楊立紅，阮新，曲慧鴿，馮培勇，胡曉明

1(魯東大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東煙臺，264025)2(煙臺進出口檢驗檢疫局，山東煙臺，264000)

魚腥藻藻藍蛋白作為食品著色劑的穩(wěn)定性研究

楊立紅1，阮新2，曲慧鴿1，馮培勇1，胡曉明1

1(魯東大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東煙臺，264025)2(煙臺進出口檢驗檢疫局，山東煙臺，264000)

以魚腥藻為材料，提取得到了純度為A620/A280=1.958的藻藍蛋白，研究了該藻藍蛋白作為食品著色劑在應(yīng)用中的保藏條件及食品添加劑對其穩(wěn)定性的影響。實驗結(jié)果表明:作為食品著色劑的藻藍蛋白在保藏中，溫度、光照及pH值對其穩(wěn)定性均有一定影響，保藏條件為:pH中性、低溫避光保存。不同食品添加劑對藻藍蛋白穩(wěn)定性有不同的影響，糖、苯甲酸、維生素C、赤蘚醇可以提高藻藍蛋白的色澤，乙醇、檸檬酸、山梨酸鉀、肌醇、硫酸鎂、碳酸氫鈉和羧甲基纖維素鈉可使藻藍蛋白的色澤減弱。

魚腥藻，藻藍蛋白，食品著色劑，穩(wěn)定性

藻藍蛋白(Phycobiliprotein)是某些藻類特有的重要捕光色素蛋白，白呈現(xiàn)出鮮艷的寶石藍色，又可以作為天然色素被廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)中。藻藍蛋白作為食品著色劑不僅避免了人工合成色素對人體的傷害，同時它具有在抗輻射、抑制腫瘤、抗氧化、增強免疫力等方面具有較高的活性［1－3］。我國規(guī)定藻藍蛋白作為食品著色劑，可用于果凍、糖果、奶酪、果汁(味)飲料類、雪糕和冰棍等食品中，但由于藻藍蛋白的色澤具有不穩(wěn)定性，使用時會受到防腐劑、酸度調(diào)節(jié)劑及營養(yǎng)強化劑等不同食品添加劑及保藏條件的影響，而使之在作食品著色劑的應(yīng)用上受到限制。本文對常用食品添加劑對藻藍蛋白色澤的影響及其最佳保藏條件進行了研究，旨在為藻藍蛋白作為天然色素在食品工業(yè)中得到更加廣泛的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

目前作為著色劑使用的藻籃蛋白絕大部來自螺旋藻［4］，但螺旋藻需在堿性環(huán)境(pH11)下生長，在培養(yǎng)過程中需添加大量NaHCO3，不僅增加成本，同時產(chǎn)品中殘留的NaHCO3不易去除干凈，不適合作食品添加劑等使用。魚腥藻(Anabeana)屬淡水藻，pH條件適中，培養(yǎng)中不需添加NaHCO3，生產(chǎn)成本低，操作簡單，生長速度快、產(chǎn)量高，一年四季均可生產(chǎn)，產(chǎn)物不含任何有害物質(zhì)。且魚腥藻藻藍蛋白含量(9%左右)與螺旋藻藻藍蛋白含量(10%左右)相當(dāng)［5］，所以魚腥藻是一種價廉易得的藻藍蛋白原料資源。

1 材料、試劑與儀器

魚腥藻藻種為水華魚腥藻(編號為VTEX－131444，無毒)，中科院武漢水生研究所提供，由本實驗室自行培養(yǎng)。

檸檬酸、肌醇及維生素C等試劑均為國產(chǎn)分析純。

UT－2000型紫外可見分光光度計，尤尼柯儀器有限公司;高速冷凍離心機，美國Thermo Scientific公司。

2 試驗方法

2.1 魚腥藻藻藍蛋白提取制備

魚腥藻藻藍蛋白(Anabaena Phycocyanin)的制備，按楊立紅等［3］的方法。測定藻藍蛋白樣品溶液在波長為750 nm、650 nm、620 nm、615 nm、280 nm 處的光吸收值后，根據(jù):C=［(A615－A750)－(A650－A750) ×0.474］/5.34［8］計算出藻藍蛋白的含量，按純度=A620/A280計算藻藍蛋白的純度。藻藍蛋白色澤強弱由其特征光吸收值(即A620nm值)大小判斷，A620nm值越大色澤越深，反之越淺。

