劉 珊,劉 洋

(中國煙草總公司鄭州煙草研究院,河南鄭州 450001)

水解程度對小麥水解蛋白美拉德反應產(chǎn)物的影響及在煙用香料中的應用

劉 珊,劉 洋

(中國煙草總公司鄭州煙草研究院,河南鄭州 450001)

選擇胰蛋白酶催化小麥蛋白水解,將水解蛋白與葡萄糖進行美拉德反應制備適合卷煙應用的香料。利用正交實驗確定了最佳水解條件：底物濃度 9%,加酶量 3%,體系 pH8,水解溫度 50℃。同時通過控制水解時間得到水解程度不同的水解蛋白,考察了水解程度對美拉德反應產(chǎn)物的影響。結果表明,在本文所選擇的水解條件下,水解時間為10h的小麥水解蛋白的美拉德反應產(chǎn)物具有較好的卷煙加香效果,能夠改善參比卷煙的香氣質,增加香氣量,使煙氣增濃柔順,提高細膩度與透發(fā)性。

小麥蛋白,水解程度,美拉德,煙用香料

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

小麥蛋白 小麥活性谷朊粉,寶雞源盛實業(yè)有限公司;葡萄糖 市售食品級;木瓜蛋白酶 標注活力 8×105u/g,廣州遠天酶制劑廠;胰蛋白酶 標注活力 3000u/g,杭州三葉生物工程公司;中性蛋白酶 標注活力 5×104u/g,無錫酶制劑廠;甲醛 萊陽市雙雙化工有限公司;氫氧化鈉、碳酸氫鈉、磷酸、氯化鈉、無水乙醚、無水硫酸鈉 分析純,天津化學試劑三廠。

電子天平 T D,浙江余姚金諾天平有限公司;電子天平 BP121S,Sartorius;臺式大容量離心機L-550,長沙湘儀離心機有限公司;磁力攪拌器 85-1,上海司樂儀器有限公司;酸度計 pHS-3S,上海宇隆儀器有限公司;水浴恒溫振蕩器 SHA-A,江蘇金壇市環(huán)宇科學儀器廠;實驗室香精香料注射儀C ILECTOR burghart公司;旋轉蒸發(fā)儀 RE-3000,上海亞榮生化儀器廠;氣質聯(lián)用儀 6890N GC/5975 MS,美國惠普公司;Waters 2695高效液相色譜儀。

1.2 實驗方法

1.2.1 小麥水解蛋白的制備 將小麥蛋白與水混合均勻,加入酶制劑后置于恒溫水浴振蕩器中進行水解。水解結束后沸水浴加熱 5min滅酶,迅速冷卻至室溫,4000r/min離心分離得到上清液即為水解蛋白。

1.2.2 水解蛋白氨態(tài)氮含量及氨態(tài)氮生成率的測定

氨態(tài)氮含量：采用甲醛滴定法[3];總蛋白氮：采用微量凱氏定氮法[3]。

1.2.3 水解蛋白中肽分子量分布的測定 采用高效凝膠過濾色譜法[4]。Waters 2695高效液相色譜儀(2487紫外檢測器和 Empower Pro工作站)。

色譜柱：Waters Protein-Pak 125?300mm × 7.8mm;流動相：乙腈/水/三氟乙酸為 45/55/0.1 (V/V);檢測波長：UV220nm;流速：0.5mL/min;柱溫：30℃。

分子量校正曲線所用標準品：細胞色素 C (MW12500),桿菌酶(MW1450),乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸 (MW451),乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸(MW189)

校正曲線：Log分子量 =7.634-0.256T R2=0.9959

1.2.4 美拉德反應產(chǎn)物的制備 將水解程度不同的小麥水解蛋白分別與葡萄糖按糖氮比 2∶1混合均勻,于常壓 100℃加熱回流反應3h,反應完畢后迅速冷卻至30℃以下。

1.2.5 反應過程中體系氨態(tài)氮損失率的測定 計算公式如下：

氨態(tài)氮損失率 (%)=反應前體系氨態(tài)氮含量(%)-反應后體系氨態(tài)氮含量 (%)/反應前體系氨態(tài)氮含量(%)×100%

1.2.6 水解蛋白美拉德反應產(chǎn)物的感官評價[5]將美拉德反應產(chǎn)物以適量去離子水稀釋,按照 500ppm/支的注射量加入?yún)⒈染頍?加香煙支于相對濕度 65%,溫度為 22±2℃環(huán)境平衡 24h后,由專家組進行評吸。

1.2.7 水解蛋白美拉德反應產(chǎn)物的醚溶性成分分析取 10mL美拉德反應產(chǎn)物,加入氯化鈉使其飽和,分別用 40、40、20mL無水乙醚萃取,合并有機相,以無水硫酸鈉干燥過夜,過濾后加入乙酸苯乙酯內(nèi)標溶液,常壓濃縮至 1mL備用,進行 GC-MS分析。

