田 靜,鐘方旭

10-HDA對原代培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元增殖的研究

田 靜,鐘方旭＊

(武漢工業(yè)學院生物與制藥工程學院,湖北武漢430023)

研究10-HDA對原代培養(yǎng)新生大鼠海馬神經(jīng)元的增殖效果.原代培養(yǎng)24 h的新生大鼠海馬神經(jīng)元,通過添加不同濃度的10-HDA(0.1μmol/L、1.0μmol/L、10μmol/L)作用后,利用BrdU免疫熒光染色檢測神經(jīng)細胞增殖,尼氏染色觀察神經(jīng)元數(shù)量的變化.結(jié)果顯示中劑量濃度(1.0μmol/L)的10-HDA作用海馬神經(jīng)元24h后,細胞數(shù)量明顯增多;而高濃度(10μmol/L)10-HDA作用海馬神經(jīng)元24 h后,細胞數(shù)量明顯低于正常對照組和低劑量組(0.1μmol/L).BrdU免疫熒光染色表明,中劑量濃度的10-HDA可使細胞增殖,增殖率達到(19.37±2.192 1)%.尼氏染色結(jié)果表明,10-HDA使海馬神經(jīng)元數(shù)量增加了(20.31±4.086 5)%.研究結(jié)果表明,10-HDA對原代培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元有增殖作用.

10-HDA;海馬細胞;增殖

已有相關(guān)研究表明ω-3多不飽和脂肪酸(PUFA)在智力發(fā)育和記憶中有重要作用,從而受到廣泛的關(guān)注[1,2],目前公認參與記憶痕跡的結(jié)構(gòu)是海馬組織[3].現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)DHA對視覺、認知、記憶有重要作用[4].10-羥基-2-癸烯酸(10-HDA)為蜂王漿中含有的特殊活性物質(zhì),具有多種生理活性,抗菌、滅菌、強壯肌體以及抑制小鼠白血病和腹水癌功能[5].10-HDA也為ω-3多不飽和脂肪酸的一種,其是否也對認知記憶等方面與DHA有著類似的作用尚不清楚,本文以新生大鼠海馬神經(jīng)細胞元代培養(yǎng)為模型,研究10-HDA對海馬神經(jīng)細胞發(fā)育的作用.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

新生24 h的SD大鼠,由華中科技大學同濟醫(yī)學院實驗動物中心提供.

1.1.2 主要試劑

DMEM/F12培養(yǎng)基、B-27 Serum-Free Supplements、新生牛血清、青霉素、鏈霉素、DAPI顯色液均購自Gibco,多聚賴氨酸、胰蛋白酶購自Sigma,焦油紫購自Invitrogen,BrdU抗體、兔抗鼠二抗購自BD biosciences.其余試劑均為分析純購自國藥集團化學試劑有限公司.

1.1.3 儀器

CO2培養(yǎng)箱、解剖顯微鏡(XTL-3A)、倒置顯微鏡及照相系統(tǒng)(Leica,DMI 3000B).

1.2 方法

1.2.1 原代新生大鼠海馬神經(jīng)元的培養(yǎng)

選取新生24 h的SD大鼠數(shù)只,雌雄不限,75%酒精全身消毒,斷頭處死,無菌條件下剝離頭皮、顱骨,劃開大腦顳葉皮層,小心夾出海馬組織,置于冰浴的解剖液(p H7.2,1 g/L含KCl 0.4 g,KH2PO40.06 g,NaCl 8.0 g,NaHCO30.35 g,Na2HPO40.08 g)中,仔細剔除微血管及海馬組織外薄膜,沖洗2次,將組織剪碎約1 mm3.加入同體積0.125%的胰蛋白酶,瓶口用錫箔紙蓋上,37℃培養(yǎng)箱內(nèi)消化15 min,制成單細胞懸液. 0.4%臺盼蘭染色計數(shù)活細胞,以1×105/mL的細胞密度接種于用0.1 g/L的多聚賴氨酸預包被培養(yǎng)皿中(每皿2 mL),置37℃,體積分數(shù)5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng).24 h后用維持培養(yǎng)基(DMEM/F12培養(yǎng)基, 2%B27 Serum-Free Supplements)換液1次,48 h后加入阿糖胞苷(終濃度5μg/mL)抑制非神經(jīng)元細胞增殖.第3天開始用維持培養(yǎng)基每周換液3次,每次換半液.

