問清江,慕 娟,孫曉宇,丁 浩
(陜西省微生物研究所,陜西 西安 710043)
腸膜狀明串珠菌(Leuconstocmesenteriodes)能夠以蔗糖為碳源產(chǎn)生右旋糖酐蔗糖酶(Dextransucrase,EC 2.4.5.1),該酶是一種葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(Glucosyltransferases),可以蔗糖為底物,將蔗糖分子中的D-吡喃葡萄糖基催化轉(zhuǎn)移到葡聚糖分子中,可以生成不同分子量的右旋糖酐(α-葡聚糖),同時(shí)生成果糖[1-3]。右旋糖酐是α-葡聚糖,是若干葡萄糖脫水形成的高分子聚合物,主要由α-1,6糖苷鍵連接而成[4]。右旋糖酐安全、無毒,且結(jié)構(gòu)疏松柔軟,具有較好的水溶性及持水性,被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、色譜分析、石油工業(yè)等領(lǐng)域[5]。在研究金屬離子對腸膜狀明串珠菌Lm-1226產(chǎn)右旋糖酐發(fā)酵影響中發(fā)現(xiàn),Mn2+對發(fā)酵液中的果糖和右旋糖酐兩種代謝產(chǎn)物的影響結(jié)果不同。因此研究Mn2+對腸膜狀明串珠菌Lm-1226產(chǎn)右旋糖酐的影響,首先研究Mn2+對腸膜狀明串珠菌Lm-1226生長的作用,然后是Mn2+對發(fā)酵中果糖、右旋糖酐和右旋糖酐蔗糖酶產(chǎn)生的影響,最后是Mn2+對右旋糖酐蔗糖酶作用的影響。對作用機(jī)理進(jìn)行了初步探索,為現(xiàn)行的右旋糖酐發(fā)酵生產(chǎn)及未來右旋糖酐蔗糖酶合成右旋糖酐提供參考,另外當(dāng)有類似于Mn2+等具有氧化還原性物質(zhì)存在時(shí),利用氧化還原反應(yīng)檢測代謝產(chǎn)物就會(huì)對檢測結(jié)果產(chǎn)生影響,在遇到具體問題應(yīng)考慮影響的存在,并改進(jìn)方法消除影響。
1.1.1 菌株Leuconstocmesenteriodes-1226 (Lm-1226)(中國藥品生物制品檢定所)。
1.1.2 培養(yǎng)基(g/L) 白砂糖120,蛋白胨 1.7,磷酸氫二鈉1.4,pH 7.0。
1.1.3 試劑與儀器 果糖(D-(-)-fructose),Sigma 公司產(chǎn)品;3,5-二硝基水楊酸(DNS),化學(xué)純;其他試劑為市售分析純;白砂糖(市售一級)。722分光光度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司);SPX-150BIII生華培養(yǎng)箱;GH-500型隔水式培養(yǎng)箱(北京科偉永興儀器有限公司);101型電熱鼓風(fēng)干燥箱(北京科偉永興儀器有限公司)。
1.2.1 Mn2+對腸膜狀明串珠菌Lm-1226生長的影響 采用比濁法測定菌體生物量,以0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L不同濃度將氯化錳加入液體培養(yǎng)基中,不加氯化錳為對照,將腸膜狀明串珠菌Lm-1226接入,25 ℃靜止培養(yǎng)24 h,于600 nm下測OD值。
1.2.2 Mn2+對腸膜狀明串珠菌Lm-1226發(fā)酵產(chǎn)果糖的影響 保持發(fā)酵培養(yǎng)基的其他成分不變,以1.0、3.0、5.0、7.0、9.0 mmol/L不同濃度將氯化錳加入發(fā)酵培養(yǎng)基中,不加氯化錳為對照,將種子培養(yǎng)液以10%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基,25 ℃靜止培養(yǎng)24 h,測定發(fā)酵液的果糖。
