傳分化(表5)。

表5 海蜇各群體間遺傳差異的分子方差分析表(AMOVA)Tab. 5 Analysis of molecular variance (AMOVA) among populations of Rhopilema esculentum

2.5 分子系統(tǒng)樹的構(gòu)建

根據(jù)所得ITS序列, 以Nemopilema nomurai作為外群, 利用MEGA4.0用NJ法構(gòu)建17個(gè)單倍型個(gè)體間的分子系統(tǒng)樹, 自展一致樹顯示作為外群的Nemopilema nomurai獨(dú)立于海蜇 17個(gè)單倍型之外,但是一個(gè)群體的不同個(gè)體并沒有先聚為一起, 分屬于3個(gè)不同群體的17個(gè)單倍型沒有明顯的聚類, 不同群體之個(gè)體間的親緣關(guān)系沒有明顯分群(圖2)。

3 討論

作者對(duì)兩個(gè)自然捕獲群體和一個(gè)養(yǎng)殖群體24個(gè)海蜇個(gè)體的核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)進(jìn)行了擴(kuò)增、測(cè)序, 得到長(zhǎng)度為1 080～1 096 bp的序列, 其中包括完整的ITS1, 5.8S和ITS2序列。在所獲得序列結(jié)構(gòu)中值得注意的一點(diǎn)是, 序列中簡(jiǎn)單重復(fù)單元較多, 序列中存在的插入缺失位點(diǎn)均由簡(jiǎn)單重復(fù)單元數(shù)目改變引起, 如在第一個(gè)位點(diǎn)(C/TTCG)重復(fù)數(shù)目為 5～7個(gè)。簡(jiǎn)單重復(fù)單元數(shù)目改變的原因推測(cè)是在復(fù)制時(shí)發(fā)生滑動(dòng)突變, 使其拷貝數(shù)發(fā)生改變, 進(jìn)而引起序列的變異。在海蜇的ITS序列中, 共發(fā)現(xiàn)4處簡(jiǎn)單重復(fù)序列的插入和缺失, 至于什么原因促成這種簡(jiǎn)單重復(fù)序列的插入和缺失, 以及這種插入和缺失的調(diào)控機(jī)理, 目前尚未見相關(guān)研究報(bào)道。其形成是否與適應(yīng)生長(zhǎng)環(huán)境及表型性狀相關(guān), 此方面還需更深入的研究探討。

圖2 海蜇ITS序列17個(gè)單倍型NJ聚類圖Fig. 2 Phylogenic tree of 17 haplotypes based on ITS sequences of Rhopilema esculentumYT. 煙臺(tái)自然捕獲群體; JS. 江蘇自然捕獲群體; YZ. 威海養(yǎng)殖群體YT. wild population of Yantai; JS. wild population of Jiangsu; YZ.cultured population

許多海洋經(jīng)濟(jì)種類養(yǎng)殖基本是依靠采捕野生親本進(jìn)行大量繁殖, 采用這種方式繁育, 由于從自然群體中選用親本數(shù)目有限, 勢(shì)必造成一定程度的隨機(jī)漂變, 引起養(yǎng)殖群體的遺傳結(jié)構(gòu)發(fā)生改變, 總體遺傳多樣性下降[15,16], 多年的累代養(yǎng)殖將造成不同程度的近交繁殖, 引起種質(zhì)退化。同時(shí)因過度捕撈使野生資源逐漸減少, 而養(yǎng)殖個(gè)體不斷逃逸到自然水體, 也將對(duì)野生群體的遺傳本質(zhì)、種質(zhì)資源和遺傳多樣性產(chǎn)生不可低估的影響[17]。海蜇發(fā)展養(yǎng)殖開始的比較晚, 發(fā)展十幾年來(lái)也是依靠從自然海域捕獲親本進(jìn)行育苗, 因此, 隨著養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大, 研究海蜇野生種群和養(yǎng)殖種群的遺傳結(jié)構(gòu)以及遺傳多樣性對(duì)開展海蜇自然資源調(diào)查與保護(hù)使之可持續(xù)利用;開發(fā)種質(zhì)資源, 進(jìn)行優(yōu)良品種培育, 最大限度地保持養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性具有重要意義。