GC-MS條件：HP-FFAP毛細管柱：30m × 0.25mm×0.25μm;載氣為 He;柱流速：0.6mL/min;進樣口溫度 250℃;程序升溫：;進樣量 1μL;分流比 10∶1;傳輸線溫度：280℃;電離電壓：70eV,質量數(shù)范圍：30～400amu。

2 結果與討論

2.1 不同蛋白酶對小麥蛋白水解能力的比較

在酶的理論最適條件,分別以木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和中性蛋白酶按相同底物濃度 ([S]=9%, w/w)和加酶量 ([E]/[S]=2%,w/w)水解小麥蛋白,以體系中氨態(tài)氮含量表示水解程度。如圖 1所示,胰蛋白酶的水解能力高于中性蛋白酶和木瓜酶。胰蛋白酶催化專一性強,主要作用于堿性氨基酸(精氨酸與賴氨酸)的羧基和其它氨基酸的氨基組成的肽鍵,產(chǎn)生具有堿性氨基酸末端的肽。肽段的反應活性受末端氨基酸的影響,而堿性氨基酸的美拉德反應活性較高,故選擇采用胰蛋白酶水解小麥蛋白。

圖 1 不同蛋白酶對小麥蛋白水解能力的比較

2.2 胰蛋白酶水解小麥蛋白條件優(yōu)化

以底物濃度、加酶量、體系 pH、水解溫度為因素,以水解 10h的氨態(tài)氮生成率為考察指標,采用L9(34)正交實驗對各種條件進行篩選,建立最佳的胰蛋白酶水解工藝。如表 1所示,由極差分析可知,在本實驗選擇的因素和水平條件下,因素影響的次序為B＞A＞D＞C,即加酶量對氨態(tài)氮生成率的影響最大,其次為底物濃度,而水解溫度和 pH影響均較小。最佳方案為 A2B3C2D2,即底物濃度為 9%,加酶量為 3%,體系 pH為 8,水解溫度為 50℃。

表 1 胰蛋白酶水解小麥蛋白正交實驗結果

2.3 水解時間對氨態(tài)氮生成率的影響

以正交實驗確定的條件下水解小麥蛋白。如圖2所示,隨著水解時間延長,小麥蛋白分子中的肽鍵不斷打開,游離氨基數(shù)量不斷增加,10h內(nèi)表現(xiàn)為氨態(tài)氮含量迅速升高。之后由于酶活的下降以及濃度不斷增大的水解物對蛋白酶的抑制作用,水解速率逐漸降低,氨態(tài)氮含量增加幅度減小。當水解時間達 24h,氨態(tài)氮含量無明顯增加。

表 2 不同水解程度小麥水解蛋白美拉德反應產(chǎn)物的感官評價

圖2 水解時間對氨態(tài)氮含量的影響

2.4 水解時間對小麥水解蛋白中肽分子量分布的影響

根據(jù)圖 3凝膠色譜圖峰形特點可將水解過程分為幾個階段。水解初期 1～3h內(nèi),水解蛋白分子量分布范圍主要分為五段,即 14～26、850～14、300～850、150～300、＜150kDa。1h水解蛋白中各肽段分別占總量的 0.47%、15.71%、32.28%、27.73%及 23.81%,而 3h相對于 1h水解蛋白在分子量 ＞300kDa范圍的組分含量有所減少,而分子量 ＜300kDa范圍的組分含量有所增加。6h和 10h水解蛋白分子量分布具有相似的峰形,并且分子量 14～26kDa范圍的大分子組分迅速減少,而分子量 ＜850kDa范圍的組分占總肽含量的 95%以上,主要是由 6～7個以下氨基酸組成的肽。當水解時間達到 24h時,水解蛋白中分子量＜300kDa的組分占 82%以上,主要由二肽三肽及游離氨基酸組成。

圖 3 不同水解時間小麥水解蛋白中肽分子量分布

2.5 水解程度對水解蛋白美拉德反應產(chǎn)物的影響

2.5.1 水解程度對反應過程氨態(tài)氮損失率的影響 圖 4為不同水解程度小麥水解蛋白在美拉德反應過程中氨態(tài)氮的變化。隨著水解時間的延長,水解蛋白中氨態(tài)氮含量不斷增加,但在反應過程中氨態(tài)氮的損失率卻呈波動變化,其中水解時間為 6h與10h的水解蛋白氨態(tài)氮損失率較高。由于不同水解程度水解蛋白的分子量分布不同,肽和氨基酸的組成亦不同,氨態(tài)氮損失率的波動變化可能是由不同分子大小的肽以及不同的末端氨基酸的反應活性不同造成的。

圖 4 水解時間對美拉德反應產(chǎn)物氨態(tài)氮損失率的影響

2.5.2 水解程度對美拉德反應產(chǎn)物卷煙加香效果的影響 不同水解程度水解蛋白的美拉德反應產(chǎn)物對參比卷煙均有一定作用,但作用效果和作用程度各有不同。如表 2所示,低度水解的水解蛋白美拉德反應產(chǎn)物不同程度上存在刺激較大的缺陷,可能是由于產(chǎn)物中含有未降解或降解率低的大分子蛋白肽,其反應活性低,若含量過高則在煙支燃燒時產(chǎn)生副作用。而當水解程度繼續(xù)提高,低分子肽與游離氨基酸含量不斷增加,并不能繼續(xù)提高反應產(chǎn)物的加香效果,反而使加香的卷煙吸食品質變差。綜合考慮,在本文所選取的幾種水解程度范圍內(nèi),10h水解蛋白美拉德反應產(chǎn)物具有較好的加香效果。