1.2.2 10-HDA劑量分組

參照Okuda等[6]方法,將10-HDA標準液(Sigma)配制成10 mmg/L儲備液,除菌后置于-20℃冰箱備用.將神經(jīng)細胞分為4組,低劑量組(0.1μmol/L)、中劑量組(1.0μmol/L)、高劑量組(10μmol/L)和空白對照組.將前述細胞懸液接種于培養(yǎng)皿(每皿放置預先用多聚賴氨酸處理的蓋玻片),37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中,2 h后分別添加不同劑量10-HDA,用于其后實驗.

1.2.3 BrdU免疫熒光檢測海馬神經(jīng)元增殖

細胞接種2 h后添加不同劑量10-HDA,24 h加入BrdU(終濃度為3μg/mL),37℃培養(yǎng)箱中孵育2 h～4 h.PBS沖洗,2%多聚甲醛固定30 min后,2 mol/L HCl處理30 min,0.1 mol/L硼酸鈉中和,5%山羊血清封閉1 h,加BrdU抗體(1∶100),室溫1 h;再加入兔抗鼠二抗,室溫孵育1 h.每張細胞爬片滴加DAPI溶液(終濃度1μg/mL),3 min,PBS沖洗,晾干.

計算公式為:

1.2.4 神經(jīng)元尼氏染色

細胞培養(yǎng)7 d后,取出細胞爬片,PBS沖洗3次,用4%多聚甲醛固定細胞爬片15 min.雙蒸水洗爬片3次,每次3 min.滴加0.1%焦油紫溶液后,置于25℃恒溫箱內(nèi)浸染30 min.冷卻后用自來水、雙蒸水各洗1次,每次3 min.以75%的乙醇迅速分化,無水乙醇脫水,二甲苯透明.在光學顯微鏡下觀察并記錄:在高倍視野下,隨機取10個視野,計數(shù)神經(jīng)元數(shù)和細胞總數(shù),計算神經(jīng)元比例.

計算公式為

1.2.5 圖像分析與數(shù)據(jù)統(tǒng)計

所有細胞圖片均隨即選擇10個視野,組間比較采用單因素方差分析.

2 結(jié)果與討論

2.1 培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元形態(tài)特點

在倒置顯微鏡下,剛剛分離出的海馬神經(jīng)元成圓形,周圍有明顯的細胞膜包圍,內(nèi)部遮光,外部有光暈,體積較小,單個均勻分布于培養(yǎng)皿.培養(yǎng)2 h后,個別細胞開始貼壁,神經(jīng)元由圓形變?yōu)樗笮?且伸長出1-2個突起;24 h后,細胞大部分貼壁,細胞形態(tài)發(fā)生多樣化,呈梭形、三角形、錐形或者不規(guī)則的形狀,突起明顯增多、伸長.48 h后,細胞繼續(xù)伸長,突起延伸,有一個明顯的較長較大的和幾個較小的突出.加入阿糖胞苷抑制神經(jīng)膠質(zhì)細胞的增殖后,神經(jīng)元周圍的神經(jīng)網(wǎng)迅速豐富,培養(yǎng)7 d后,神經(jīng)元突起已經(jīng)變粗變長,并出現(xiàn)明顯的分支,形成密集的神經(jīng)網(wǎng)絡(P284圖1).

2.2 不同濃度10-HDA培養(yǎng)海馬神經(jīng)細胞BrdU免疫熒光檢測細胞增殖結(jié)果

接種24 h后,神經(jīng)細胞大部分均貼壁生長,一些已長出突起,空白對照組突起數(shù)目較少而且較短.

低劑量組中神經(jīng)細胞突起和細胞數(shù)量與空白對照組相比無明顯變化.中劑量組中,神經(jīng)細胞數(shù)量有明顯的增多,增殖率達(19.37±2.192 1)%,并且神經(jīng)細胞突起有明顯的增長(P284圖2和3).但高劑量組中, 10-HDA抑制了神經(jīng)細胞突起的生長,并且細胞數(shù)量較空白對照組有所下降,發(fā)生死亡,組間比較差異顯著(P<0.05).因此,神經(jīng)細胞培養(yǎng)基中10-HDA的適宜濃度為1.0μmol/L.