2.2 溫度、光照及pH值對藻藍蛋白色澤的影響

取9個試管分3組，分別加入濃度為0.110mg/mL的藍蛋白溶液8mL，包裹上2層黑色塑料袋使其不透光。將3組試管分別置于4、25、35℃下，每隔24 h測定每個試管中藻藍蛋白溶液在A620nm處的光吸收值，計算每組試管吸光值的平均值，繪制其變化曲線。取9個試管分3組，分別加入濃度為0.110mg/mL的藍蛋白溶液8mL，將3組試管分別在20℃條件下避光(黑色塑料袋2層包裹)、自然光、強光(15 W日光燈，距離20cm直射)放置。每隔24 h測定每個試管中藻藍蛋白溶液在A620nm處的光吸收值，計算每組試管吸光值的平均值，繪制其變化曲線。取10支試管，分別加入pH值2～11的PBS緩沖液8mL，各管分別加入等量的藻藍蛋白，混勻。測定溶液在A620nm處的吸光值。同樣操作重復(fù)3次，取吸光值的平均值，繪制吸光值的變化曲線。

2.3 食品添加劑對藻藍蛋白色澤的影響

2.3.1 糖、乙醇對藻藍蛋白色澤的影響

取27支試管分9組，每組試管中分別加入濃度為0.110mg/mL的藻藻藍蛋白溶液8mL，在1～8組試管中分別加入適量蔗糖，各組糖的濃度分別為為5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%，第 9 組試管為不加蔗糖的對照管，室溫(25℃)避光放置，每隔1d測定每個試管中藻藍蛋白溶液在A620nm處的光吸收值，計算每組試管吸光值的平均值，繪制其變化曲線。方法同上，取27個試管分9組，每組試管中分別加入濃度為0.110mg/mL的藻藻藍蛋白溶液8mL，在1～8組試管中分別加入等體積的乙醇2mL，使之各組乙醇的濃度分別為5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%，第9組試管為對照組。

2.3.2 防腐劑、酸度調(diào)節(jié)劑及營養(yǎng)強化劑對藻藍蛋白色澤的影響

選擇2種常用的食品防腐劑，即山梨酸鉀和苯甲酸。參考國家規(guī)定，山梨酸鉀在果汁飲料和果凍中最大使用量是0.5 g/kg，苯甲酸在果汁飲料中最大使用量是1.0 g/kg［7］。取9支試管，各加入濃度為0.110mg/mL的藻藍蛋白溶液8mL，分3組，第1組試管中各加入山梨酸鉀4.0mg，第2組試管各加入苯甲酸8.0mg，第3組為對照組。室溫(25℃)避光放置，每0.5 h測定各管中藻藍蛋白溶液在A620nm處的吸光值。繪制其變化曲線。方法同上，選擇常用的食品酸度調(diào)節(jié)劑檸檬酸，參考國家規(guī)定，檸檬酸在果汁類中的使用量一般為0.1%～0.3%［9］。取12支試管，各加入濃度為0.110mg/mL的藻藍蛋白溶液8mL，分4組，1～3組試管中各加入檸檬酸，使之檸檬酸濃度分別為0.1%、0.2%、0.3%。第4組試管為對照組。選擇常用的營養(yǎng)強化劑VC、肌醇、MgSO4。維生素C在強化飲料及乳飲料中使用量為120～240 mg/kg，肌醇在飲料中的使用量為25～30 mg/kg，MgSO4在礦物質(zhì)飲料中最大使用量為50 mg/kg［7］。取12支試管，各加入濃度為0.110mg/mL的藻藍蛋白溶液8mL，分4組。第1組試管中加入維生素C 1.92mg，第2組試管中加入肌醇0.24mg，第3組試管中加入Mg-SO40.4mg，第4組為對照組。測定方法同上。