2.5.3 水解程度對美拉德反應產(chǎn)物醚溶性成分的影響 如表 3所示,隨著水解程度增加,水解蛋白美拉德反應產(chǎn)物中的吡嗪類物質有所減少,呋喃類與吡咯類物質有所增多,同時酸類物質有所增多。而加入反應產(chǎn)物后參比卷煙的吸食品質正是這些物質綜合作用的結果。香味物質種類與量的增加可使香氣質和香氣量有所改善,但是繼續(xù)增加帶來的不諧調以及酸類物質增加,特別是低級脂肪酸類物質的增加,都會給卷煙帶來負面的影響。

3 結論

通過控制水解時間可控制小麥蛋白的水解程度,得到分子量分布與末端氨基酸組成不同的產(chǎn)物。由于肽段長度與末端氨基酸均影響氨基化合物的美拉德反應活性及產(chǎn)物組成,故不同水解程度的水解蛋白的美拉德反應產(chǎn)物具有不同的特點。結果表明,在本文所選擇的水解條件下,水解時間為 10h的小麥水解蛋白的美拉德反應產(chǎn)物具有較好的卷煙加香效果,能夠改善參比卷煙的香氣質,增加香氣量,使煙氣增濃柔順,提高細膩度與透發(fā)性。

表 3 水解程度對小麥水解蛋白美拉德產(chǎn)物醚溶性成分的影響

[1]楊葉昆,李雪梅,等 .酪蛋白的酸水解及其棕色化反應產(chǎn)物在卷煙加香中的應用[J].煙草科技,2001(1)：8-10.

[2]楊葉昆,李雪梅,等 .酪蛋白的酶促水解及其水解物的美拉德反應[J].食品科學,2003(4)：104-107.

[3]大連輕工業(yè)學院,華南理工大學合編 .食品分析[M].中國輕工業(yè)出版社,1994.

[4]QB/T 2653-2004大豆肽粉附錄A[S].

[5]謝劍平,宗永立,等 .單體香料在卷煙中作用評價方法的建立與應用[J].煙草科技,2008(4)：5-9,13.

Effect of degree of hydrolysis onMaillard reaction products of wheat protein hydrolysates and application in tobacco flavoring

L IU Shan,L IU Yang
(Zhengzhou Tobacco Research Institute of CNTC,Zhengzhou 450001,China)

In this p ap e r tryp s in was se lec ted to ca ta lyze the hyd rolyza tion of whea t p rote in.The hyd rolysa tes we re reac ted w ith g lucose to p roduce tobacco flavoring.The hyd rolys is ofwhea t p rote in was s tud ied through orthogona l tes t des ign.It was found tha t the op t im um cond itions we re：the concentra tion of subs tra te was9%,the ra tio of tryp s in to subs tra te was3%,pH was8and temp e ra ture was50℃.Hyd rolysa tes w ith d iffe rent deg ree of hyd rolys is we re p rep a red by controlling hyd rolys is t im e.Hyd rolys is t im ehad effec t not only on thecons titution of the hyd rolysa tes but a lso on the M a illa rd reac tion p roduc ts.Result showed tha t unde r the op t im um cond ition the p roduc ts of hyd rolysa tes w ith10h could d is tinc tly imp rove the sensory qua lity of tobacco.

whea t p rote in;deg ree of hyd rolys is;M a illa rd;tobacco flavoring

TS201.2+1

A

1002-0306(2010)02-0127-04

美拉德反應是形成煙草特征香味的重要反應,在煙用香料合成方面的應用十分廣泛。國內(nèi)外相關研究多采用單一氨源 (如氨基酸)和各種還原糖類,導致成本過高且香味成分相對單一。現(xiàn)代美拉德反應已開始傾向于利用天然原料,如采用水解蛋白作為氨源,利用植物提取物及淀粉水解糖等作為糖源。天然氨源的美拉德產(chǎn)物在煙草制品中取得了良好應用,多數(shù)研究采用酸法水解動植物蛋白[1],雖水解效率高,但需高濃度強酸溶液,對設備要求高且水解物需大量堿中和。而采用酶法水解技術多為長時間水解[2],使深度水解的蛋白質發(fā)生美拉德反應,并未針對水解程度對水解蛋白美拉德反應產(chǎn)物的影響進行研究。而通過控制水解時間可得到水解程度不同的水解蛋白,從而制備不同組成的美拉德反應產(chǎn)物,得到具有不同特點的煙用香料。

2009-04-01

劉珊(1977-),女,碩士,工程師,主要從事煙用香料的開發(fā)與應用。