2.3 尼氏體染色

正常健康的海馬神經(jīng)元胞漿呈藍紫色,尼氏小體豐富,且著色較深,結(jié)構(gòu)清晰.非神經(jīng)元細胞胞漿呈淡紫色或無色.通過尼氏染色,神經(jīng)元比例可達70%以上,(P284圖4).接種2 h后添加10-HDA,培養(yǎng)7 d后,明顯發(fā)現(xiàn),中濃度組(1.0μmol/L)中神經(jīng)元數(shù)量明顯比其他組增多,增加率為(20.31±4.086 5)%圖5. (P<0.05).

圖1 培養(yǎng)7d后的海馬神經(jīng)細胞(400×)Fig.1 Hippocampal neurons after 7day’s culture(400×)

圖2 BrdU免疫熒光染色(1.0μmol/L) (紅色-BrdU陽性細胞,藍色-DAPI陽性細胞)Fig.2 Hippocampal neurons stained immunohistochemically for BrdU(1.0μmol/L)(Red-BrdU-positive cells,Blue-DAPI-positive cells)

圖3 不同濃度10-HDA對海馬神經(jīng)細胞數(shù)量的影響(培養(yǎng)24 h)Fig.3 Effect of 10-HDA on the amount of hippoampal neurons(after 24 h culture)

圖4 培養(yǎng)7d的海馬神經(jīng)元尼氏染色Fig.4 Nissl’s staining of the the hippoampal neurons after 7 d culture

3 結(jié)論

本實驗嚴格控制胰酶的量和消化時間,采用了0.125%胰蛋白酶低濃度溶液、15 min消化的方法,盡可能減少分離過程中的化學損傷.在細胞種植24 h后,換用B27無血清維持培養(yǎng)基,可以選擇性的促使神經(jīng)元生長,抑制非神經(jīng)元的生長和繁殖[7],從而可以純化海馬神經(jīng)元.尼氏體是神經(jīng)元的特征性結(jié)構(gòu)之一,存在于神經(jīng)元胞體和樹突內(nèi),可被堿性染料染成深色的顆粒和斑塊,是細胞內(nèi)的一種蛋白質(zhì)合成物質(zhì),并作為觀察神經(jīng)細胞功能的直接指標.本實驗通過尼氏染色,觀察培養(yǎng)的海馬神經(jīng)細胞狀態(tài)良好,神經(jīng)元數(shù)量有所增加.利用BrdU的特殊結(jié)構(gòu),可與細胞中新合成的DNA結(jié)合,只要細胞不消亡, BrdU即可在細胞核的DNA中長期留存,并通過抗BrdU單克隆抗體在細胞爬片上顯示的原理,利用BrdU免疫熒光染色,鑒定神經(jīng)細胞的增殖情況.

目前國內(nèi)外研究僅限于對蜂王漿的整體研究,少有對細胞增殖方面的報道[10-12].本研究通過添加蜂王漿中的活性成分10-HDA,在細胞水平上通過對海馬神經(jīng)細胞生長狀況、細胞增殖情況進行觀察和測量,研究10-HDA對神經(jīng)細胞生長發(fā)育及增殖的影響.結(jié)果表明:10-HDA對海馬神經(jīng)細胞的生長發(fā)育及增殖有明顯的促進作用,這種影響與10-HDA劑量有關(guān),適量10-HDA可促進神經(jīng)細胞生長發(fā)育及增殖,過量則起抑制作用.雖然目前對前體細胞性質(zhì)的認定還存在一定的爭議,一部分人認為這些細胞就是神經(jīng)干細胞,另一部分人則認為是神經(jīng)祖細胞[13].通過BrdU免疫熒光染色發(fā)現(xiàn),10-HDA可能還促進了神經(jīng)元部分前體細胞的分裂增殖,使神經(jīng)細胞的數(shù)量增加,所以在剛出生的哺乳動物腦內(nèi)也可能存在這類前體細胞.

圖5 不同濃度10-HDA對海馬神經(jīng)元數(shù)量的影響(培養(yǎng)7 d)Fig.5 Effect of 10-HDA on the amount of hippoampal neurons(after 7d culture)

海馬與大鼠空間記憶以及海馬分支程度與海馬突觸密切相關(guān)[8,9].海馬神經(jīng)細胞增多,神經(jīng)網(wǎng)絡密集可增加神經(jīng)細胞之間樞紐的形成,因而添加10-HDA對神經(jīng)細胞的影響可以作為增強學習以及認知的細胞形態(tài)學基礎(chǔ),對神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和功能具有重要的研究意義.

