蔡建星，趙艷坤，王 帥，陳 賀，孫 濤

(新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所 農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室(烏魯木齊)新疆農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全實(shí)驗(yàn)室，新疆 烏魯木齊 830091)

無(wú)乳鏈球菌(Streptococcusagalactiae)是一種革蘭陽(yáng)性細(xì)菌，是鏈球菌屬內(nèi)感染性較強(qiáng)、傳播速度較快的病原菌，是引起奶牛乳房炎的主要病原之一[1-3]。奶牛感染S.agalactiae可以引發(fā)牛乳腺區(qū)域的乳房炎，S.agalactiae屬于高度接觸傳染菌，能夠長(zhǎng)期降低奶牛泌乳量，還可傳染給犢牛。眾多S.agalactiae致病性的研究表明，新生兒感染S.agalactiae易患敗血癥、肺炎和腦膜炎，甚至?xí)＜靶律鷥簳r(shí)期的生命，而且成年婦女的陰道中S.agalactiae檢出情況較高。這個(gè)現(xiàn)象是否可以聯(lián)想為動(dòng)物與人之間可以互相感染，但為什么會(huì)出現(xiàn)感染？通過(guò)何種方式感染？帶著這個(gè)疑問(wèn)，查閱大量文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)：近年來(lái)，國(guó)外西班牙、法國(guó)、美國(guó)、巴西等國(guó)家，國(guó)內(nèi)甘肅、貴州、內(nèi)蒙古、青海等24個(gè)地區(qū)在新生兒和病人血液中、羊奶和奶牛乳房炎乳汁中均有檢出S.agalactiae，多數(shù)地區(qū)的檢出率呈逐年升高趨勢(shì)，給臨床抗感染治療帶來(lái)極大困難[4-22]。不同動(dòng)物源和人能發(fā)現(xiàn)相同型的S.agalactiae，且S.agalactiae耐藥率有上升趨勢(shì)。因此，找到S.agalactiae耐藥的種類，合理更換抗菌藥物，使得耐藥菌株降低；找到合適的S.agalactiae分子分型的研究方法，可為后期研究S.agalactiae提供參考。

1 S.agalactiae生物學(xué)特性

S.agalactiae為芽胞桿菌綱(Bacilli)、乳桿菌目(Lactobacillales)、鏈球菌科(Streptococcaceae)、鏈球菌屬(Streptococcus)的一種兼性厭氧、革蘭陽(yáng)性雙球菌，同時(shí)也被稱為B群鏈球菌[23-24]。在普通顯微鏡下，S.agalactiae呈球形或卵圓形，直徑為0．5～2．0 mm，呈鏈狀排列，短鏈者由4～8個(gè)細(xì)菌組成，長(zhǎng)鏈者由20～30個(gè)細(xì)菌組成，有莢膜，無(wú)芽胞，無(wú)鞭毛，無(wú)運(yùn)動(dòng)性，有菌毛樣結(jié)構(gòu)，最適生長(zhǎng)溫度在37 ℃左右，最適pH約6．5，堿性環(huán)境下難以生長(zhǎng)[25]。大部分S.agalactiae的培養(yǎng)特性需要較高營(yíng)養(yǎng)成分，在普通培養(yǎng)基上生長(zhǎng)狀態(tài)不良；在血瓊脂平板上呈綠色斑狀α溶血、透明環(huán)狀的β溶血或γ溶血[26-27]。生化代謝反應(yīng)中產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，接觸酶試驗(yàn)陰性，不發(fā)酵乳糖和阿拉伯糖，能發(fā)酵蔗糖、葡萄糖、麥芽糖和水楊苷，產(chǎn)生乳酸，6.5% NaCl試驗(yàn)和過(guò)氧化氫酶均為陰性，VP試驗(yàn)陽(yáng)性，CAMP試驗(yàn)陽(yáng)性，不分解山梨醇和七葉苷，能分解馬尿酸鈉、海藻糖和精氨酸；而停乳鏈球菌與S.agalactiae不同之處在于觸酶試驗(yàn)和CAMP試驗(yàn)均為陰性，馬尿酸鈉試驗(yàn)也為陰性[28]。

2 S.agalactiae流行性致病信息

目前己發(fā)現(xiàn)S.agalactiae主要的致病因子包括：莢膜多糖(capsular polysaccharide，CPS)、溶血素(hemolysin)、菌毛島嶼(Pilus Island，PI)、透明質(zhì)酸酶(hyaluronidase，HAase)、磷酸甘油激酶(Surface Immunogenic Protein，Pgk)和CAMP因子6種毒力因子，以及位于S.agalactiae細(xì)胞表面的蛋白：αC蛋白(αC protein ACP)、表面免疫相關(guān)蛋白(Surface Immunogenic Protein，Sip)、黏附蛋白(S.agalactiaeimmunogenic bacterial adhesion，BiBA)、纖維蛋白原結(jié)合蛋白(Fibrinogen binding proteins，F(xiàn)bs)、層黏連蛋白結(jié)合蛋白(laminin-binding protein，Lmb)和纖溶酶受體蛋白(plasmin receptor protein，GapC)。S.agalactiae的毒力因子及毒力因子表達(dá)的蛋白與其致病性有著緊密的相關(guān)性，但并不是所有類型的S.agalactiae都攜帶相同的毒力基因。