1.2.3 Mn2+對腸膜狀明串珠菌Lm-1226發(fā)酵產(chǎn)右旋糖酐的影響 保持發(fā)酵培養(yǎng)基的其他成分不變,以0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L不同濃度將氯化錳加入發(fā)酵培養(yǎng)基中,不加氯化錳為對照,將種子培養(yǎng)液以10%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基,25 ℃靜止培養(yǎng)24 h。將75%乙醇按135 mL/100 mL發(fā)酵液加入到發(fā)酵液中,充分?jǐn)嚢杈鶆?,放置,收集沉淀,沉淀?5%乙醇洗滌3次,烘干為右旋糖酐。
1.2.4 Mn2+對腸膜狀明串珠菌Lm-1226發(fā)酵產(chǎn)右旋糖酐蔗糖酶的影響 保持發(fā)酵培養(yǎng)基的其他成分不變,以0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、3.0、5.0、7.0、9.0 mmol/L不同濃度將氯化錳加入發(fā)酵培養(yǎng)基中,不加氯化錳為對照,將種子培養(yǎng)液以10%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基,25 ℃靜止培養(yǎng)24 h,測定發(fā)酵液右旋糖酐蔗糖酶活力。
1.2.5 Mn2+對右旋糖酐蔗糖酶作用的影響 右旋糖酐發(fā)酵液進(jìn)行一定的稀釋,10 000 r/min離心15 min,收集上清液為右旋糖酐蔗糖酶酶液,在適當(dāng)稀釋的酶液中加入2.5、5.0、7.0、10.0、12.5、15.0 mmol/L不同濃度的Mn2+,以蔗糖為底物,右旋糖酐蔗糖酶在Mn2+濃度為1.25、2.5、3.5、5.0、6.25、7.5 mmol/L不同反應(yīng)體系中作用,測定酶活力,以確定Mn2+對右旋糖酐蔗糖酶作用的影響。
1.2.6 果糖和右旋糖酐蔗糖酶活力測定[6]采用DNS法測定右旋糖酐蔗糖酶活力。配制1 mg/mL果糖標(biāo)準(zhǔn)溶液,分別量取0.3、0.35、0.4、0.45、0.5 mL果糖標(biāo)準(zhǔn)溶液,用蒸餾水補(bǔ)齊1.0 mL,再加入2.0 mL DNS,沸水浴2 min,流水冷卻后加蒸餾水至10 mL,在540 nm測定光吸收值,繪制果糖標(biāo)準(zhǔn)曲線,得出回歸方程用于果糖和酶活的測定。將發(fā)酵液用蒸餾水適當(dāng)稀釋為待測樣品,取1.0 mL樣品,加入2.0 mL DNS溶液,沸水浴2 min顯色,其余同果糖標(biāo)準(zhǔn)曲線,發(fā)酵液相對應(yīng)的發(fā)酵培養(yǎng)基同樣品測定作為空白對照(Mn2+與DNS發(fā)生反應(yīng)),以蒸餾水為對照測定540 nm的吸光值,樣品和空白對照的吸光值之差根據(jù)回歸方程得出發(fā)酵液中的果糖量。將酶液用pH 5.4的0.2 mol/L醋酸緩沖液適當(dāng)稀釋后,取0.5 mL的稀釋酶液加入0.5 mL 10%的蔗糖溶液中,25 ℃準(zhǔn)確反應(yīng)1 h,加入2 mL DNS終止反應(yīng),沸水浴2 min顯色,然后流水冷卻至室溫,定容至10 mL;空白對照的酶液和DNS加入順序顛倒,其余同樣品測定。以蒸餾水為對照測定540 nm的吸光值,樣品和空白對照的吸光值之差根據(jù)回歸方程得出反應(yīng)液中的果糖量,從而確定酶活。酶活力單位定義:在上述條件下,每分鐘催化蔗糖產(chǎn)生1 μmol果糖所需要的酶量定義為1個(gè)酶活力單位(IU)。
