呂揚(yáng)勇，伍展紅，鄭穗平

(華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州，510006)

重組谷氨酸棒桿菌產(chǎn)蘇氨酸發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化*

呂揚(yáng)勇，伍展紅，鄭穗平

(華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州，510006)

通過基因敲除構(gòu)建了蛋氨酸合成途徑關(guān)鍵酶基因metX缺失的重組谷氨酸棒桿菌R102ΔmetX。采用部分因子實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)考察發(fā)酵培養(yǎng)基中各組分對重組菌產(chǎn)蘇氨酸的影響。結(jié)果表明，葡萄糖、酵母粉和酶解酪素對產(chǎn)蘇氨酸影響顯著。繼而采用最陡爬坡路徑逼近最大響應(yīng)區(qū)域，并結(jié)合中心組合實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面對3個(gè)顯著性因素進(jìn)行分析，得到優(yōu)化的發(fā)酵培養(yǎng)基組成:葡萄糖50.78g/L，酵母粉6g/L，酶解酪素0.99g/L，生物素80μg/L，VB12mg/L，CaCO320g/L，(NH4)2SO415.15g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，KH2PO40.5g/L，K2HPO40.5g/L，F(xiàn)e-SO4·7H2O 0.02g/L，MnSO4·7H2O 0.02g/L，接種量8%。采用該優(yōu)化培養(yǎng)基，供試菌株的胞外蘇氨酸濃度為3.35g/L，較優(yōu)化前提高了30%。

谷氨酸棒桿菌，L-蘇氨酸，響應(yīng)面，培養(yǎng)基優(yōu)化

L-蘇氨酸是人和動(dòng)物體內(nèi)一種必需氨基酸［1］，同時(shí)也是一種重要的營養(yǎng)強(qiáng)化劑，已廣泛應(yīng)用于飼料工業(yè)、保健食品和醫(yī)藥工業(yè)。自1935年 Rose和Meger在纖維蛋白水解物中分離并鑒定出蘇氨酸以來［2］，已發(fā)現(xiàn)的能產(chǎn)生蘇氨酸的微生物主要有以下幾種:大腸桿菌(Escherichiacoli)、谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)、粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratia marcescens)和黃色短桿菌(Brevibacterium flavum)。近年來隨著谷氨酸棒桿菌模式菌株ATCC 13032基因組測序的完成［3］，利用基因工程改造谷氨酸棒桿菌成為現(xiàn)實(shí)［4］。要提高蘇氨酸產(chǎn)量，為進(jìn)一步的育種工作提供好的基礎(chǔ)，除利用基因工程改造以外，發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化也較為重要。目前還未見針對重組谷氨酸棒桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基響應(yīng)面優(yōu)化生產(chǎn)蘇氨酸的相關(guān)報(bào)道。

基于非完全平衡塊原理的Plackett-Burman(PB)法能通過對每個(gè)因子取2水平進(jìn)行分析，通過比較各個(gè)因子兩水平的差異與整體的差異來確定因子的顯著性［5］。響應(yīng)面法(Response Surface Methodology，RSM)可以建立連續(xù)變量曲面模型，并可以同時(shí)對影響產(chǎn)量的各因子水平及其交互作用進(jìn)行優(yōu)化與評(píng)價(jià)。因此PB設(shè)計(jì)及響應(yīng)面法已廣泛應(yīng)用于各類培養(yǎng)基的優(yōu)化研究中［6－7］并取得了良好的效果。本研究利用PB設(shè)計(jì)法，對重組谷氨酸棒桿菌產(chǎn)蘇氨酸培養(yǎng)基的主要影響因子進(jìn)行篩選，然后采用響應(yīng)面法對主要影響因子間的交互作用進(jìn)行了研究，以獲得產(chǎn)蘇氨酸的最優(yōu)培養(yǎng)基，提高重組谷氨酸棒桿菌的產(chǎn)酸能力，為食品工業(yè)蘇氨酸育種提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

重組谷氨酸棒桿菌R102ΔmetX(Corynebacterium glutamicum R102(AHVr)with deletion in the metX gene)，為本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建。