2.3.3 甜味劑、增稠劑和膨松劑對藻藍蛋白色澤的影響

赤蘚糖醇是低熱量甜味劑?？捎糜谔枪④涳嬃现?，最大使用量為3%，羧甲基纖維素鈉做增稠劑。在飲料中最大使用量是1.2 g/kg，常用化學(xué)膨松劑碳酸氫鈉，我國規(guī)定可用于各類需添加膨松劑的食品中，使用量一般為0.3%［7］。取12支試管，各加入濃度為0.110mg/mL的藻藍蛋白溶液8mL，分4組。第1組試管中加入赤蘚糖醇240mg，第2組各加入羧甲基纖維素鈉9.6mg，第3組試管中加入NaHCO324 mg，第4組為對照。測定方法同2.3.2。

3 結(jié)果

3.1 魚腥藻藻藍蛋白的含量及純度測定結(jié)果

采用1.1方法提取的魚腥藻藻藍蛋白的含量為3.61mg/mL，純度為A620/A280=1.958。符合食品著色劑純度(A620/A280＞0.7)要求。

3.2 溫度、光照及pH對藻藍蛋白色澤的影響結(jié)果(圖1－3)

從圖1可以看出，保存溫度對藻藍蛋白色澤的變化有明顯的影響。保存到第7天，4℃低溫條件下，藻藍蛋白A620nm下降了14.2%，室溫(25℃)和35℃ 分別下降了68%和86.8%。保存溫度越低，色澤減弱程度越小，反之則越大。，黑暗和自然光下2d時(圖2)，A620nm吸光值均下降了7%，強光下下降了13%;5d時，黑暗和自然光分別下降了34.1%和40.1%，強光下降了73.7%。隨著保存時間增加，在強光照射下，藻藍蛋白變化最大。由此可看出，避光和自然光對藻藍蛋白色澤減弱程度較強光直射對藻藍蛋白色澤減弱程度小。在pH值4～7條件下A620nm處吸光值變化較小(圖3)。在pH值2～3酸性條件下A620nm處吸光值下降了約84%，在pH值8～11堿性條件下藻藍蛋白溶液A620nm明顯降低，pH值8下降了約36%，pH值9下降了43%，pH值10下降了86%，pH值11下降了92%，其最適pH值在5.0附近。在pH值4～7的均可使用藻藍蛋白做著色劑。

3.3 食品添加劑對藻藍蛋白色澤影響的測定結(jié)果

3.3.1 糖、乙醇對藻藍蛋白色澤的影響測定結(jié)果

圖1 溫度對藻藍蛋白色澤的影響

圖2 光照對藻藍蛋白色澤的影響

圖3 pH值對藻藍蛋白色澤的影響

糖、乙醇對藻藍蛋白色澤的影響測定結(jié)果見圖4和圖5。

圖4 糖對藻藍蛋白色澤的影響

圖5 乙醇對藻藍蛋白色澤的影響

從圖4可以看出，與對照相比，含有不同糖濃度的藻藍蛋白在保存相同時間后其色澤均有不同程度的增加，保存6 d時，糖濃度由5%增加到40%，藻藍蛋白A620nm值增加率從5.1%逐漸提高到37.3%，由此可見，糖對藻藍蛋白的色澤有增強作用。且隨糖濃度增大對藻藍蛋白色澤的增強作用越大。與對照相比，藻藍蛋白在不同濃度的乙醇中的色澤隨著乙醇濃度的增加均逐漸減弱(圖5)。7 h時，乙醇體積分?jǐn)?shù)從5%增加到40%過程中，A620nm吸收值下降率依次為 0.35% 、3.44% 、7.36% 、11.04% 、20.7% 、27.6% 、45.9%和58.3%。因此，若將藻藍蛋白加入含乙醇的飲料中，應(yīng)考慮乙醇濃度不宜超過15%，即可保留藻藍蛋白色澤的90%以上。