2.1 S.agalactiae毒力因子

2.1.1 CPS CPS能編碼唾液酸多糖，經(jīng)過(guò)唾液酸酸化作用使S.agalactiae逃避免疫系統(tǒng)中巨噬細(xì)胞的吞噬，從而阻斷宿主補(bǔ)體因子C3的沉淀和激活，延長(zhǎng)細(xì)菌在血液中的存活時(shí)間，增強(qiáng)細(xì)菌的致病能力[29]。S.agalactiae存在10種血清型，其中人源、牛源S.agalactiaecpsE基因序列具有高度特異保守性，序列相似度達(dá)100%[30]。

2.1.2 溶血素 細(xì)胞溶血素是細(xì)菌分泌的能夠溶解細(xì)胞的毒素，讓細(xì)胞內(nèi)的成分泄露到細(xì)胞外，致使細(xì)胞死亡。cylE基因是S.agalactiae溶血素的關(guān)鍵基因，缺失cylE基因的菌株(感染動(dòng)物模型中)，敗血癥和腦膜炎的發(fā)生明顯下降[31]。

2.1.3 PI 《SCIENCE》在2005年報(bào)道了S.agalactiae具有菌毛樣結(jié)構(gòu)后，牛乳腺炎S.agalactiae(Bovine mastitis streptococcus agalactiae，BMSA)的菌毛結(jié)構(gòu)與功能的研究成為全球關(guān)注的熱點(diǎn)[32]。S.agalacti的菌毛位于S.agalactiae表面，參與S.agalactiae的黏附、侵襲和致病過(guò)程。研究發(fā)現(xiàn)由BP基因編碼的菌毛骨干蛋白BP與輔助蛋白AP-1、AP-2構(gòu)成完整的細(xì)胞器即菌毛。菌毛的骨干結(jié)構(gòu)是BP，AP1分布在細(xì)菌表面，AP2位于菌毛頂端[33]。錫林高娃等[34]研究證明了AP1片段表達(dá)產(chǎn)物具有抗原反應(yīng)。

2.1.4 HAase HAase是一種能特異性分解細(xì)胞外基質(zhì)成分的水解酶，也是細(xì)菌致病的毒力因子之一，同時(shí)在S.agalactiae的致病機(jī)制中扮演重要的角色。但是目前對(duì)其致病機(jī)制鮮有報(bào)道。有研究發(fā)現(xiàn)該酶是由hylB基因編碼的分泌蛋白，屬于細(xì)胞外的侵襲性酶，主要是通過(guò)破壞結(jié)締組織間質(zhì)中HA，分解結(jié)締組織的蛋白多糖使細(xì)菌易在組織中穿過(guò)而協(xié)助病原菌擴(kuò)散，從而促進(jìn)感染的擴(kuò)散。Yildirim等[35]在豬和馬分離的S.agalactiae中發(fā)現(xiàn)HAase活性，但在犬和貓分離的S.agalactiae中并未發(fā)現(xiàn)HAase。

2.1.5 Pgk Pgk是單體的、高度柔曲性的糖酵解酶的關(guān)鍵酶，序列具有高度保守性。有人通過(guò)做Pgk序列進(jìn)化樹(shù)并以此判斷物種的類別及兩種動(dòng)物親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近。Hughes等[36]國(guó)外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)：Pgk蛋白具有良好的抗原性。國(guó)內(nèi)學(xué)者布日額等[37]選用Pgk抗原通過(guò)間接ELISA檢測(cè)牛乳腺炎S.agalactiaepgk亞單位抗原也具有良好的抗原性。

2.1.6 CAMP因子 CAMP現(xiàn)象：S.agalactiae特異性地增加金黃色葡萄球菌對(duì)綿羊紅細(xì)胞溶解能力的現(xiàn)象。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)CAMP因子在細(xì)胞膜上形成離散跨膜孔產(chǎn)生破壞作用，并能與神經(jīng)酰胺結(jié)合，引起該處細(xì)胞膜的成分溶解，與此同時(shí)能損壞宿主抗體，削弱宿主免疫功能[38-39]。S.agalactiae的CAMP因子是由cfb基因編碼的分泌蛋白(約為25．3 ku)。絕大多數(shù)文獻(xiàn)統(tǒng)計(jì)：人和不同動(dòng)物源分離的S.agalactiae均顯示CAMP活性，但是在牛乳腺中分離的S.agalactiae沒(méi)有顯示CAMP活性。CAMP因子不僅具有共溶血的作用，還能通過(guò)低聚體分散在宿主細(xì)胞膜上產(chǎn)生作用，但是目前還沒(méi)有對(duì)CAMP基因的致病原因進(jìn)行研究，致病機(jī)理并不清楚。

