熊元林,陽 晗,劉雯雯,丁澤琴

（武漢生物工程學(xué)院生物工程系,湖北武漢 430415）

腸膜狀明串珠菌葡聚糖亞種的分離鑒定及產(chǎn)乳酸研究

熊元林,陽 晗,劉雯雯,丁澤琴

（武漢生物工程學(xué)院生物工程系,湖北武漢 430415）

從傳統(tǒng)泡菜中分離出27株乳酸菌,經(jīng)過初篩和復(fù)篩得到產(chǎn)乳酸量較高的菌株P(guān)C09,經(jīng)鑒定該菌屬腸膜狀明串珠菌葡聚糖亞種（Leuconostocmesenteroidessubsp.dex tranicum）;從番茄汁添加與否、發(fā)酵溫度、轉(zhuǎn)速、接種量等方面對 PC09產(chǎn)酸條件進行了研究。結(jié)果表明,在添加1%（體積分數(shù)）番茄汁、發(fā)酵溫度為33℃、轉(zhuǎn)速為100 r·min-1、接種量為2.0%的最佳產(chǎn)酸條件下,產(chǎn)酸量達到4.17%。

泡菜;乳酸菌;乳酸;發(fā)酵;正交實驗

乳酸菌是重要的益生菌種,其發(fā)酵產(chǎn)物乳酸是重要的生物化工產(chǎn)品,廣泛應(yīng)用于食品釀造、生物制藥、卷煙、皮革、印染、化工、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域[1,2]。由L2乳酸合成的聚乳酸是替代塑料的理想材料[3,4]。

目前,國內(nèi)外乳酸的生產(chǎn)方法主要有化學(xué)合成法和微生物發(fā)酵法[5]。作者從泡菜中分離出27株乳酸菌,從中篩選出一株產(chǎn)乳酸較多的菌種,經(jīng)鑒定為腸膜狀明串珠菌葡聚糖亞種（Leuconostoc mesenteroidessubsp.dex tranicum）,對其發(fā)酵產(chǎn)乳酸的條件進行了研究。為發(fā)酵法生產(chǎn)乳酸提供了理論依據(jù),并且豐富了發(fā)酵法產(chǎn)乳酸的菌種。

1 實驗

1.1 材料與試劑

新鮮泡菜汁。

革蘭氏染色液,BTB2MR試劑等。

1.2 培養(yǎng)基

分離培養(yǎng)基[6]：M RS培養(yǎng)基、APT培養(yǎng)基、SL培養(yǎng)基、HP培養(yǎng)基、蔗糖硫胺培養(yǎng)基等。

鑒定培養(yǎng)基[6]：PY培養(yǎng)基。

發(fā)酵培養(yǎng)基[7]：葡萄糖 50 g,蛋白胨5 g,乙酸鈉5 g,M gSO4·7H2O 0.2 g,吐溫280 1 m L,M nSO4·H2O 0.0076 g,FeSO4·7H2O 0.01 g,NaCl 0.01 g,ZnSO4·7H2O 0.2 g,蒸餾水 1 L,調(diào) p H 值 5.9～6.7,115℃滅菌30 min。

1.3 菌種的分離純化

采用夾層平板法分離乳酸菌。樣品稀釋后涂于MRS2CaCO3培養(yǎng)基,迅速倒入5 m L冷卻至 45℃的半固體培養(yǎng)基,形成雙層平板,以隔絕空氣;培養(yǎng)后用接種針劃開表層瓊脂,將菌落在平板上劃線分離,同樣覆蓋一層半固體培養(yǎng)基。

1.4 菌種的鑒定

按文獻[6]方法進行乳酸菌鑒定。

1.5 乳酸含量的測定

采用EDTA定鈣法測定發(fā)酵液中乳酸的含量[8]。

1.6 發(fā)酵產(chǎn)酸條件的優(yōu)化

從蕃茄汁添加與否、發(fā)酵溫度、轉(zhuǎn)速、接種量等方面進行單因素實驗,確定較適宜的發(fā)酵條件。根據(jù)單因素實驗結(jié)果,以發(fā)酵溫度、轉(zhuǎn)速、接種量為考察因素、以產(chǎn)酸量為考核指標,進行L9（34）正交實驗,以確定最佳發(fā)酵條件。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌種分離鑒定

2.1.1 菌種分離結(jié)果

從泡菜汁中分離純化得到27株乳酸菌,分別編號為PC01～PC27。根據(jù)平板上CaCO3溶解圈的大小進行初篩,然后搖瓶復(fù)篩,得到產(chǎn)酸量較高的菌株P(guān)C09。

2.1.2 PC09菌株鑒定結(jié)果

生物學(xué)特性：細胞球形,呈鏈狀,革蘭氏陽性,不運動,無芽孢,兼性厭氧,接觸酶陰性,不產(chǎn)生吲哚,無還原硝酸鹽能力,不能在p H值4.8以下生長,能發(fā)酵蔗糖產(chǎn)葡聚糖,菌落光滑圓整,乳白色。PC09發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)酸實驗結(jié)果見表1。

表1 PC09菌株發(fā)酵碳水化合物的結(jié)果Tab11 Fermentation results of carbohydrates by PC09

根據(jù)文獻[6],判定PC09菌株為腸膜狀明串珠菌葡聚糖亞種（Leuconostoc mesenteroidessubsp.dex t2ranicum）。

2.2 添加番茄汁對PC09發(fā)酵產(chǎn)酸的影響

在基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中添加1%（體積分數(shù),下同）番茄汁進行發(fā)酵,測定產(chǎn)酸量,并與不加番茄汁的發(fā)酵產(chǎn)酸量進行比較,結(jié)果見圖1。

