胡榮濤，暢 英，陸嬌嬌，施碧紅

(福建師范大學 生命科學學院，福建 福州 350117)

米曲霉(Aspergillusoryzae)是曲霉屬中的重要成員之一，在微生物發(fā)酵領域，尤其是食品發(fā)酵行業(yè)，醬油、清酒等的生產過程中應用廣泛。米曲霉為產孢子絲狀真菌，其分生孢子由有隔菌絲頂端或分生孢子梗特化而成，是米曲霉的主要繁殖細胞。米曲霉分生孢子多為圓球狀，少數(shù)為扁球型，孢子內部的核數(shù)目具有多樣性，多數(shù)為多核(核數(shù)目≥2)，少數(shù)為單核[1]，且在其生長發(fā)育過程中會發(fā)生核型的變化。孢子核數(shù)目的不同會影響孢子大小、萌發(fā)率及對外界環(huán)境的敏感性等[1-3]。生產實踐中不同核型孢子遺傳穩(wěn)定性差異會影響菌種的選育工作。分析生長過程孢子中蛋白組成的變化，有助于探討米曲霉發(fā)育過程核型變化的遺傳機制。雙向電泳是研究不同細胞類型中蛋白表達差異的有效手段[4]。利用雙向電泳研究米曲霉不同核型孢子中蛋白的差異，首先需建立提取制備孢子蛋白的高效穩(wěn)定方法。真菌細胞壁的主要成分是多糖，另有少量蛋白質和脂類。米曲霉細胞壁多糖主要為葡聚糖、幾丁質[5]，孢子細胞壁較厚且結構堅韌，不易破碎，破碎不易完全，孢內蛋白提取較為困難[6]。為此我們對米曲霉孢子的破壁方法進行系列試驗。本研究擬通過5種不同的破壁方法對米曲霉孢子進行破壁處理，用血球計數(shù)板計算破壁率，并進行蛋白質含量測定，最終使用雙向凝膠電泳驗證破壁方法的可行性。從而明確不同機械破壁方法的破壁效果，選出破壁效率高、簡便易行、且適用于雙向電泳蛋白質分析的破壁方法，為進一步研究米曲霉孢子蛋白質提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 米曲霉FS1125為本實驗室保藏菌種。

1.1.2 培養(yǎng)基(質量分數(shù)，%)及孢子懸液制備 CD培養(yǎng)基：NaNO30.3,KH2PO40.1,MgSO4·7H2O 0.05,KCl 0.2,FeSO4·7H2O 0.002,葡萄糖 2,瓊脂糖 2。30 ℃培養(yǎng)9 d，收集孢子懸液，離心、裂解液(8 mol/L尿素，4% CHAPS，2% IPG buffer，40 mmol/L DTT)重懸以獲得不同濃度的孢子懸液，并用雙層擦鏡紙濾去菌絲,血球計數(shù)板計算孢子數(shù)[7]。

1.1.3 試劑及儀器 LHR-150生化培養(yǎng)箱(上海一恒科學儀器)，TGL-16M高速臺式離心機(長沙湘儀)，超聲波清洗機(寧波新芝生物科技有限公司)，均質器(MP·Fast-prep)，普通光學顯微鏡(重慶光電)，SDS-PAGE小型垂直電泳系統(tǒng)(Bio-Rad)，Ettan IPG phor 3雙向電泳系統(tǒng)(GE Healthcare)，牛血清蛋白標準液(生工生物工程)，蛋白染色液G-250(生工生物工程)，尿素、CHAPS、DTT、IAA、IPG buffer、IPG膠條、礦物油均購自GE公司，其他試劑購自西隴化工。

1.2 方法

1.2.1 破壁方法 ①石英砂研磨：按50 mg/mL加入石英砂，直接研磨；②超聲破碎：孢子懸液在冰水浴中進行超聲破壁(工作30 s，間歇45 s破壁20 min)；③石英砂+超聲破碎：按50 mg/mL加入石英砂，研磨3～5 min成糊狀，再超聲處理；④液氮研磨：將一定量的已測定濃度的孢子懸液離心，棄上清，置于研砵中，液氮多次研磨直至絮狀，再加入與原先等量的裂解液復溶；⑤MP·Fast-prep均質器法：采用均質器進行破壁處理(振蕩速度5.0 m/s，工作時間30 s)，間隔冰水浴反復進行10次循環(huán)。