2.2 細(xì)胞表面蛋白

2.2.1 αC蛋白 αC蛋白對(duì)介導(dǎo)S.agalactiae入侵宿主上皮細(xì)胞起著非常重要的作用，ACP是S.agalactiae的表面蛋白，也是宿主免疫的靶蛋白[40]。ACP通過(guò)與機(jī)體宿主細(xì)胞表面的黏多糖和整聯(lián)蛋白相互作用來(lái)促進(jìn)S.agalactiae入侵機(jī)體細(xì)胞。Bolduc等[41]研究發(fā)現(xiàn)ACP表達(dá)量下降會(huì)導(dǎo)致S.agalactiae向人子宮頸上皮細(xì)胞的運(yùn)輸減少。ACP的變量表達(dá)由bca的上游啟動(dòng)子序列控制，轉(zhuǎn)錄調(diào)控也會(huì)影響ACP的表達(dá)[42]。

2.2.2 Sip Sip為位于細(xì)菌表面的免疫相關(guān)蛋白，在S.agalactiae各種血清型中均可檢測(cè)到。Brodeur 等[43]在S.agalactiae的致死感染研究中發(fā)現(xiàn)給小鼠注射Sip可使小鼠避免S.agalactiae多種血清型的致死；郎景民等[44]通過(guò)間接ELISA檢測(cè)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Sip有良好的抗原性；Shannon等[45]在臨床自然感染檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，97%初生嬰兒血液中含有Sip抗體，且有半年以上的免疫力。以上研究均證明Sip具有良好的抗原性。

2.2.3 BiBA Santi等[46]在S.agalactiae基因組序列中發(fā)現(xiàn)了一種新的免疫原性細(xì)菌黏附蛋白BiBA，能促進(jìn)S.agalactiae吸附到機(jī)體細(xì)胞表面的作用。通過(guò)進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，BiBA基因缺失株抗吞噬作用和存活率都會(huì)下降。Santi等[46]又用重組BiBA免疫小鼠，小鼠對(duì)S.agalactiae免疫力明顯增強(qiáng)；分離的血清能夠誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞的吞噬作用，由此證明BiBA可作為一種新的S.agalactiae的候選基因。不同血清型的S.agalactiae共編碼四種BiBA：包括細(xì)胞壁結(jié)合蛋白和分泌在外的游離蛋白，對(duì)這些蛋白的功能研究不夠完善，尤其在乳源性S.agalactiae的表面蛋白研究方面鮮見(jiàn)報(bào)道。

2.2.4 FbsS.agalactiaeFbs蛋白包括FbsA和FbsB，F(xiàn)bs蛋白與細(xì)胞的基質(zhì)纖維蛋白原(Stroma Fibrinogen)結(jié)合；兩者均是S.agalactiae的表面蛋白和重要的侵襲因子。其中FbsA是S.agalactiae主要的外膜纖維蛋白原結(jié)合蛋白，研究發(fā)現(xiàn)缺少FbsA的突變株，結(jié)合能力會(huì)降低，吞噬細(xì)胞的敏感性會(huì)升高；而FbsB的缺失株結(jié)合能力并無(wú)明顯改變，但入侵的肺上皮細(xì)胞的能力會(huì)降低。由此說(shuō)明，F(xiàn)bsA與機(jī)體細(xì)胞吸附有相關(guān)作用，F(xiàn)bsB則與入侵機(jī)體細(xì)胞有關(guān)聯(lián)[47]。張雪峰[48]通過(guò)裂解S.agalactiae菌株獲得表面蛋白FbsA，成功合成產(chǎn)物FbsA的重復(fù)16肽具有免疫記憶效應(yīng)。國(guó)內(nèi)學(xué)者通過(guò)克隆、原核表達(dá)方法說(shuō)明FbsA同樣具有較強(qiáng)的免疫原性和保護(hù)作用。所以具有潛在免疫原性。

2.2.5 LmbS.agalactiae與宿主細(xì)胞的結(jié)合主要是黏附因子黏連蛋白結(jié)合蛋白(34 ku)存在金屬離子的結(jié)合位點(diǎn)，并能協(xié)調(diào)鋅離子與3個(gè)高度保守的組氨酸結(jié)合形成四面體結(jié)構(gòu)；Lmb與金屬離子的結(jié)合和釋放存在獨(dú)特的結(jié)構(gòu)重排[49]。Lmb基因的缺失導(dǎo)致S.agalactiae黏附入侵細(xì)胞的能力顯著下降[50]。

2.2.6 GapC GapC是一種細(xì)胞表面脫氫酶，具有3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)活性，能與血纖維蛋白溶酶結(jié)合，在信號(hào)傳導(dǎo)和疾病發(fā)生的過(guò)程中起著關(guān)鍵作用。該蛋白被認(rèn)為是疫苗制備的良好靶位點(diǎn)。

