王勍，鄭璞，倪曄，孫志浩

(江南大學(xué)生物工程學(xué)院，工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫，214122)

非水介質(zhì)中脂肪酶催化合成蔗糖-6-乙酸酯*

王勍，鄭璞，倪曄，孫志浩

(江南大學(xué)生物工程學(xué)院，工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫，214122)

研究了以蔗糖為起始原料，在非水介質(zhì)中脂肪酶催化合成蔗糖-6-乙酸酯。通過對反應(yīng)介質(zhì)、脂肪酶和?；w的篩選、轉(zhuǎn)酯反應(yīng)條件的優(yōu)化得出，在DMSO/叔丁醇體系中，固定化脂肪酶Lipozyme TLIM能較好地催化乙酸乙烯酯和蔗糖進(jìn)行轉(zhuǎn)酯反應(yīng);反應(yīng)的較佳條件為:DMSO/叔丁醇體積比1∶4，蔗糖與乙酸乙烯酯的摩爾比1∶10，蔗糖濃度0.06 mmoL/mL，固定化脂肪酶濃度80mg/mL，反應(yīng)溫度30℃，時(shí)間9 h，生成蔗糖-6-乙酸酯的產(chǎn)率為89.3%。并對產(chǎn)物進(jìn)行了紅外光譜及核磁共振分析，確證合成產(chǎn)物為蔗糖-6-乙酸酯。

蔗糖-6-乙酸酯，非水介質(zhì)，脂肪酶，酰基供體，轉(zhuǎn)酯反應(yīng)

蔗糖-6-乙酸酯是單保護(hù)法合成超級(jí)甜味劑三氯蔗糖的關(guān)鍵中間體。三氯蔗糖是以蔗糖為原料經(jīng)氯代而制得的一種非營養(yǎng)型強(qiáng)力甜味劑，甜度為蔗糖的600～700倍，且甜味純正，甜味特性曲線幾乎與蔗糖重疊。三氯蔗糖在人體內(nèi)幾乎不被吸收，熱量值為零，可供肥胖、心血管病和糖尿病患者食用［1］。

合成蔗糖-6-乙酸酯的方法主要是傳統(tǒng)的化學(xué)法，如乙酸酐酯化法［2］、有機(jī)金屬合成法［3］、原酸酯法［4］等;也有關(guān)于酶法合成的報(bào)道［5－6］。蔗糖酯的化學(xué)合成反應(yīng)條件一般比較苛刻，合成的產(chǎn)品顏色比較深，而且由于其選擇性差，容易產(chǎn)生副產(chǎn)物［7］;酶法合成主要是利用酶對催化區(qū)域的高效選擇性，使反應(yīng)在需要的位置進(jìn)行。1984年Rathbone等［5］申請了生物法合成蔗糖-6-乙酸酯的專利，先用枯草桿菌發(fā)酵葡萄糖生成葡萄糖-6-乙酸酯，再用果糖轉(zhuǎn)移酶催化葡萄糖-6-乙酸酯和蔗糖生成蔗糖-6-乙酸酯，第1步發(fā)酵及第2步轉(zhuǎn)化的最高得率分別為56%和58%。1992年Jonathan等［6］使用脂肪酶P Amano在吡啶溶液中催化蔗糖和乙酸異丙烯酯進(jìn)行轉(zhuǎn)酯反應(yīng)，反應(yīng)4 d得到蔗糖-6-乙酸酯的產(chǎn)率為33%。脂肪酶法合成蔗糖-6-乙酸酯具有反應(yīng)條件較溫和，催化選擇性較強(qiáng)，產(chǎn)品安全性好等優(yōu)點(diǎn)，但同時(shí)也存在反應(yīng)時(shí)間長，產(chǎn)率偏低的缺點(diǎn)。為提高脂肪酶催化合成蔗糖-6-乙酸酯的效率，本文對脂肪酶催化蔗糖與?；w生成蔗糖-6-乙酸酯的轉(zhuǎn)酯反應(yīng)進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