以不同Mn2+濃度將氯化錳加入培養(yǎng)基中,腸膜狀明串珠菌Lm-1226的生長結(jié)果見圖1。隨著Mn2+濃度的增加,發(fā)酵液中Lm-1226菌密度先增長,當(dāng)Mn2+濃度為0.6 mmol/L時(shí),菌密度最大,且大于對照,隨后菌密度急劇下降。結(jié)果表明,一定濃度的Mn2+對腸膜狀明串珠菌Lm-1226的生長具有促進(jìn)作用。
圖1 Mn2+對腸膜狀明串珠菌Lm-1226生長的影響Fig.1 The effect of Mn2+ on Lm-1226 growing
2.2.1 Mn2+對腸膜狀明串珠菌Lm-1226發(fā)酵產(chǎn)果糖的影響 在發(fā)酵培養(yǎng)基中按不同Mn2+濃度加入氯化錳,對發(fā)酵液中的果糖進(jìn)行測定,結(jié)果見圖2。含有Mn2+的發(fā)酵液中果糖量均低于對照組,且隨著Mn2+濃度的增加,發(fā)酵液中的果糖含量逐漸降低,說明Mn2+抑制腸膜狀明串珠菌Lm-1226發(fā)酵產(chǎn)果糖,且Mn2+濃度越高,抑制性越強(qiáng)。
圖2 Mn2+對腸膜狀明串珠菌Lm-1226發(fā)酵產(chǎn)果糖的影響Fig.2 The effect of Mn2+ on fructose production of Lm-1226
2.2.2 Mn2+對腸膜狀明串珠菌Lm-1226發(fā)酵產(chǎn)右旋糖酐的影響 在不同濃度Mn2+發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)腸膜狀明串珠菌Lm-1226,對發(fā)酵液中的右旋糖酐進(jìn)行乙醇沉淀分離提取,從圖3可以看出,加入Mn2+的發(fā)酵液與對照組相比,右旋糖酐的產(chǎn)量急劇下降,且隨著Mn2+濃度的增加,繼續(xù)逐漸降低。Mn2+對腸膜狀明串珠菌Lm-1226發(fā)酵產(chǎn)右旋糖酐具有較強(qiáng)的抑制作用。
圖3 Mn2+對腸膜狀明串珠菌Lm-1226發(fā)酵產(chǎn)右旋糖酐的影響Fig.3 The effect of Mn2+ on dextran production of Lm-1226
2.2.3 Mn2+對腸膜狀明串珠菌Lm-1226發(fā)酵產(chǎn)右旋糖酐蔗糖酶的影響 Mn2+對腸膜狀明串珠菌Lm-1226發(fā)酵產(chǎn)右旋糖酐蔗糖酶的作用結(jié)果表明(圖4),發(fā)酵培養(yǎng)基中加入Mn2+的右旋糖酐蔗糖酶活力均低于對照組,但是不同Mn2+濃度對產(chǎn)酶水平的影響有所不同,0.2~0.6 mmol/L右旋糖酐蔗糖酶活力先增高,0.4 mmol/L時(shí)相對最高;其后呈現(xiàn)下降趨勢,0.6~1.0 mmol/L酶活力基本不變;隨后又下降,3.0~7.0 mmol/L酶活力基本不變;之后酶活力大幅度下降??傊c對照相比較Mn2+對腸膜狀明串珠菌Lm-1226發(fā)酵產(chǎn)右旋糖酐蔗糖酶有抑制作用。
圖4 Mn2+對腸膜狀明串珠菌Lm-1226發(fā)酵產(chǎn)右旋糖酐蔗糖酶的影響Fig.4 The effect of Mn2+on dextransucrase production of Lm-1226