3 S.agalactiae耐藥研究現(xiàn)狀

3.1 S.agalactiae國(guó)內(nèi)外流行情況

在國(guó)內(nèi)，鄧海平等[4]在甘肅、貴州等地奶牛乳房炎乳樣中檢出4株S.agalactiae，分離率為2.12%(4/189)；杜琳[5]在內(nèi)蒙古奶牛乳房炎乳樣中檢出分離得到22株S.agalactiae，分離率為7．38%(22/298)；劉琪等[6]在內(nèi)蒙古奶牛乳房炎乳樣中分離了24株鏈球菌，分離率為7．27%(24/330)。在國(guó)外，Garnica等[19]在西班牙羊奶中分離出13株S.agalactiae，分離率為28．89%(13/45)；Pimentel等[20]在巴西、印尼、里約熱內(nèi)盧等地癌癥病人血液中分離263株S.agalactiae，分離率達(dá)72．25%(263/364)；Hraoui等[21]在法國(guó)新生兒生殖標(biāo)本、胃液或耳朵標(biāo)本分離鑒定出226株S.agalactiae；Bergal等[22]在美國(guó)人的陰道和血液樣本中分離出93株S.agalactiae。

S.agalactiae引起的奶牛乳房炎在丹麥、挪威的發(fā)生頻率高于其他國(guó)家[51-52]，而在中國(guó)已成為最常見(jiàn)的診斷奶牛亞臨床乳腺炎的病原菌[53]。通過(guò)國(guó)內(nèi)外S.agalactiae文獻(xiàn)分析，在整體水平上S.agalactiae的分離率國(guó)外高于國(guó)內(nèi)，且在新生兒以及患病人源檢出較高。

3.2 S.agalactiae耐藥研究現(xiàn)狀

S.agalactiae的生物學(xué)特性與鏈球菌屬近似，S.agalactiae和鏈球菌在近8年(2010年至2017年)的時(shí)間對(duì)11大類抗菌藥物中19種藥物耐藥性的數(shù)據(jù)可以分析S.agalactiae耐藥的研究現(xiàn)狀。從不同地區(qū)來(lái)看，國(guó)內(nèi)已經(jīng)對(duì)23個(gè)地區(qū)進(jìn)行S.agalactiae耐藥性檢測(cè)。其中華北地區(qū)對(duì)11大類中11種抗菌藥物耐藥性進(jìn)行檢測(cè)，耐藥率極低，僅對(duì)慶大霉素和四環(huán)素耐藥，耐藥率4．6%和77．3%，其余9種抗菌藥物檢出率為0；廣西地區(qū)對(duì)11大類中10種抗菌藥物耐藥性進(jìn)行檢測(cè)，耐藥率在0%～90%；寧夏、上海和杭州3個(gè)地區(qū)對(duì)8種抗菌藥物進(jìn)行檢測(cè)，其中寧夏地區(qū)8種抗菌藥物中有6種抗菌藥物的耐藥率≥50%，比上海和杭州地區(qū)耐藥情況嚴(yán)重；在青海、蘇州、北京、甘肅、內(nèi)蒙地區(qū)分別對(duì)5種、4種、6種、6種和7種抗菌藥物進(jìn)行耐藥檢測(cè)，檢測(cè)情況相對(duì)較低。從多個(gè)地區(qū)來(lái)看，對(duì)9地(蘭州、北京、呼和浩特、哈爾濱、成都、長(zhǎng)沙、濟(jì)南、廣州和貴陽(yáng))15種抗菌藥物中5種抗菌藥物的耐藥率≥50%，耐藥情況比較嚴(yán)重；對(duì)6地(蘭州、寧夏、陜西、天津、重慶和青島)13種抗菌藥物中5種抗菌藥物的耐藥率≥50%，耐藥情況也比較嚴(yán)重；對(duì)2地(甘肅和貴州)和4地(內(nèi)蒙古、甘肅、四川和上海)分別對(duì)8種抗菌藥物進(jìn)行檢測(cè)，耐藥率相對(duì)不高。

從抗菌藥物種類來(lái)看，2010年至2017年，對(duì)β-內(nèi)酰胺類(青霉素、阿莫西林、頭孢賽肟、氨芐青霉素和頭孢唑啉)5種抗菌藥物的檢測(cè)相對(duì)較多，耐藥率最高，2011、2012年兩年中4次達(dá)到100%；對(duì)喹諾酮類(左氧氟沙星、環(huán)丙沙星和恩諾沙星)耐藥率≤50%；林可胺類(克林霉素)抗菌藥物檢出較少，耐藥率達(dá)0～50%；氨基糖苷類抗菌藥物(卡那霉素和慶大霉素)的耐藥率50%以上居多；酰胺醇類(氟苯尼考和氯霉素)，2002年國(guó)家已經(jīng)下令禁止對(duì)所有食用動(dòng)物使用氯霉素，但作為氯霉素的衍生物氟苯尼考，氟苯尼考的耐藥率較高為14%～90%；安沙霉素類(復(fù)方新諾明)和惡唑烷酮類(利奈唑胺)抗菌藥物的檢出較少，耐藥率非常低；頭孢類(頭孢拉定)耐藥率在55%以下；四環(huán)素類(四環(huán)素)的耐藥率在50%～88．3%居多，耐藥情況較為嚴(yán)重；大環(huán)內(nèi)酯類(紅霉素)的耐藥率在50%以上較高，檢出情況比較嚴(yán)重(表1)。