1.2.2 破壁觀察與破壁率測定 采用普通光學顯微鏡進行破壁觀察并拍照，用血球計數(shù)板測定破壁前后完整的孢子數(shù)目，計算破壁率[8-9]。破壁率為3個重復樣的平均值。

1.2.3 蛋白標準曲線的制作 取7支試管，分別加入0、10、20、40、60、80、100 μL的牛血清蛋白標準液(1 mg/mL)，并用裂解液補足100 μL。再分別加入3 mL的蛋白染色液G-250。所有溶液加入5 min，待溶液顏色穩(wěn)定，用分光光度計測定每管溶液在595 nm下的吸光值(比色空白皿用3 mL的蛋白染色液G-250)，并繪制標準曲線。

1.2.4 樣品蛋白濃度測定 破壁處理后的孢子懸液經過7 000 r/min離心10 min，去除孢子碎片后，取100 μL上清液于試管中，加入3 mL蛋白染色液G-250，反應5 min待顏色穩(wěn)定后，于595 nm下比色(比色空白皿用3 mL蛋白染色液G-250)測定其吸光值，并計算蛋白質含量[10]。

1.2.5 孢子可溶性蛋白SDS-PAGE 將孢子經過以上5種不同破壁方法處理，離心取得的上清液，進行SDS-PAGE。采用不連續(xù)丙烯酰胺凝膠電泳，5% 濃縮膠(pH 6.8)和12% 分離膠(pH 8.8)。電壓90 V，電流400 mA,時間90 min。電泳停止后用R250染色液進行染色。

1.2.6 雙向電泳可行性驗證 篩選出具有最高破壁率的方法所得到的樣品液進行雙向電泳試驗，驗證該破壁方法是否能適用于雙向電泳樣品制備[11]。

2 結果與分析

2.1 顯微觀察結果

在普通光學顯微鏡下觀察米曲霉孢子破壁前后形態(tài)，可見孢子破壁前為圓球狀孢子，破壁后多為細胞碎片，少數(shù)為孢壁內空圓球(圖1)。

圖1 米曲霉孢子破壁前后的顯微觀察Fig.1 The Aspergillus oryzae conidia before and after rupture under optical MicroscopeA：孢子破壁前形態(tài)；B：孢子破壁后形態(tài)(空心箭頭指向為細胞碎片，黑色箭頭指向為孢壁內空圓球)A: conidia before rupture；B: conidia after rupture(The hollow arrow points to the broken fragments of conidia,the black arrow points to the empty sphere)

對不同濃度的米曲霉孢子采用1.2.1所示的破壁方法，經血球計數(shù)板計數(shù)，結果表明：在孢子濃度較低(約107個/mL)時，方法③、④、⑤都具有較高的破壁率(>70%,表1)，且方法⑤>③>④，其中方法⑤破壁率高達97%。隨著孢子濃度的增加(約109個/mL)，方法①和②的破壁率太低，不具有統(tǒng)計意義，不進行后續(xù)實驗；方法③和④都出現(xiàn)了不同程度的破壁不完全，而方法⑤仍具有最優(yōu)且穩(wěn)定的高破壁率(90%，表1)。對表1中的2種不同濃度的孢子采用方法⑤的破壁效果均顯著高于其他4種破壁方法(t檢驗)。

表1 不同濃度的米曲霉孢子的破壁率Table 1 Wall-broken rates of different concentration conidia of Aspergillus oryzae

注：“-”表示破壁率太低，沒有統(tǒng)計意義；A、B表示P<0.001的顯著差異，下表同

2.2 蛋白標準曲線

為測定破壁后孢子釋放的蛋白含量，先用牛血清蛋白標樣制作標準曲線，如圖2，R2=0.999 1，線性良好。后續(xù)待測樣品經分光光度計檢測后，可利用該曲線線性關系計算蛋白含量。