圖1 番茄汁對PC09發(fā)酵產(chǎn)酸的影響Fig.1 Effect of tomato juice on fermentation of PC09

由圖1可以看出,發(fā)酵培養(yǎng)基中添加1%的番茄汁有利于PC09產(chǎn)生乳酸。主要是由于番茄汁中含有大量生長因子而有利于該菌的生長及產(chǎn)酸。

2.3 發(fā)酵溫度對PC09發(fā)酵產(chǎn)酸的影響

在添加1%番茄汁的基礎(chǔ)上,分別于27℃、29℃、31℃、33℃、35℃、37℃、39℃進行發(fā)酵 ,測定產(chǎn)酸量 ,結(jié)果見圖2。

由圖2可以看出,發(fā)酵溫度為35℃時,產(chǎn)酸量最大。

2.4 轉(zhuǎn)速對PC09發(fā)酵產(chǎn)酸的影響

在添加1%番茄汁、35℃條件下,分別采用60 r·m in-1、80 r·min-1、100 r·m in-1120 r·min-1、140 r·min-1、160 r·min-1、180 r·min-1轉(zhuǎn)速進行發(fā)酵 ,測定產(chǎn)酸量,結(jié)果見圖3。

圖2 發(fā)酵溫度對PC09發(fā)酵產(chǎn)酸的影響Fig.2 Effect of fermentation temperature on fermentation of PC09

圖3 轉(zhuǎn)速對PC09發(fā)酵產(chǎn)酸的影響Fig.3 Effect of rotating speed on fermentation of PC09

由圖3可以看出,轉(zhuǎn)速為100 r·m in-1時,產(chǎn)酸量最大。

2.5 接種量對PC09發(fā)酵產(chǎn)酸的影響

在添加1%番茄汁、35℃、100 r·min-1的條件下,分別采用 1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%的接種量進行發(fā)酵,測定產(chǎn)酸量,結(jié)果見圖4。

圖4 接種量對PC09發(fā)酵產(chǎn)酸的影響Fig.4 Effect of inoculum amoun t on fermen tation of PC09

由圖4可以看出,接種量為2.0%時,產(chǎn)酸量達到最大。

2.6 正交實驗結(jié)果

根據(jù)單因素實驗結(jié)果,以發(fā)酵溫度、轉(zhuǎn)速、接種量為考察因素,每個因素選擇3個水平,以產(chǎn)酸量為考核指標進行正交實驗。因素與水平見表2,結(jié)果與分析見表3。

表2 正交實驗因素與水平Tab12 Factorsand levels of orthogonal experiment

表3 正交實驗結(jié)果與分析Tab13 Resultsand analysis of orthogonal experiment

由表3可以看出,各因素對產(chǎn)酸量影響大小依次為B>A>C,即轉(zhuǎn)速對 PC09產(chǎn)酸影響最大。這可能是因為腸膜狀明串珠菌葡聚糖亞種屬于兼性厭氧微生物,高濃度氧氣反而對其產(chǎn)酸不利。最優(yōu)組合為A1B2C2,即發(fā)酵溫度33℃、轉(zhuǎn)速100 r·min-1、接種量2.0%,此時產(chǎn)酸量達到4.17%。

2.7 討論

（1）夾層平板法是分離純化乳酸菌的較好方法,主要是因為乳酸菌多數(shù)屬于厭氧或兼性厭氧;少數(shù)屬于微好氧,上層半固體瓊脂一方面能隔絕空氣,另一方面也不妨礙菌種挑取。

（2）由于乳酸菌多數(shù)為厭氧微生物,所以發(fā)酵過程中搖瓶轉(zhuǎn)速不宜過快。

3 結(jié)論

從傳統(tǒng)泡菜中分離出27株乳酸菌,經(jīng)過初篩和復(fù)篩得到產(chǎn)乳酸量較高的菌株P(guān)C09,經(jīng)鑒定該菌屬腸膜狀明串珠菌葡聚糖亞種,在添加1%番茄汁、發(fā)酵溫度為33℃、轉(zhuǎn)速為100 r·min-1、接種量為2.0%的最佳產(chǎn)酸條件下,產(chǎn)酸量達到4.17%。

[1] Litchfield J H.Microbiological production of lactic acid[J].Adv Appl Microbiol,1996,42：45295.

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[3] 金其榮,張繼民,徐勤.有機酸發(fā)酵工藝學(xué)[M].北京：中國輕工業(yè)出版社,1997：3392340.

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Isolation,Iden tification of Leuconostoc M esenteroides Subsp.Dextranicum and Study on Acid2Production Conditions

XIONGYuan2lin,YAGN Han,L IUWen2wen,D ING Ze2qin
（Department of B ioengineering,W uhan B ioengineering Institute,W uhan430415,China）

Total 27 strains of lactic acid bacteria were isolated from home2made pickles.After screening and re2 screening,strain PC09 producing higher amountof lactic acid wasobtained and determined asLeuconostocmesenteroidessubsp.dextranicum.The acid2p roduction conditions for PC09 such as the tomato juice adding or not,fermentation tem2 perature,rotating speed,inoculum amount were studied.The results showed that the acid2p roduction reached 4.17%under the optimum conditions as follow s：adding 1%tomato juice,fermentation temperature 33℃,rotating speed 100 r·min-1and inoculum amount 2.0%.

pickles;lactic acid bacterium;lactic acid;fermentation;o rthogonal experiment

Q 93919 TS 201.3

A

1672-5425（2010）06-0059-03

武漢生物工程學(xué)院校基金資助項目（200704）

2010-03-16

熊元林（1978-）,男,湖北麻城人,碩士,講師,研究方向：應(yīng)用微生物。E2mail：coolice2hust@sohu.com。