表1 2010年至2017年無(wú)乳鏈球菌對(duì)臨床常用19種抗菌藥物耐藥結(jié)果(%)Table 1 Streptococcus agalactiaeis resistance to 19 commonly used antibiotics in 2010-2017 year(%)

注：“-”表示無(wú)檢測(cè)值；2地：甘肅和貴州兩個(gè)地區(qū)；4地：內(nèi)蒙古、甘肅、四川和上海4個(gè)地區(qū)；9地：蘭州、北京、呼和浩特、哈爾濱、成都、長(zhǎng)沙、濟(jì)南、廣州和貴陽(yáng)9個(gè)地區(qū)；6地：蘭州、寧夏、陜西、天津、重慶和青島6個(gè)地區(qū)

3.3 無(wú)乳鏈球菌耐藥基因和毒力基因研究概況

2010年至2017年，通過(guò)大部分文獻(xiàn)統(tǒng)計(jì)得到無(wú)乳鏈球菌對(duì)8類抗菌藥物的20個(gè)耐藥基因，包括：β-內(nèi)酰胺類耐藥基因pbp2b，喹諾酮類耐藥基因gyrA、parC，林可胺類耐藥基因lunB，氨基糖苷類耐藥基因aadE，磺胺類耐藥基因sul1、sul2、sul3，四環(huán)素類耐藥基因mefE、tetM、tetO、tetK、tetL、tetE，大環(huán)內(nèi)酯類耐藥基因ermB、ermC、ermTR、erm33、mefA和lsaE，其中四環(huán)素和紅霉素耐藥基因檢出較多。蘇錦珍等[54]和劉鏡光等[55]對(duì)深圳市2008年至2015年分離的人源無(wú)乳鏈球菌進(jìn)行耐藥性研究，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌對(duì)紅霉素、克林霉素的耐藥性高，耐藥基因檢測(cè)發(fā)現(xiàn)紅霉素耐藥基因ermA、ermB、ermC、mefA、ermTR等和四環(huán)素耐藥基因tetM、tetK、tetS、tetT、tetL、tetO，并且耐藥基因數(shù)量有逐年增加的趨勢(shì)。

以上耐藥基因中不同的耐藥基因產(chǎn)生耐藥性的原因是不盡相同的，通過(guò)不同的耐藥原因可分為5種：gyrA、parC、lunB、aadE、ermB、ermC、ermTR、erm33和lsaE主要通過(guò)藥物靶位改變產(chǎn)生耐藥性；mefA、mefE、aadE、tetM、tetO、tetK、tetL、tetE、ermB、ermC、ermTR、erm33和lsaE基因主要通過(guò)主動(dòng)外排泵對(duì)抗菌藥物產(chǎn)生耐藥性；pbp2b基因主要通過(guò)改變自身受體產(chǎn)生抗藥性；sul1、sul2、sul3、tetM、tetO、tetK、tetL和tetE基因主要是由于形成滅活酶或鈍化酶產(chǎn)生耐藥性；ermB、ermC、ermTR、erm33、lsaE、aadE、tetM、tetO、tetK、tetL和tetE通過(guò)核糖體結(jié)合蛋白位點(diǎn)的變化產(chǎn)生抗藥性，詳見(jiàn)表2。

針對(duì)七大類抗菌藥物進(jìn)行檢測(cè)，并沒(méi)有對(duì)安沙霉素類耐藥基因、惡唑烷酮類、酰胺醇類和頭孢類四大類抗菌藥物進(jìn)行檢測(cè)，后期研究可針對(duì)此類耐藥基因進(jìn)行深入研究。

大部分研究學(xué)者已對(duì)無(wú)乳鏈球菌12種毒力基因進(jìn)行檢測(cè)，β溶血素cyl，αC蛋白bca，C5a肽酶scpB，層黏連蛋白結(jié)合蛋白lmb，谷氨酰胺合成酶glnA，CAMP因子cfb，透明質(zhì)酸酶hylB，βC蛋白bac，細(xì)菌免疫原性黏附素bibA，侵襲相關(guān)基因iagA，纖維蛋白結(jié)合蛋白BfbsB，β溶血素/溶細(xì)胞素clyE。其中9種毒力基因的檢出率達(dá)50%以上，毒力基因的種類以及檢出率相對(duì)是比較高的，詳見(jiàn)表3。

近些年來(lái)，隨著研究的不斷深入，人們對(duì)細(xì)菌耐藥性和毒力基因之間的關(guān)系有了一些新的發(fā)現(xiàn)。Padilla等[56]研究表明，敲除acrAB的肺炎克雷伯菌菌株在引起肺炎鼠模型中表現(xiàn)出較野生菌株低的致病力，提示外排泵不僅能夠?qū)е录?xì)菌耐藥性的增加，同時(shí)也增強(qiáng)了其致病性。細(xì)菌的耐藥性和毒力之間存在一定的關(guān)系，但有關(guān)細(xì)菌毒力與耐藥之間存在什么樣的機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