[1] CARLSON S E,SUSAN H Werkman,Philip G Rhodes.Visual-acuity Development in Healthy Preterm Infants:Effect of Marine-oil Supplementatetion[J].The A merican Journal of Clinical N utririon,1993(58):34-42.

[2] WHELAN J.(n-6)and(n-3)Polyunsaturated Fatty Acids and the Aging Brain:Food for Thought[J].The Jouranl of N utrition,2008(138):2521-2522.

[3] 黃 瓊.鋅鈣鉛對兒童學習記憶能力的影響及其機制研究[J].微量元素與健康研究,2000,1(7):65-67.

[4] CARLSON S E,WERKMAN S H,TOLL EY E A.Effect of Long-chain n-3 Fatty Acid Supplementation on Visual Acuity and Growth of Preterm Infants with and with-out Bronchopulmonary Dysplasia[J].The A merican Journal of Cl-inical N utririon,1996(63):687-697.

[5] 蘇松坤,沈飛英,戎映君,等.蜂王漿中活性組分的研究[J].中國養(yǎng)蜂,2005,56(8):4-6.

[6] OKUDA S,SATIO H,KATSU KI H.Arachidonic Acid:Toxi and Trophic Effect on Ultured Hippoampal Neurons[J]. Neuroscience,1994(63):691-699.

[7] BREWE G J.Isolation and Culture of Adult rat Hippocampal Nerrons[J].Neurosci Methods,1997,71(2):143-155.

[8] 趙金萍,丁愛石,劉玉軍,等.二十二碳六烯酸對神經(jīng)細胞生長發(fā)育的作用[J].營養(yǎng)學報,2001,23(2):106-109.

[9] 陳超剛,蘇宜香,謝 瑤.花生四烯酸和二十二碳六烯酸對海馬神經(jīng)細胞生長發(fā)育的影響[J].中山醫(yī)科大學學報,2002, 23(2):90-93.

[10] HATTORI N,NOMOTO H,MISHIMA S.Identification of AMP N1-Oxide in Roy-al Jelly as a Component Neurotrophic toward Culture Rat Pheochromocytoma PC12 Cells[J].Bio-sci.Biotechnol.Biochem,2006,70(4):897-906.

[11] HASHIMOTO M,KANDA M,IKENO K.Oral Administration of Royal Jelly Facilitates mRNA Expression of Glial Cell Line-Derived Neurotrophic Factor and Neurofilament H in the Hippocampus of the Adult Mouse Main[J].Biosci Biotechnol Biochem,2005,69(4):800-805.

[12] HATTORI N,NOMOTO H,FU KUMITSU H.Royal Jelly and Its Unique Fatty acid,10-hydroxy-trans-2-decenoic Acid,Promote Neurogenesis by Neural Stem/progenitor Cells in Vitro[J].Biomedical Research,2007,28(5):261-266.

[13] GOULD E,GROSS C G.Neurogenesis in Adult Mammals:Some Progress and Problems[J].J Neurosci,2002,22(3): 619-623.

10-HDA on Proliferation of Primary Cultured Neurons in Hippocampus of Rat

TIAN Jing,ZHONG Fang-xu
(School of Biology and Pharmaceutical Engineering,Wuhan Institute ofTechnology,Wuhan430023,China)

To observe the multiplication effect of primary cultured hippocampal neurons of new born rats, the primary cultured postnatal rat hippocampal neurons was added different concentration of 10-HDA(0.1, 1.0,10μmol/L),then neural cell proliferation was checked by Brdu immunofluorescence staining.Nissl staining was used to observe the quantitative change of neurons.The results shown that the quantity of hippocampal neurons added medium dose 10-HDA(1.0μmol/L)increase obviously after 24 hours,but the quantity of hippocampal neurons added 10μmol/L 10-HDA was lower than the control group and the lowdose group(0.1μmol/L).Brdu immunofluorescence staining shows that medium dose 10-HDA make cells proliferation,growth rate is(19.37±2.192 1)%,Nissl staining shows 10-HDA can increase the amount of hippocampal neurons,rowth rate is(20.31±4.086 5)%.10-HDA can promote the proliferation of primary cultured hippocampal neurons.

10-HDA;hippocampalneurons;proliferation

R151.1;Q501

A

0253-2395(2010)02-0282-04

2009-07-05;

2009-11-14

田 靜(1985-),女,碩士研究生,主要從事神經(jīng)營養(yǎng)研究.E-mail:besttianjing@yahoo.com.cn,＊通訊作者E-mail:zhongfx72@whpu.edu.cn