腸膜狀明串珠菌Lm-1226產(chǎn)生的右旋糖酐蔗糖酶在不同Mn2+濃度的反應(yīng)體系中作用結(jié)果見圖5,在1.25~7.5 mmol/L Mn2+濃度范圍內(nèi),右旋糖酐蔗糖酶作用開始隨著Mn2+濃度的增加而增強(qiáng),5.0 mmol/L時(shí)作用最強(qiáng),為對照的158%;隨后增強(qiáng)作用逐漸降低,但是酶的作用均高于對照。Mn2+對右旋糖酐蔗糖酶具有較強(qiáng)的激活作用,最適Mn2+濃度為5.0 mmol/L。
圖5 Mn2+對右旋糖酐蔗糖酶作用的影響Fig.5 he effect of Mn2+ on dextransucrase
腸膜狀明串珠菌發(fā)酵生產(chǎn)右旋糖酐在我國具有幾十年的歷史,但是相關(guān)企業(yè)主要采用半無菌發(fā)酵工藝,其缺點(diǎn)是產(chǎn)率低、產(chǎn)品質(zhì)量差,后續(xù)藥用右旋糖酐產(chǎn)品的用藥安全存在隱患。為了解決這一問題,對腸膜狀明串珠菌Lm-1226發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化研究,在金屬離子對腸膜狀明串珠菌Lm-1226發(fā)酵影響實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),果糖隨著Mn2+濃度的增加一直呈現(xiàn)上升趨勢,而右旋糖酐則是下降趨勢;在發(fā)酵液右旋糖酐蔗糖酶活力測定時(shí),空白對照的光吸收值隨著Mn2+濃度的增加而增加。這是由于Mn2+具有氧化還原性,對DNS測定果糖因Mn2+自身與DNS發(fā)生反應(yīng)而影響到檢測結(jié)果,為此將DNS測定果糖方法進(jìn)行改進(jìn),消除Mn2+自身的影響。因此在應(yīng)用DNS測定還原糖時(shí),要考慮到樣品中是否含有具有還原性的其他物質(zhì),若有類似Mn2+的還原性物質(zhì),則需要改進(jìn)檢測方法,消除其對還原糖檢測結(jié)果的影響。對Mn2+對腸膜狀明串珠菌Lm-1226的生長,發(fā)酵產(chǎn)果糖、右旋糖酐和右旋糖酐蔗糖酶,右旋糖酐蔗糖酶作用影響進(jìn)行了研究,結(jié)果表明,一定濃度的Mn2+對腸膜狀明串珠菌Lm-1226的生長具有促進(jìn)作用;Mn2+抑制腸膜狀明串珠菌Lm-1226發(fā)酵產(chǎn)果糖和右旋糖酐,且Mn2+濃度越高,抑制性越強(qiáng); Mn2+對腸膜狀明串珠菌Lm-1226發(fā)酵產(chǎn)右旋糖酐蔗糖酶有抑制作用,該抑制作用與Mn2+濃度增大所呈現(xiàn)變化趨勢與果糖和右旋糖酐產(chǎn)生的不同,不是一直隨Mn2+的增大而增強(qiáng),而是有波動(dòng),可能與Mn2+對右旋糖酐蔗糖酶的作用有促進(jìn)作用相關(guān);Mn2+對右旋糖酐蔗糖酶具有較強(qiáng)的激活作用,激活作用可達(dá)158%,最適Mn2+濃度為5.0 mmol/L。根據(jù)這一研究結(jié)果,在腸膜狀明串珠菌Lm-1226發(fā)酵產(chǎn)右旋糖酐過程中,種子培養(yǎng)基中加入Mn2+有助于Lm-1226的生長;應(yīng)用右旋糖酐蔗糖酶轉(zhuǎn)化蔗糖合成右旋糖酐中加入Mn2+,可以促進(jìn)右旋糖酐蔗糖酶的作用,提高蔗糖的轉(zhuǎn)化率和右旋糖酐的產(chǎn)率。Mn2+對腸膜狀明串珠菌Lm-1226發(fā)酵的影響僅僅進(jìn)行了初步研究,其作用機(jī)理有待于進(jìn)一步研究和探索。