3.4 無(wú)乳鏈球菌體外誘導(dǎo)耐藥的研究進(jìn)展

體外逐漸增加藥物濃度誘導(dǎo)細(xì)菌耐藥的方法廣泛用于實(shí)驗(yàn)室細(xì)菌耐藥性研究。細(xì)菌長(zhǎng)期存在于含有抗菌藥物的環(huán)境中，將會(huì)獲得相應(yīng)的耐藥基因或發(fā)生基因突變，從而導(dǎo)致耐藥菌的產(chǎn)生。席瑞等[57]采用多步誘導(dǎo)法成功誘導(dǎo)出對(duì)利奈唑胺耐藥的腸球菌，并得出耐藥機(jī)制與23S rRNA基因的點(diǎn)突變有關(guān)。張濤等[58]采用體外逐步增加藥物濃度的方法，推測(cè)可能通過(guò)誘導(dǎo)耐藥，細(xì)菌的細(xì)胞壁增厚產(chǎn)生耐藥性。國(guó)內(nèi)外針對(duì)無(wú)乳鏈球菌耐藥的傳播機(jī)制研究罕見(jiàn)報(bào)道，丁月霞[59]通過(guò)誘導(dǎo)耐藥試驗(yàn)獲得僅耐紅霉素的肺炎鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC49619-ERY，結(jié)合質(zhì)粒接合試驗(yàn)，生成了四環(huán)素耐藥的接合子。從基因水平轉(zhuǎn)移方面詮釋了細(xì)菌耐藥性傳播機(jī)制。

表2 無(wú)乳鏈球菌耐藥機(jī)制分類Table 2 Drug resistance mechanism classification of Streptococcus agalactiaeis

表3 無(wú)乳鏈球菌毒力基因檢出情況Table 3 Detection status of Streptococcus agalactiaeis virulence genes

4 S.agalactiae分子分型方法研究進(jìn)展

通過(guò)分子生物學(xué)方法調(diào)查動(dòng)物源S.agalactiae的分子流行病學(xué)，了解其主要流行的血清型；通過(guò)多位點(diǎn)序列(Multilocus Sequence Typing，MLST)分型、脈沖場(chǎng)凝膠電泳(Pulsed-field Gel Electrophoresis，PFGE)分型、前噬菌體分型、菌毛島嶼分型等多種分子分型方法來(lái)分析其菌株多樣性，探究其流行株的基因型，為S.agalactiae病的科學(xué)防控奠定基礎(chǔ)。

4.1 血清型分型

傳統(tǒng)的S.agalactiae血清型檢測(cè)是利用細(xì)菌莢膜多糖與其特異性抗體發(fā)生反應(yīng)來(lái)判別對(duì)應(yīng)的血清型，但是該方法操作復(fù)雜，耗時(shí)較長(zhǎng)，需要對(duì)應(yīng)血清型的血清抗體且成本較高，S.agalactiaeⅨ型血清抗體并沒(méi)有商品化難以用此方法進(jìn)行鑒定，而且S.agalactiae莢膜多糖在某些特定的條件下可能不表達(dá)，傳統(tǒng)方法不能區(qū)分S.agalactiae莢膜多糖缺失和莢膜多糖抗原濃度太低而導(dǎo)致的陰性結(jié)果[19]。用分子生物學(xué)方法鑒定S.agalactiae血清型，能快速準(zhǔn)確檢測(cè)出S.agalactiae的莢膜多糖血清型，彌補(bǔ)了傳統(tǒng)血清型檢測(cè)方法的不足。Kong等[60]利用PCR方法鑒定S.agalactiaecps、alp2、alp3、bac、rib、bca等表面蛋白基因，利用表面蛋白基因結(jié)合血清亞型把224株S.agalactiae分成了31個(gè)血清型變種，發(fā)現(xiàn)不同的血清型菌株和某些表面蛋白基因具有密切聯(lián)系，為S.agalactiae血清亞型的分析提供了新的研究思路。同時(shí)他們對(duì)分離的206株S.agalactiae采用PCR方法和傳統(tǒng)血清型檢測(cè)方法進(jìn)行對(duì)比檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)PCR方法的分型結(jié)果和傳統(tǒng)方法的結(jié)果完全一致，證明了分子生物學(xué)方法可以替代傳統(tǒng)血清型檢測(cè)方法。