蔗糖-6-乙酸酯標(biāo)樣(純度80%)，加拿大TRC公司;枯草芽孢桿菌酶(游離態(tài)粉末)，山東杰諾生物酶有限公司惠贈(zèng);脂肪酶L 1754(游離態(tài)粉末)，西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司;固定化脂肪酶Lipozyme RMIM、Novozym 435、Lipozyme TLIM，北京高瑞森科技有限公司;TLC用薄層硅膠板，青島海洋化學(xué)試劑公司;其他試劑均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

高效液相色譜儀安捷倫1100系列，色譜柱Diamonsil C185 μm(250 ×4.6)mm;紅外光譜儀 FTLA 2000-104，加拿大ABB Bomem公司;核磁共振波譜儀AVANCE III400 MHz，布魯克·道爾頓公司。

1.2 方法

1.2.1 反應(yīng)物料的預(yù)處理

將4 A分子篩于烘箱中105℃活化24 h以上，置于干燥器中冷卻保存;將蔗糖于真空干燥箱中60℃下干燥24 h，置于干燥器中保存;液態(tài)反應(yīng)物及所有的溶劑預(yù)先用活化好的4 A分子篩進(jìn)行24 h以上除水。

1.2.2 酶促反應(yīng)

在25mL的具塞單口反應(yīng)燒瓶中加入0.3 mmol蔗糖，用5mL混合有機(jī)溶劑V(DMSO)∶V(叔丁醇)=1∶4完全溶解，預(yù)熱至30℃后加入80 mg固定化脂肪酶TLIM，在相應(yīng)溫度下200 r/min振蕩10 min，然后加入3 mmoL乙酸乙烯酯，置于振蕩培養(yǎng)箱中繼續(xù)振蕩24 h。反應(yīng)過程中間隔取樣TLC檢測分析，反應(yīng)結(jié)束用HPLC檢測鑒定并計(jì)算產(chǎn)率。除試驗(yàn)所考察因素外，其他反應(yīng)條件均按該描述進(jìn)行。

1.2.3 蔗糖-6-乙酸酯的分離純化

反應(yīng)結(jié)束后，離心除去脂肪酶;將得到的上清液于60℃真空蒸發(fā)，除去低沸點(diǎn)液體，攪拌母液同時(shí)加入過量的二氯甲烷，沉淀其中的蔗糖-6-乙酸酯，過濾得到淡黃色蔗糖-6-乙酸酯粗品。參照文獻(xiàn)［8］的方法對粗品進(jìn)行純化。

1.3 分析方法

1.3.1 TLC 法定性分析

定性分析參照文獻(xiàn)［9］。

1.3.2 HPLC 法定量分析

定量分析參照文獻(xiàn)［10］。

1.4 蔗糖-6-乙酸酯產(chǎn)率計(jì)算

2 結(jié)果與討論

2.1 脂肪酶催化合成蔗糖-6-乙酸酯的反應(yīng)介質(zhì)

基于蔗糖的溶解性和脂肪酶活性不受限制兩方面因素選擇反應(yīng)介質(zhì)。表1中比較了蔗糖在幾種介質(zhì)中的溶解性，以及分別以固定化脂肪酶Lipozyme TLIM和Novozym 435為催化劑，與乙酸乙烯酯合成蔗糖-6-乙酸酯的情況(TLC分析)。表1表明，在DMF、DMSO、吡啶、叔戊醇、叔丁醇中幾乎不能合成蔗糖-6-乙酸酯。原因可能是:DMF、DMSO是極性較強(qiáng)的溶劑，具有較強(qiáng)的親水性，會(huì)剝奪酶的“必需水”，從而導(dǎo)致酶的失活;蔗糖在叔戊醇、叔丁醇中的溶解度太低也導(dǎo)致反應(yīng)無法進(jìn)行，吡啶不適合該轉(zhuǎn)酯反應(yīng)。