3.3.2 防腐劑、酸度調(diào)節(jié)劑及營養(yǎng)強化劑對藻藍蛋白色澤的影響的測定結(jié)果

圖6 防腐劑對藻藍蛋白色澤的影響

圖7 檸檬酸對藻藍蛋白色澤的影響

從圖6可以看出，與對照相比，山梨酸鉀使藻藍蛋白的色澤減弱，A620nm吸光值最大降低率為3.31%。苯甲酸使藻藍蛋白的色澤增強，其A620吸收值增加率為6.82%，。因此，在應(yīng)用藻藍蛋白作為著色劑的食品中使用苯甲酸作為防腐劑比山梨酸鉀更適宜。檸檬酸濃度對藻藍蛋白色澤有減弱作用(圖7)，隨檸檬酸濃度濃度增加，對其色澤的影響逐漸增大，當(dāng)檸檬酸濃度為0.1%時，放置2.5 h時，A620吸收值減低率為2.36%，檸檬酸濃度0.2%和0.3%條件下，放置2.5 h時，A620吸收值減低率為67.9%和71%。檸檬酸濃度為0.1%時對藻藍蛋白影響較小，因此，使用檸檬酸做酸度調(diào)節(jié)劑時檸檬酸的濃度不宜超過0.1%。維生素C對提高藻藍蛋白的色澤促進作用(圖8)，使藻藍蛋白特征吸收峰A620吸收值增加，最大增加率為7.75%。肌醇和硫酸鎂均使藻藍蛋白特征吸收峰A620吸收值下降，對藻藻藍蛋白的色澤有減弱作用，肌醇A620最大下降率為5.67%，硫酸鎂最大下降率為10.1%。因此在應(yīng)用藻藍蛋白作為著色劑時不宜使用肌醇和硫酸鎂作為營養(yǎng)強化劑，可使用維生素C作為營養(yǎng)強化劑。

圖8 營養(yǎng)強化劑對藻藍蛋白色澤的影響

3.3.3 甜味劑、增稠劑、膨松劑對藻藍蛋白色澤的影響的測定結(jié)果

從圖9可以看出，赤蘚醇使藻藍蛋白特征吸收峰A620nm吸收值增加，因而可增加藻藍蛋白的色澤。最大增加率為7.95%。羧甲基纖維素鈉和碳酸氫鈉均使藻藍蛋白特征吸收峰A620吸收值下降，最大下降率分別為15.6%和12.9%。因此在應(yīng)用藻藍蛋白作為著色劑的食品中不宜使用羧甲基纖維素鈉作為增稠劑及使用碳酸氫鈉作為膨松劑。