本研究中兩個(gè)自然捕獲群體和一個(gè)養(yǎng)殖群體由分析 ITS序列相關(guān)參數(shù)所反映出來(lái)的三群體群體內(nèi)遺傳多樣性參數(shù)差異不大, 江蘇群體略高; 兩兩群體間遺傳多樣性指標(biāo)數(shù)值也比較相近, 群體間遺傳距離在0.002 30～0.002 81之間, 遺傳分化指數(shù)(Fst)值在0.032 50～0.730 8之間。根據(jù)Wright[18]關(guān)于遺傳分化指數(shù)的大小和分化程度的解釋, 當(dāng)Fst接近于 0時(shí), 說(shuō)明群體間的沒有發(fā)生遺傳分化,Fst值在0.05～0.15之間, 遺傳分化達(dá)到中等水平。而本研究中 3個(gè)群體間遺傳分化指數(shù)均比較小, 說(shuō)明大群體之間幾乎沒有遺傳分化。相應(yīng)的, 分屬 3個(gè)群體的17單倍型在分子系統(tǒng)樹中也沒有明顯的聚類。目前,山東沿海地區(qū)海蜇的育苗捕獲親本基本是來(lái)自于江蘇附近海域, 而同時(shí), 由于海蜇自然野生資源的衰退, 山東省近幾年一直在開展海蜇的增殖放流工作,這種情況, 從海蜇苗種溯源上解釋了本研究的結(jié)果。

作者分析得到海蜇 ITS片段序列多態(tài)數(shù)據(jù), 群體遺傳結(jié)構(gòu)分析表明, 群體遺傳多樣性比較低, 群體間的遺傳距離比較小, 群體遺傳結(jié)構(gòu)相似, 群體間沒有明顯的遺傳分化, 說(shuō)明養(yǎng)殖群體和兩個(gè)自然捕獲群體尚沒有形成自己獨(dú)立的遺傳結(jié)構(gòu)。從海蜇遺傳育種種質(zhì)資源角度來(lái)看, 再捕獲不同煙臺(tái)和江蘇自然群體作為親本對(duì)繁育后代影響不大; 養(yǎng)殖群體由于并不是累代繁育, 其遺傳結(jié)構(gòu)與自然捕獲群體也無(wú)很大區(qū)別。在未來(lái)養(yǎng)殖過程中, 為了防止人工選育中的近交衰退的問題, 除了注意保持選育親本的數(shù)量外, 還應(yīng)注意利用分子生物學(xué)手段對(duì)選育群體的遺傳多樣性的檢測(cè)分析, 在保持選育性狀穩(wěn)定性的同時(shí), 最大限度地保留群體的遺傳多樣性, 使養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)健康、高效地持續(xù)發(fā)展。本研究結(jié)果同時(shí)也說(shuō)明, 自然捕獲群體遺傳結(jié)構(gòu)相似, 黃渤海海蜇種質(zhì)資源遺傳多樣性比較低, 應(yīng)加大對(duì)海蜇自然資源的保護(hù)力度, 再繼續(xù)開展海蜇的增殖放流工作的同時(shí), 更重要的是控制自然海區(qū)海蜇資源的捕撈量,保護(hù)海蜇自然種質(zhì)資源, 維護(hù)黃渤海生態(tài)平衡, 保證其自然資源可持續(xù)利用。

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Genetic diversity of ITS sequences in farmed and natural Rhopilema esculentum populations

SUN Guo-hua1,2, LIU Xiang-quan1, YANG Jian-min1, ZHANG Xi-jia1, LIU Ai-ying1,TAN Fu-yi2
(1. Marine Fisheries Research Institute of Shandong Provience, Yantai 264006, China; 2. Shandong Homey Aquatic Development Co.LTD, Weihai 264305, China)

Feb., 25, 2010

Rhopilema esculentum, internal transcribed spacers(ITS), population diversity, genetic structure

For the purpose of investigating genetic diverstiy in wild and cultured populitions of Rhopilema esculentum, ITS regions of 24 individuals within Yantai and Jiangsu wild populitions and Weihai cultured population were amplified and analyzed. The whole sequences were between 1 080～1 096 bp, including ITS1-5.8S-ITS2. The result showed that 26 variable nucleotide positions were detected and four nucleotide sites had 29 insertion-deletion positions. Indexes of Piand K among three populations were 2.179～2.750 and 0.002 02～0.002 54, respectively. Indexes of K, genetic distance and fixation indices (Fst) between populations were 2.797～3.031, 0.002 30～0.002 81 and 0.032 50～0.730 8, respectively. The indexs of genetic diversity among and between populations were closed and genetic distances between populations were small, which indicated that the genetic structure of populations were smilar and there were no distinct genetic differentiation between populations.

Q347

A

1000-3096(2010)10-0090-06

2010-02-25;

2010-05-12

國(guó)家海洋局項(xiàng)目(?？谱諿2006]16號(hào))

孫國(guó)華(1979-), 女, 山東萊西人, 博士, 助理研究員,主要從事海洋生物分子遺傳研究, E-mail： sghqingdao@hotmail.com;楊建敏, 通信作者, E-mail： ladderp@126.com

(本文編輯：梁德海)