表1 不同溶劑對合成蔗糖-6-乙酸酯的影響

在DMSO/叔丁醇體系中，少量的DMSO能促進(jìn)蔗糖溶解，使轉(zhuǎn)酯反應(yīng)可以進(jìn)行，由于反應(yīng)介質(zhì)大部分是叔丁醇，酶能夠較穩(wěn)定的存在，很大程度上降低了酶的失活［11］;雖然在DMSO/叔戊醇體系中，脂肪酶的催化效果與DMSO/叔丁醇體系相同，但考慮到DMSO/叔丁醇體系溶解性更好，有利于提高蔗糖產(chǎn)物濃度，因此選用DMSO/叔丁醇作為反應(yīng)體系。如圖1，當(dāng)混合介質(zhì)中DMSO與叔丁醇的體積比為1∶4時(shí)，蔗糖-6-乙酸酯產(chǎn)率較高。因此選用該比例混合溶劑作為轉(zhuǎn)酯反應(yīng)的溶劑體系。

圖1 DMSO與叔丁醇比例對產(chǎn)率影響

2.2 脂肪酶對合成蔗糖-6-乙酸酯反應(yīng)的影響

不同的酶對蔗糖分子中不同位置上羥基的選擇性不同，從而得到不同的異構(gòu)體。實(shí)驗(yàn)中比較了幾種脂肪酶催化蔗糖和乙酸乙烯酯進(jìn)行轉(zhuǎn)酯反應(yīng)，TLC法分析結(jié)果如表2

表2 不同脂肪酶的影響

根據(jù)HPLC檢測結(jié)果得知，用Lipozyme TLIM做催化劑時(shí)，產(chǎn)率為80.1%。用Novozym 435做催化劑時(shí)產(chǎn)率只有37% 左右，同時(shí)還產(chǎn)生了差不多等量的異構(gòu)體，而其他脂肪酶幾乎不能催化反應(yīng)。

進(jìn)一步對酶的用量進(jìn)行考察，比較不同濃度Lipozyme TLIM催化合成蔗糖-6-乙酸酯的產(chǎn)率。如圖2，當(dāng) Lipozyme TLIM的濃度為 80mg/mL，產(chǎn)率為80.1%。隨著酶量增加到一定程度，產(chǎn)率反而開始下降，其原因可能是過量的酶吸附了一定量的溶劑，導(dǎo)致底物過飽和而部分析出，無法參加反應(yīng)而影響了產(chǎn)率。

2.3 乙酸乙烯酯對合成蔗糖-6-乙酸酯反應(yīng)的影響

脂肪酶催化?；姆磻?yīng)，是通過形成?；?酶這個(gè)中間體發(fā)生的，因此?；w對反應(yīng)有著顯著的影響。通過比較乙酸乙烯酯、乙酸乙酯、乙酰乙酸乙酯和乙酸酐等?；w的轉(zhuǎn)酯反應(yīng)，TLC法分析檢測發(fā)現(xiàn)乙酸乙烯酯是比較有效的酰基供體，而其他?；w幾乎不能用于此轉(zhuǎn)酯反應(yīng)。這是因?yàn)?，酶催化的轉(zhuǎn)酯反應(yīng)是一個(gè)親核取代反應(yīng)，?；w中的α碳原子的正電荷性越強(qiáng)，越容易被酶攻擊;而生成的離去基團(tuán)越易去除，則反應(yīng)平衡方向越容易向合成新酯的方向移動(dòng)。乙酸乙烯酯作為?；w時(shí)，生成的乙烯醇快速的轉(zhuǎn)變?yōu)橐胰]發(fā)掉，使得平衡方向向轉(zhuǎn)酯反應(yīng)移動(dòng)。

圖2 Lipozyme TLIM濃度對產(chǎn)率影響

圖3 乙酸乙烯酯摩爾濃度對產(chǎn)率影響

根據(jù)圖3可知，當(dāng)酰基供體乙酸乙烯酯的用量達(dá)到0.6 mmol/mL，即蔗糖摩爾濃度的10倍時(shí)，產(chǎn)率為81.4%，再提高乙酸乙烯酯濃度已經(jīng)對產(chǎn)率沒有明顯影響。