1.1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基:種子培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖40，蛋白胨20，KH2PO41.5，K2HPO40.5，MgSO4·7H2O 0.5，酵母粉 5，生物素 50μg/L。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖100，KH2PO40.5，K2HPO40.5，(NH4)2SO420，MgSO4·7H2O 0.25，F(xiàn)e-SO4·7H2O 0.01，MnSO4·4H2O 0.01，CaCO320，酵母粉5，生物素 400μg/L，VB12mg/L，上述培養(yǎng)基均需要調(diào)整pH值為7.0。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌種活化

將保存在－80℃凍存管中的菌種接于LB固體培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)24 h，劃線轉(zhuǎn)接3次得到活化的菌種。

1.2.2 培養(yǎng)方法

將活化的菌種挑取単菌落接種于種子培養(yǎng)基中，于30℃，200 r/min培養(yǎng)24 h，以10%接種量接于裝有25mL發(fā)酵液的250mL的三角瓶中30℃，215 r/min發(fā)酵72 h，HPLC法檢測胞外蘇氨酸濃度。

1.2.3 發(fā)酵液中蘇氨酸的含量測定

采用高效液相分析系統(tǒng)(HPLC)柱前衍生測定。衍生方法:取發(fā)酵液1mL，12 000 r/min離心5 min，取上清液100μL加入1.5mL離心管中，加入已經(jīng)配制好的衍生緩沖溶液(0.5mol/L NaHCO3溶液，pH9.0)100μL，搖勻后再加入衍生試劑溶液(1%2，4-二硝基氟苯的乙腈溶液)150μL，搖勻，將離心管置于60℃水浴中暗處恒溫加熱60 min后取出，冷卻溶液至室溫后，加入定容緩沖液(0.01mol/L KH2PO4，pH 7.0) 稀釋至1.2mL，用0.22 μm 針筒式過濾器過濾后，用于色譜分析。采用Agilent 1100高效液相色譜儀，Agilent 20RBAX SB－C18(4.6×150 nm，5 μm)色譜柱，紫外檢測器，360 nm 檢測。流動(dòng)相分別為A:乙酸鈉緩沖溶液(pH 6.5，含10mL/L N，N-二甲基甲酰胺)，B:60%乙腈。流動(dòng)相速度為1.0mL/min;柱溫22℃。梯度洗脫程序見表1。

表1 流動(dòng)相梯度程序

測定完畢以后利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算發(fā)酵液中蘇氨酸的含量。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.1 PB實(shí)驗(yàn)

本試驗(yàn)選取12個(gè)因子(變量)進(jìn)行試驗(yàn)，各參數(shù)所代表因子及其水平見表2。每個(gè)試驗(yàn)均進(jìn)行2次，對應(yīng)的響應(yīng)值取2次試驗(yàn)結(jié)果的平均值，評(píng)價(jià)指標(biāo)(響應(yīng)值)為發(fā)酵液中蘇氨酸濃度。

1.3.2 最陡爬坡試驗(yàn)

根據(jù)PB試驗(yàn)結(jié)果得到的一階模型按其回歸系數(shù)的符號(hào)和大小，設(shè)計(jì)顯著因子的最陡爬坡路徑和步長，找出峰值，從而快速接近最大響應(yīng)區(qū)域。

1.3.3 響應(yīng)面分析

由最陡爬坡試驗(yàn)逼近最大響應(yīng)區(qū)域后，采用旋轉(zhuǎn)中心組合設(shè)計(jì)(central composite rotatable design，CCD)法對其進(jìn)行進(jìn)一步研究，以獲得最佳發(fā)酵培養(yǎng)基。用多項(xiàng)式回歸對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，得到一個(gè)描述響應(yīng)值(蘇氨酸濃度)與自變量(發(fā)酵條件)關(guān)系的一個(gè)二次多項(xiàng)式方程(以3因素為例):