根據(jù)S.agalactiae莢膜多糖基因簇的差異性，分為10種血清型(Ia、Ib、II-IX型)[61]。S.agalactiae血清型分型，在羅非魚(yú)中的研究較多，人源也有部分研究。大部分研究表明廣東、廣西、海南、福建和云南等地主要流行的是羅非魚(yú)源Ia血清型；廣東、廣西和海南等局部地區(qū)主要流行的是Ib型S.agalactiae；廣西等局部地區(qū)流行的是III型S.agalactiae[62-64]。目前，中國(guó)、泰國(guó)、越南、美國(guó)和巴西等國(guó)家廣泛流行的是羅非魚(yú)源Ia型S.agalactiae[65-67]。同樣，在中國(guó)、洪都拉斯[68]、厄瓜多爾[69]、比利時(shí)[70-71]、巴西[72]、哥倫比亞[73]、哥斯達(dá)黎加[70]等國(guó)家均有羅非魚(yú)源Ib型S.agalactiae的流行記錄。羅非魚(yú)源III型S.agalactiae在泰國(guó)、越南也有發(fā)現(xiàn)。在泰國(guó)，目前已報(bào)道的主要流行菌株是Ia型，其次是III型[74-75]。Chen等[76]報(bào)道人源Ia、III和V血清型S.agalactiae能夠感染羅非魚(yú)，但在不同魚(yú)源S.agalactiae之間是否存在交叉感染情況還有待進(jìn)一步研究。

4.2 MLST

MLST分型方法最大的優(yōu)點(diǎn)就是具有全球共享MLST數(shù)據(jù)庫(kù)，通過(guò)上傳MLST實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)到MLST數(shù)據(jù)庫(kù)可以實(shí)現(xiàn)分型數(shù)據(jù)共享，從而進(jìn)行全球范圍內(nèi)的細(xì)菌ST型比對(duì)[77]。如今，細(xì)菌基因組測(cè)序技術(shù)已非常成熟，MLST基因序列檢測(cè)的成本不斷降低，加之細(xì)菌MLST分型實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)便，實(shí)驗(yàn)結(jié)果分辨率高，已成為各類病原菌大范圍長(zhǎng)期的分子流行病學(xué)研究的首選方法。

MLST通過(guò)測(cè)序分析細(xì)菌多個(gè)管家基因的核酸序列，從而對(duì)細(xì)菌基因組等位基因的多態(tài)性進(jìn)行比較。細(xì)菌所有管家基因的等位基因組合起來(lái)形成等位基因圖譜，將每個(gè)等位基因圖譜型對(duì)應(yīng)一個(gè)相應(yīng)的序列型(Sequence typing，ST)，分析比對(duì)細(xì)菌ST型，具有相同ST型或者僅有一兩個(gè)基因座不同的細(xì)菌具有密切的相關(guān)性[78]。張雨薇等[79]在感染羅非魚(yú)和黃河裸裂尻魚(yú)的S.agalactiae中均分離到ST-891型菌株，是中國(guó)羅非魚(yú)源S.agalactiae新發(fā)現(xiàn)的ST型菌株。Brochet等[80]收集世界各地75株S.agalactiae(包括婦女、兒童、奶牛、狗、貓和鱒魚(yú))，人源S.agalactiae具有豐富的ST型，其中ST-17型菌株的比例最高，牛源菌株均為ST-8型(3株)，狗源S.agalactiae為ST-1型，在巴黎分離到的人源S.agalactiae也主要是ST-1型，分離自貓和兔子的S.agalactiae同屬于ST-19型，鱒魚(yú)源S.agalactiae為ST-246型；進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，MLST在細(xì)菌流行地域分析上具有很大的優(yōu)勢(shì)；同時(shí)還發(fā)現(xiàn)相同的宿主源在同一地區(qū)不同流行時(shí)間的S.agalactiae也出現(xiàn)了ST型的變遷。

4.3 PFGE

PFGE方法常被認(rèn)為是細(xì)菌分子流行病學(xué)研究的“金標(biāo)準(zhǔn)”，主要是對(duì)細(xì)菌的基因片段分型[81-82]。經(jīng)過(guò)比對(duì)發(fā)現(xiàn)，PFGE分型具有更高的辨識(shí)度，能分辨出的基因差異更大；而MLST分型可操控能力更強(qiáng)，數(shù)據(jù)的重復(fù)性更好，若將兩種方法結(jié)合使用，能更全面的反應(yīng)細(xì)菌的分子流行特征。

PFGE分型已經(jīng)普遍用于對(duì)羅非魚(yú)源S.agalactiae分子流行病學(xué)的分析。廣東等地區(qū)的主要流行菌株有多個(gè)PFGE基因型，方偉等[83]對(duì)廣東地區(qū)羅非魚(yú)源146株S.agalactiae進(jìn)行PFGE分型，可分成6種遺傳簇，不同地區(qū)的流行菌株具有相同的PFGE型，具有交叉感染的可能性。李莉萍等[84]對(duì)廣西地區(qū)羅非魚(yú)源無(wú)乳菌進(jìn)行鑒定和脈沖場(chǎng)凝膠電泳聚類分析發(fā)現(xiàn)2006年至2011年94．7%的流行菌株為海豚鏈球菌，2012年以后96．6%的流行菌株為S.agalactiae；海豚鏈球菌存在4種PFGE帶型，帶型相似度高；S.agalactiae有5種PFGE帶型，相似度為47．4%～100%；各個(gè)地區(qū)流行菌株的PFGE帶型差異明顯。廣東等地區(qū)的主要流行菌株都有多個(gè)PFGE基因型，李莉萍等[85]對(duì)2009年至2011年67株羅非魚(yú)源S.agalactiae進(jìn)行PFGE分型，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)同一基因型的菌株，表明67株S.agalactiae流行菌株比較復(fù)雜且流行的優(yōu)勢(shì)菌群存在差異。