2.4 含水量對合成蔗糖-6-乙酸酯反應(yīng)的影響

非水相酶促酯化反應(yīng)中，體系中的含水量會(huì)影響反應(yīng)的速率和反應(yīng)的平衡位置。含水量過多會(huì)抑制平衡向產(chǎn)物方向的移動(dòng)。因此，使用分子篩對各試劑進(jìn)行預(yù)處理，以達(dá)到減少水分影響的目的。含水量對轉(zhuǎn)酯反應(yīng)的影響見圖4，當(dāng)體系中含水量為0.2mg/mL時(shí)，轉(zhuǎn)酯效果明顯低于無水狀態(tài)下的效果;在反應(yīng)前對試劑進(jìn)行充分除水并在密閉條件下反應(yīng)時(shí)，產(chǎn)率與在反應(yīng)中加入分子篩時(shí)的產(chǎn)率基本相同?？梢姡磻?yīng)前充分除水對轉(zhuǎn)酯反應(yīng)很有必要。

圖4 含水量對產(chǎn)率影響

2.5 溫度對合成蔗糖-6-乙酸酯反應(yīng)的影響

溫度對酶活有很大的影響，選擇合適的溫度能夠使脂肪酶更好地催化反應(yīng)進(jìn)行?？疾觳煌瑴囟葘Ψ磻?yīng)的影響，結(jié)果如圖5所示。30℃時(shí)，產(chǎn)物產(chǎn)率達(dá)到83.1%。超過40℃，酶活性明顯下降，產(chǎn)率也隨之降低?？紤]到脂肪酶的回收與再利用，反應(yīng)溫度以30℃為宜。

圖5 溫度對產(chǎn)率的影響

2.6 蔗糖濃度對合成蔗糖-6-乙酸酯反應(yīng)的影響

對于產(chǎn)品的生產(chǎn)來說，除了產(chǎn)率之外，產(chǎn)量也是一個(gè)很重要的指標(biāo)。反應(yīng)中增加底物的濃度可以使產(chǎn)量提高。蔗糖濃度在0.06～0.18 mmoL/mL時(shí)合成蔗糖-6-乙酸酯的產(chǎn)率情況見圖6。

從圖6可知，蔗糖濃度低于0.09 mmoL/mL時(shí)，蔗糖-6-乙酸酯產(chǎn)率為83%左右。如果蔗糖濃度過高，在振蕩反應(yīng)的過程中會(huì)有底物析出，使得產(chǎn)率降低。

2.7 蔗糖-6-乙酸酯的反應(yīng)進(jìn)程與脂肪酶的重復(fù)使用

圖6 不同蔗糖濃度對產(chǎn)率的影響

從圖7可看出，從反應(yīng)開始到6 h這段時(shí)間里，蔗糖-6-乙酸酯隨著時(shí)間的延長而急劇增加，然后變成緩慢增長。反應(yīng)至9 h，產(chǎn)率達(dá)到最高值89.3%。隨著時(shí)間的繼續(xù)，副產(chǎn)物(主要是蔗糖二酯)逐漸產(chǎn)生，產(chǎn)率反而有所下降。

圖7 蔗糖-6-乙酸酯的反應(yīng)進(jìn)程

將反應(yīng)至9 h的固定化脂肪酶Lipozyme TLIM過濾取出，重新投入新的反應(yīng)，觀察重復(fù)使用后的產(chǎn)率。如圖8，Lipozyme TLIM反復(fù)使用6次后，產(chǎn)率下降至初始產(chǎn)率的50%左右。酶活下降的主要因素可能是反應(yīng)介質(zhì)中的DMSO以及反應(yīng)生成的乙醛對脂肪酶造成了傷害，從而降低了脂肪酶的催化效能。