圖2 牛血清蛋白質標準曲線Fig.2 The standard curve of bovine serum proteins

2.3 可溶性蛋白含量

用Bradford方法測定米曲霉孢子在不同破壁方法處理下釋放出的可溶性蛋白含量見表2。結果表明：經方法③、④、⑤處理的孢子均有不同的蛋白量釋出并且與破壁率的結果一致(方法⑤>③>④),且不論孢子濃度為107或109個/mL，經方法⑤破壁后釋放的可溶性蛋白含量均顯著高于方法③或④(t檢驗)。另外從表2也可看出對于同一破壁方法，高濃度孢子懸液(109個/mL)破壁后其可溶性蛋白含量要顯著高于低濃度孢子懸液(107個/mL)。為滿足后續(xù)雙向電泳對樣品蛋白濃度的要求，需采用高濃度孢子懸液(109個/mL)進行破壁及蛋白提取。故方法⑤是首選破壁方法，因為隨著米曲霉孢子濃度的不斷加大，只有方法⑤可以保持高破壁率，并保障孢子內部蛋白質的釋出。

表2 米曲霉孢子破壁后釋出的可溶性蛋白含量Table 2 The soluble Protein releasing from broken spores

2.4 孢子可溶性蛋白SDS-PAGE

將濃度約為109個/mL的孢子分別經3種不同破壁方法處理的蛋白提取樣品進行SDS-PAGE(圖3)，結果表明：3種方法處理的樣品均可見清晰蛋白條帶，方法⑤獲得的樣品條帶最清晰明顯，顏色也更深。比較三者的蛋白條帶顯色清晰排序為方法⑤>③>④，與分光光度計檢測的蛋白含量排序相吻合。

圖3 米曲霉孢子可溶性蛋白的SDS-PAGEFig.3 SDS-PAGE of soluble protein in Aspergillus oryzae conidiaA、B為方法③破壁樣品；C、D為方法④破壁樣品；E、F為方法⑤破壁樣品A and B were broken by Quartz sand grinding plus ultrasonic treatment method；C and D were from Liquid nitrogen grinding method；E and F were by MP·Fast-prep method

2.5 可溶性蛋白雙向電泳

將方法⑤破壁提取可溶性蛋白樣品進行雙向電泳驗證，結果表明使用該方法進行米曲霉孢子的破壁，并進行孢內蛋白的提取,其樣本是適用于雙向電泳試驗的(圖4)。

圖4 米曲霉孢子破壁釋出可溶性蛋白雙向電泳圖譜 Fig.4 Two-dimensional electrophoresis of the conidia protein in Aspergillus oryzae

由圖4可見較為清晰豐富的蛋白點，且不存在橫、縱向拖尾問題。說明使用方法⑤對米曲霉孢子進行破壁提取蛋白適用于雙向電泳的樣品制備。

3 討 論

雖然目前已有不少文獻報道真菌菌體蛋白提取方法,如單振秀等采用3種破壁方法對抗 Cr6+真菌進行處理,發(fā)現(xiàn)使用超聲波法破壁效果最好[12];萬其兵等[13]用4種破壁方法處理DS-9701菌株，結果表明石英砂+超聲的方法效果較佳；王燕等用酶法進行米曲霉破壁[14]，但酶解法會導致真菌細胞壁結構變化和蛋白位點的移動[15]，可能會對進一步的孢內蛋白分析造成影響；劉東奇等[16]用6種方法對啤酒酵母進行破壁實驗，結果表明微波法具有最佳破壁效果，破壁率達到49%。但是關于米曲霉分生孢子的破壁及其蛋白提取方法還鮮見報道。

蛋白質提取的關鍵步驟是細胞破碎和蛋白質溶解。本研究采用5種不同的破壁方法對米曲霉孢子進行破壁，結果表明：方法①石英砂研磨和方法②超聲的破壁率不高，不適用于米曲霉孢子破壁；方法③石英砂+超聲、④液氮研磨、⑤MP·Fast-prep均質器有較高的破壁率，但隨著孢子濃度的提升，方法③石英砂+超聲、方法④液氮研磨的破壁效果有所下降。如果通過延長處理時間等方法進行補救，有可能導致孢子內含物變性等問題。綜合考慮，方法⑤MP·Fast-prep均質器破壁法為米曲霉孢子的最佳破壁方法。該法不論是破壁率還是孢內蛋白釋放量都較高且穩(wěn)定，且操作簡便、液量損失少、破壁方法對孢子內蛋白質無明顯影響，樣品可用于SDS-PAGE和雙向電泳，該方法的建立為米曲霉蛋白質組學的進一步研究提供了參考。