4.4 菌毛島嶼分型

菌毛島嶼分型方法是利用菌毛基因組的菌毛島嶼結(jié)構(gòu)分類，該方法在研究較為成熟的國(guó)內(nèi)羅非魚(yú)中鮮有報(bào)道，適合在臨床科研使用，不適合在臨床實(shí)驗(yàn)室廣泛使用。

菌毛在細(xì)菌黏附和入侵宿主細(xì)胞的過(guò)程中發(fā)揮重要作用，而且與細(xì)菌生物膜的形成密切相關(guān)。菌毛結(jié)構(gòu)是由：骨架蛋白(Bone Protein，BP)和位于骨架頂端或基底部的菌毛輔助蛋白(Ancillary Protein，AP)AP1和AP2在分選酶(Sortase，Srt)的作用下組裝而成[86]。S.agalactiae有3種類型的菌毛：PI-1、PI-2a和PI-2b，三者分別對(duì)應(yīng)基因組3個(gè)菌毛島嶼，每種菌毛島嶼蛋白由5種菌毛島嶼基因(菌毛輔助蛋白基因AP1和AP2)調(diào)控，一般情況下S.agalactiae至少存在一個(gè)菌毛島嶼結(jié)構(gòu)[87]。不同的菌毛島嶼其功能也不盡相同，PI-1可能與S.agalactiae在宿主體內(nèi)的免疫逃逸相關(guān)，PI-2b菌毛島嶼則與S.agalactiae黏附和入侵宿主細(xì)胞能力密切相關(guān)[88]。對(duì)印度和美國(guó)流行的S.agalactiae菌毛島嶼進(jìn)行分析比較，發(fā)現(xiàn)印度流行的人源S.agalactiae菌毛島嶼類型是PI-1+PI-2b型，構(gòu)建菌毛蛋白缺失的S.agalactiae突變菌株，發(fā)現(xiàn)其黏附力和入侵宿主的能力較正常菌株出現(xiàn)大幅降低[89]。

4.5 細(xì)菌前噬菌體基因分型

細(xì)菌前噬菌體基因分型是利用細(xì)菌基因組進(jìn)行檢測(cè)，該方法在研究較為成熟的國(guó)內(nèi)少有報(bào)道，適合在臨床科研使用，不適合在臨床實(shí)驗(yàn)室廣泛使用。

噬菌體(bacteriophage)是能感染殺死細(xì)菌、真菌及螺旋體等微生物的一種病毒[90]。溫和性噬菌體能將自身基因組整合于宿主細(xì)菌基因組中進(jìn)行復(fù)制及傳代，與宿主菌之間是寄生關(guān)系；這種整合于宿主菌基因組中的噬菌體則為前噬菌體，研究發(fā)現(xiàn)約65%的細(xì)菌基因組中攜帶有前噬菌體[91]。Schmieger等[92]對(duì)173株傷寒沙門(mén)氏菌菌株進(jìn)行前噬菌體檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)78．6%的菌株攜帶有前噬菌體。Tang等[93]對(duì)12株豬鏈球菌進(jìn)行基因組序列分型檢測(cè)出5種前噬菌體基因類型。

5 展 望

本文主要從S.agalactiae流行性致病信息、S.agalactiae耐藥性和分子分型方法的優(yōu)缺點(diǎn)三方面對(duì)S.agalactiae目前的研究現(xiàn)狀進(jìn)行了闡述和分析，從β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物和優(yōu)化分子分型方法兩方面進(jìn)行展望。

S.agalactiae對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物的研究主要集中在耐藥基因、毒力基因以及分子分型方法方面的研究，對(duì)其耐藥機(jī)制研究甚少。建議下一步工作可針對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物耐藥機(jī)制找到新的突破口，開(kāi)發(fā)S.agalactiae治療的新型藥物，為臨床合理用藥、優(yōu)化治療方案提供重要的科學(xué)依據(jù)。

理想的分子分型方法需要滿足以下條件：操作簡(jiǎn)單、高效；實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)性好；適用范圍廣，實(shí)用性較強(qiáng)。而S.agalactiae分子分型方法相對(duì)較多，各有優(yōu)缺點(diǎn)，離理想的分子分型方法還有一定的距離，優(yōu)化S.agalactiae檢測(cè)、分型的方法顯得尤其重要。優(yōu)化好S.agalactiae最佳方法可為臨床實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)提供更加合理、高效的檢測(cè)手段，同時(shí)也能為S.agalactiae的感染控制和臨床診斷提供便捷服務(wù)。