圖8 Lipozyme TLIM重復(fù)使用的產(chǎn)率

2.8 蔗糖-6-乙酸酯結(jié)構(gòu)鑒定

蔗糖-6-乙酸酯粗品經(jīng)過純化后，得到蔗糖-6-乙酸酯晶體，對其進(jìn)行紅外光譜和核磁共振分析。

紅外光譜分析(鹽片涂膜法，溶劑為丙酮):如圖9所示，3 417.6cm－1處的強(qiáng)寬吸收峰為羥基 O—H的伸縮振動(dòng)的特征吸收，2 931.6cm－1處的弱吸收峰為烷烴飽和 C—H伸縮振動(dòng)的特征吸收，1 735.8cm－1處的吸收峰為C=O的伸縮振動(dòng)吸收峰，1 253.6cm－1處有酯基中C—O伸縮振動(dòng)吸收峰，1 006～1 103cm－1處為—CH2OH中C—O伸縮振動(dòng)的特征吸收峰，其中1 056.9cm－1處的強(qiáng)吸收峰為糖環(huán)特征吸收。另外929.6cm－1處的吸收峰，是 α-糖苷鍵的特征吸收。綜合紅外圖譜分析，符合蔗糖-6-乙酸酯的結(jié)構(gòu)特征。

圖9 蔗糖-6-乙酸酯紅外光譜分析

蔗糖-6-乙酸酯的核磁共振13C分析結(jié)果:13CNMR(C2D6SO，400MHz):170.41(—COCH2)，103.86(C2')，91.40(C1)，82.73(C5')，76.96(C3')，74.53(C4')，72.70(C3)，71.52(C2)，70.22(C5)，69.96(C4)，63.79(C')，62.60(C6')，62.27(C1')，20.63(—COCH2)。13C圖譜結(jié)果與文獻(xiàn)［12］提供的理論值相一致，從而可以認(rèn)定該產(chǎn)品就是目標(biāo)產(chǎn)物蔗糖-6-乙酸酯。

3 結(jié)論

固定化脂肪酶Lipozyme TLIM催化合成蔗糖-6-乙酸酯的較佳反應(yīng)條件為:在30℃、200 r/min下，0.06 mmol/mL蔗糖溶液中加入80mg/mL的固定化脂肪酶Lipozyme TLIM和0.6 mmol/mL乙酸乙烯酯，反應(yīng)9 h，蔗糖-6-乙酸酯的產(chǎn)率達(dá)到89.3%。產(chǎn)物經(jīng)過TLC、HPLC、FTIR和NMR等分析鑒定，確認(rèn)為蔗糖-6-乙酸酯。脂肪酶重復(fù)使用6次后，反應(yīng)產(chǎn)率下降到初始產(chǎn)率50%左右，說明需要對脂肪酶進(jìn)行再修飾，以達(dá)到多次利用，降低成本的目的。

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Lipase-catalyzed Synthesis of Sucrose-6-acetate in Nonaqueous Medium

Wang Qing，Zheng Pu，Ni Ye，Sun Zhi-hao
(The Key Laboratory of Industrial Biotechnology，Ministry of Education;School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China)

Synthesis of sucrose-6-acetate in non-aqueous medium from sucrose using lipase was studied.The transesterification conditions including reaction medium，acyl donor，enzyme，water content and temperature were investigated.Results showed that immobilized-lipase Lipozyme TLIM could effectively catalyzed sucrose and vinyl acetate to produce sucrose-6-acetate in the medium composing of DMSO and tert-butyl alcohol.A mole yield of 89.3%was reached when the transesterification was performed as follows:volume ratio of DMSO to tert-butyl alcohol 1∶4，mole ratio of vinyl acetate to sucrose 10∶1，concentration of sucrose 0.06 mmoL/mL，concentration of，enzyme 80mg/mL，reaction temperature of 30℃ and reaction time of 9 h.The structure of the products was also characterized as sucrose-6-acetate by FTIR and NMR.

sucrose-6-acetate，nonaqueous medium，lipase，acyl donor，esterification reaction

碩士研究生(鄭璞教授為通訊作者)。

*國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃“973”(No.2003CB716008)，國家自然科學(xué)基金(No.20473049)項(xiàng)目。

2010－07－13，改回日期:2010－10－08