表2 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)的因子水平及其編碼

式中:X1、X2、X3為由部分因子實(shí)驗(yàn)確定對響應(yīng)值影響顯著的3種培養(yǎng)基組分的編碼值，Y為預(yù)測響應(yīng)值，即蘇氨酸濃度(g/L)，b0、b1、b2、b3、b11、b12、b13、b22、b23、b33為方程系數(shù)。上述每個(gè)試驗(yàn)均進(jìn)行 2次，對應(yīng)的響應(yīng)值取2次試驗(yàn)結(jié)果的平均值。實(shí)際考察的變量及其試驗(yàn)水平編碼見表3。

表3 旋轉(zhuǎn)中心組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)的因素水平及其編碼

2 結(jié)果與分析

2.1 PB篩選影響蘇氨酸產(chǎn)量的顯著因子

PB試驗(yàn)結(jié)果見表4。通過minitab 15軟件對表4試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表5，各因子顯著性分析見表6

表4 Plackett－Burman設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果

采用minitab 15對表4中的蘇氨酸產(chǎn)量數(shù)據(jù)進(jìn)行逐步回歸分析，剔除掉不顯著因子，得到以蘇氨酸產(chǎn)量為響應(yīng)值的一階回歸方程:

表5 Plackett-Burman試驗(yàn)回歸方程方差分析

回歸方程方差分析(表5)表明，所得方程達(dá)到極顯著(P=0.009)，說明該回歸模型在被研究的整個(gè)回歸區(qū)域擬合的較好。相關(guān)系數(shù)R2=0.92，說明相關(guān)性較好，校正決定系數(shù)AdjR2=0.80，表明80%的試驗(yàn)數(shù)據(jù)的變異性可用此回歸模型來解釋。

表6 Plackett-Burman試驗(yàn)回歸方程系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)

由表6可以看到，影響R102ΔmetX發(fā)酵產(chǎn)蘇氨酸的重要因素為:X1、X2、X4，即葡萄糖、(NH4)2SO4和酶解酪素。3者對蘇氨酸產(chǎn)量的影響均為負(fù)效應(yīng)，在后續(xù)最陡爬坡試驗(yàn)中應(yīng)該降低3者數(shù)值。不顯著因素中 MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O、MnSO4·7H2O為正效應(yīng)，在后續(xù)試驗(yàn)應(yīng)取其高水平;其余均為負(fù)效應(yīng)，在后續(xù)響應(yīng)面試驗(yàn)中應(yīng)取其低水平。

2.2 最陡爬坡試驗(yàn)

最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表7。由表7可知，X1、X2和X43個(gè)因子的濃度在試驗(yàn)4附近時(shí)蘇氨酸濃度最高，故選擇試驗(yàn)4中的各因子的濃度，即葡萄糖55g/L、(NH4)2SO412g/L、酶解酪素0.9g/L為后續(xù)旋轉(zhuǎn)組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)的中心點(diǎn)。

表7 爬坡實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.3 發(fā)酵培養(yǎng)基的響應(yīng)面分析

2.3.1 二次回歸模型擬合及檢驗(yàn)

以2.2中確定的葡萄糖、酵母粉和酶解酪素3個(gè)因子的濃度為中心點(diǎn)，以蘇氨酸濃度Y為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)旋轉(zhuǎn)中心組合試驗(yàn)。根據(jù)試驗(yàn)設(shè)計(jì)表進(jìn)行了20組試驗(yàn)，每組試驗(yàn)重復(fù)2次，取其平均值為響應(yīng)值，結(jié)果見表8。

表8 旋轉(zhuǎn)中心組合設(shè)計(jì)及其試驗(yàn)結(jié)果

對表8試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)回歸擬合，得二次多項(xiàng)式回歸方程為:

式中:Y為蘇氨酸濃度預(yù)測值，X1、X2和X4分別為葡萄糖、(NH4)2SO4和酶解酪素的編碼值。對得到的模型(上述方程)進(jìn)行方差分析和系數(shù)顯著性檢驗(yàn)，方差分析結(jié)果表見表9，顯著性檢驗(yàn)結(jié)果見表10。