圖9 甜味劑、增稠劑、膨松劑對藻藍蛋白色澤的影響

4 討論

本實驗研究了不同保藏條件及常用食品添加劑對藻藍蛋白作為食品著色劑的影響，結(jié)果表明，藻藍蛋白作為食品著色劑最佳保藏條件是:pH中性條件下低溫避光保存。研究表明，在影響藻藍蛋白色澤穩(wěn)定性的因素中，溫度影響更為顯著。其次是光照。提示人們將藻藍蛋白用于食品著色劑中高溫加熱過程會對藻藍蛋白色澤有較大的影響，因而藻藍蛋白更適宜于作為冷飲、冰欺凌等食品的著色劑。常用食品添加劑對藻藍蛋白色澤是穩(wěn)定性的影響不同，糖、苯甲酸、維生素C、赤蘚醇對藻藍蛋白A620nm特征吸收值有增加作用，可以提高藻藍蛋白的色澤，尤其糖對藻藍蛋白的色澤具有明顯的增強作用，這一結(jié)果與張以芳等的研究一致［4］。檸檬酸、山梨酸鉀、肌醇、硫酸鎂、碳酸氫鈉和羧甲基纖維素鈉對藻藍蛋白A620nm特征吸收值有降低作用，因而使藻藍蛋白的色澤減弱。使用這些添加劑的食品不宜使用藻藍蛋白作為著色劑。乙醇可減弱藻藍蛋白色澤，濃度越高，對藻藍蛋白的色澤破壞越嚴(yán)重，在乙醇濃度小于15%時對藻藍蛋白的色澤減弱程度稍小，因此在含乙醇的飲品中使用藻藍蛋白作為著色劑應(yīng)考慮乙醇濃度要適宜，不易大于15%。

對上述結(jié)果產(chǎn)生的原因，筆者認(rèn)為，藻藍蛋白的色澤是由蛋白及發(fā)色團共同決定的，藻藍蛋白由載體蛋白和發(fā)色團——開鏈線性延展的四吡咯化合物組成，載體蛋白和發(fā)色團通過硫醚鍵連接，氨基酸序列分析表明，每個發(fā)色團均連接在載體蛋白的半胱氨酸殘基上。每分子藻藍蛋白含二條多肽鏈α和β，其分子質(zhì)量大約為17～18 u，每條多肽鏈含一個或多個共價連結(jié)的發(fā)色團，藻藍蛋白的色澤不單是由發(fā)色團決定的，每個發(fā)色團的光譜學(xué)特性還受構(gòu)象和環(huán)境影響，例如藻藍蛋白和別藻藍蛋白均帶有藻藍素基團，但藻藍蛋白在620 nm處有最大吸收值而別藻藍蛋白在650 nm處有最大吸收值 。此外，αβ單體之間的相互作用也很重要［8－9］，不同食品添加劑對藻藍蛋白的色澤的影響很可能是這些添加劑影響了藻藍蛋白的蛋白構(gòu)象，或改變了αβ單體之間的相互作用，使其表現(xiàn)為在A620nm的特征發(fā)生改變，而影響其色澤。

本實驗采用的魚腥藻為無毒藻種，使用其他魚腥藻藻種生產(chǎn)藻藍蛋白用于食品著色劑中必須符合國家衛(wèi)生檢驗標(biāo)準(zhǔn)。

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The Stability Research on the Anabaena phycocyanin as a Colouring Agent for Food

Yang Li-hong1，Ruan Xin2，Qu Hui-ge1，F(xiàn)eng Pei-yong1，Hu Xiao-ming1
1(College of Life Sciences，Ludong University，Yantai 264025，China)2(Yantai Exit-entry inspection and Quarantine Bureau，Yantai，264000，China)

The phycocyanin with a purity of A620/A280=1.958 was extracted from Anabaena.This research focuse on the storage conditions in which the phycocyanin was used as the colouring agent for food，and the influence on the stability of the colouring agent for food applied by the storage conditions.The results demonstrated that:the temperature，sunshine and pH had certain influences on the phycocyanin as a colouring agent for food during its storage.The best condition in which the phycocyanin functions as the colouring agent for food lied in the following factors:the phycocyanin was storaged away from the light under lower temputure in pH neutral conditions.Different food colour agents have different level of influence on the phycocyanin.Sugar，benzoic acid，vitamin C，phycite can enhance the luster of the color，and ehanol，citric acid，potassium sorbate，inositol，magnesium sulfate，and sodium bicarbonate，sodium carboxymethyl cellulose can dothe opposite.

Anabaena，phycocyanin，colouring agent for food，stability

博士，講師。

2009－12－07，改回日期:2010－05－19