由表9可看出，該模型極顯著(P ＜0.000 1)，失擬項(xiàng)不顯著(P=0.212 1＞0.1)。經(jīng)分析計(jì)算，該模型的確定系數(shù)R2=0.969 1，表明模型與實(shí)際情況符合很好，該模型可用于蘇氨酸濃度的預(yù)測。

表9 蘇氨酸濃度預(yù)測回歸模型的方差分析

表10 蘇氨酸濃度預(yù)測回歸方程系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)

表10說明，X1對蘇氨酸濃度Y的影響達(dá)到極顯著水平，即葡萄糖濃度是對試驗(yàn)結(jié)果影響較大的因子，同時(shí)X1與X2、X2與X4對蘇氨酸濃度Y的交互影響均達(dá)極顯著水平;X22、X42對酶活力Y的影響也達(dá)極顯著水平，說明葡萄糖、酶解酪素對蘇氨酸濃度的影響是二次關(guān)系。

2.3.2 響應(yīng)面分析及最佳培養(yǎng)基成分的確定

圖1、圖2、圖3是上述二次多項(xiàng)式擬合出的響應(yīng)曲面圖及其對應(yīng)的等高線圖。

比較3組圖可知，葡萄糖濃度和(NH4)2SO4濃度、(NH4)2SO4濃度和酶解酪素濃度之間的交互作用顯著。葡萄糖濃度和酶解酪素濃度對蘇氨酸濃度的交互作用不顯著。這些直觀的分析結(jié)果與表10的分析一致，說明能真實(shí)地反應(yīng)變量之間的交互作用。

圖1顯示在酶解酪素濃度一定的情況下，葡萄糖和硫酸銨對蘇氨酸濃度的交互影響效應(yīng)。隨著葡萄糖濃度和硫酸銨濃度的不斷增加，蘇氨酸產(chǎn)量開始不斷提高，后期呈現(xiàn)小幅下降。葡萄糖含量在48～60g/L，酶解酪素在10.25～13.75g/L時(shí)，蘇氨酸濃度達(dá)到最高。說明一定程度上提高培養(yǎng)基中葡萄糖的濃度，有利于菌體生長并提高胞外蘇氨酸含量，但過高的濃度對菌體產(chǎn)生高滲作用，不利于菌株生長，從而影響蘇氨酸的分泌量。圖2表示在(NH4)2SO4濃度一定的情況下葡萄糖和(NH4)2SO4對蘇氨酸濃度的影響，當(dāng)葡萄糖濃度為47.2～55.2g/L、酶解酪素濃度為0.78～0.85g/L時(shí)，蘇氨酸濃度最高;圖3表示在葡萄糖濃度一定情況下(NH4)2SO4和酶解酪素對蘇氨酸含量的影響，當(dāng)硫酸銨濃度8.5～13g/L，酶解酪素為0.7～0.9g/L時(shí)，蘇氨酸濃度最高。

圖1 酶解酪素濃度一定時(shí)，葡萄糖和(NH4)2SO4對蘇氨酸的交互影響作用

圖2 (NH4)2SO4濃度一定時(shí)，葡萄糖和酶解酪素濃度對蘇氨酸濃度的影響

圖3 葡萄糖濃度一定時(shí)，(NH4)2SO4和酶解酪素對蘇氨酸含量的影響

方程二次項(xiàng)系數(shù)為負(fù)數(shù)，說明此方程有極大值，其表征的拋物面開口向下(圖1、圖2和圖3)，二次回歸方程分別對X1、X2和X4求一階偏導(dǎo)，整理得如下三元一次方程:

解得:X1=－0.281，X2=0.899，X4=0.468;即對應(yīng)的非編碼水平上3者的條件為:葡萄糖50.78g/L、(NH4)2SO415.15g/L、酶解酪素0.99g/L，此時(shí)蘇氨酸濃度預(yù)測值為3.38g/L。

2.3.3 模型驗(yàn)證

以2.3.2確定的主要因子濃度配制發(fā)酵培養(yǎng)基，重復(fù)3次，然后測定胞外蘇氨酸含量，同時(shí)將初始發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵所得結(jié)果作為對照。結(jié)果顯示，蘇氨酸濃度由優(yōu)化前的2.58g/L上升到3.35g/L，提高了30%，與預(yù)測值較為接近。說明回歸模型能夠真實(shí)地反映各篩選因子對發(fā)酵產(chǎn)蘇氨酸的影響。

3 討論

本文首先采用PB實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，篩選出了影響重組谷氨酸棒桿菌R102ΔmetX產(chǎn)蘇氨酸發(fā)酵過程中的3個(gè)顯著因素:葡萄糖、硫酸銨和酶解酪素。通過最陡爬坡接近最大響應(yīng)區(qū)域后，建立了以蘇氨酸濃度為響應(yīng)值的二次回歸方程模型，最終得到R102ΔmetX產(chǎn)蘇氨酸的最優(yōu)發(fā)酵條件為:葡萄糖50.78g/L，酵母粉6g/L，酶解酪素0.99g/L，生物素80μg/L，VB12 mg/L，CaCO320g/L，(NH4)2SO415.15g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，KH2PO40.5g/L，K2HPO40.5g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.02g/L，MnSO4·7H2O 0.02g/L，接種量8%。在此條件下，實(shí)測蘇氨酸濃度為3.35g/L，與預(yù)測值3.38g/L接近，說明預(yù)測模型可靠性較高，表明PB試驗(yàn)和響應(yīng)面相結(jié)合的試驗(yàn)方法用于優(yōu)化R102ΔmetX產(chǎn)蘇氨酸發(fā)酵條件，不僅科學(xué)合理而且準(zhǔn)確有效。

目前國內(nèi)外利用谷氨酸棒桿菌發(fā)酵生產(chǎn)蘇氨酸的產(chǎn)量普遍較低，2009年解曉鵬等通過誘變得到一株產(chǎn)蘇氨酸的谷氨酸棒桿菌，其發(fā)酵產(chǎn)量為0.31g/L［9］，Ramon等通過基因工程增強(qiáng)了1株谷氨酸棒桿菌產(chǎn)蘇氨酸的能力，達(dá)到6g/L左右［10］。本試驗(yàn)僅僅對發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化，要進(jìn)一步提高重組谷氨酸棒桿菌產(chǎn)蘇氨酸的能力，還需還可以優(yōu)化發(fā)酵條件，并通過基因工程方法進(jìn)一步對該重組菌加以改造獲得高產(chǎn)菌株。

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Medium Optimization Studies for Threonine Production by Recombinant Corynebacterium glutamicum Using Response Surface Methodology

Lv Yang-yong，Wu Zhan-hong，Zheng Sui-ping
(School of Bioscience and Bioengineering，South China University of Technology，Guangzhou 510006，China)

The recombinant Corynebacterium glutamicum R102ΔmetX(R102 with deletion in the metX gene)was constructed.Fractional factorial design was used to evaluate the effects of medium components on the production of threonine.Glucose，yeast extract and enzymatic casein were the most important factors among twelve tested variables that influence the production of threonine.Based on the experimental results，the path of steepest ascent was undertaken to approach the optimal region of these factors.Central composite design and response surface analysis were subsequently employed for further optimization.The optimal medium for threonine synthesis was composed of:glucose 50.78g/L，yeast extract 6g/L，enzymatic casein 0.99g/L，biotin 80μg/L，VB12mg/L，CaCO320g/L，(NH4)2SO415.15g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，KH2PO40.5g/L，K2HPO40.5g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.02g/L，MnSO4·7H2O 0.02g/L，inoculation quantity 8%。Under the optimum conditions，the threonine yield of the recombinant strain was 3.35g/L，which was 30%higher than the original medium components.

Corynebacterium glutamicum，L-threonine，response surface methodology，medium optimization

碩士研究生(鄭穗平副教授為通訊作者)。

*國家科技支撐計(jì)劃(2007BAK36B03)，我國優(yōu)勢傳統(tǒng)食品制造業(yè)關(guān)鍵技術(shù)研究與應(yīng)用(谷氨酸發(fā)酵過程代謝流分析及菌種選育)項(xiàng)目資助。

2010－05－17，改回日期:2010－09－24