馬 丹，王永剛,2*，陳吉祥，楊 智，孫尚琛,，李文新

(1.蘭州理工大學(xué) 石油化工學(xué)院，甘肅 蘭州 730050；2.蘭州理工大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730050；3.蘭州石化能源裝備工程研究院有限公司，甘肅 蘭州 730000)

多環(huán)芳烴是一類廣泛分布并穩(wěn)定存在于自然環(huán)境中的含2個或2個以上苯環(huán)的有毒有機(jī)污染物。菲為一種三環(huán)芳烴，是石油和煤炭加工工業(yè)的副產(chǎn)品，也是土壤沉積物中最常見的一類多環(huán)芳烴污染物[1]。菲具有致癌性、致畸性、致突變性、生物累積性以及內(nèi)分泌擾亂等特性，對人體健康和自然環(huán)境有極大危害。微生物可以通過自身的代謝將多環(huán)芳烴進(jìn)行分解轉(zhuǎn)化，從而降低多環(huán)芳烴對生態(tài)環(huán)境的污染。目前采用微生物去除多環(huán)芳烴的方法是最常見的途徑之一[2-4]。研究較為廣泛的可降解菲的菌屬主要有芽胞桿菌屬(Bacillus)[5-6]、氣單胞菌屬(Aeromonas)[7]、假單胞菌屬(Pseudomonas)[8]、鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)[9-10]和根瘤菌[11]等。而約翰遜不動桿菌屬細(xì)菌的研究主要集中在對處理污水和污物中的氮磷化合物，對外界不利條件的抵抗能力以及耐藥性和耐藥機(jī)制等方面。其中研究最深入的是其聚磷與解磷特性及其機(jī)制[12-13]。Li等[4]在低溫中篩選出1株可以以檸檬酸鈉和乙酸鈉等為唯一碳源的約翰遜不動桿菌，該菌株呈現(xiàn)出較高的亞硝酸鹽積累效率和較低的硝酸鹽移除效率。約翰遜不動桿菌還具有較普遍的耐藥性[15]。Wang等[16]從土壤中篩選出1株能產(chǎn)脂肪酶的約翰遜不動桿菌。蘇丹等[17]以約翰遜不動桿菌DBP-3菌株為研究對象，對其冷休克蛋白基因進(jìn)行了克隆及表達(dá)。在環(huán)境領(lǐng)域內(nèi)關(guān)于約翰遜不動桿菌對多環(huán)芳烴菲降解機(jī)制和應(yīng)用鮮有報道。有部分報道主要是不動桿菌屬細(xì)菌對其他烴類化合物的降解。劉玉華等[18]概述了不動桿菌屬細(xì)菌對烷烴、芳香烴等石油組分的降解。周婷等[19]篩選出2株不動桿菌，并對菌株的石油降解功能進(jìn)行研究，而該菌株能夠利用一定濃度的烷烴以及多環(huán)芳烴進(jìn)行生長。本研究從蘭州某化工廠石油廢水中分離篩選出1株不動桿菌屬的高效菲降解菌，并對該菌株的生長特性、降解特性、降解動力學(xué)、菲的相關(guān)降解基因及參與菲代謝關(guān)鍵酶酶活進(jìn)行了研究，以期為菲及其他多環(huán)芳烴的生物處理提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 菌株F-1分離自蘭州某化工廠含油廢水的污染水樣。

1.1.2 培養(yǎng)基 ①LB固體培養(yǎng)基：酵母粉 2.5 g，蛋白胨 5 g，NaCl 5 g，瓊脂 10 g，蒸餾水 1 000 mL,pH 7.0，1×105Pa滅菌20 min。②液體培養(yǎng)基：酵母粉 2.5 g，蛋白胨 5 g，NaCl 5 g，蒸餾水 1 000 mL，pH 7.0，121 ℃滅菌20 min。③基礎(chǔ)培養(yǎng)基：NH4NO33 g，K2HPO41.5 g，KH2PO41.5 g，F(xiàn)eCl20.01 g，無水CaCl20.01 g，MgSO4·7H2O 0.1 g，NaCl 0.5 g，蒸餾水 1 000 mL，pH 7.0，1×105Pa滅菌20 min。④篩選培養(yǎng)基：不同濃度菲為唯一碳源的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。

1.1.3 試劑和儀器 菲(純度≥97%，天津希恩思)，環(huán)己烷、正己烷(色譜純，天津市彪仕奇)，其他試劑均為分析純。無菌操作臺(SW-CJ-2FD，蘇州安泰)，全自動高壓滅菌鍋 (280SA，致微儀器)，恒溫振蕩器(IS-RDV1，美國精騏)，紫外分光光度計(UV-2102PC，尤尼柯上海儀器)，PCR擴(kuò)增儀(TC-96/G/H，杭州博日)。

1.2 方法

1.2.1 菲降解菌的篩選 吸取1 mL水樣于100 mL篩選培養(yǎng)基中，30 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)3 d后，從培養(yǎng)液中吸取1 mL置于新的篩選培養(yǎng)基中，重復(fù)3次。將最后一次的培養(yǎng)液涂布于固體篩選基礎(chǔ)培養(yǎng)基上，30 ℃恒溫過夜暗室培養(yǎng)后，采用劃線分離法進(jìn)行分離與純化，-70 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 降解菌株的鑒定 采用細(xì)菌DNA抽提試劑盒提取菌株基因組DNA，采用16S rDNA通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)與1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGCTT-3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增條件：94 ℃ 5 min，94 ℃ 1 min，58 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，循環(huán)30次；72 ℃ 10 min。擴(kuò)增結(jié)束后，產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，將檢測大小正確的PCR產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序，測序結(jié)果提交NCBI/BLAST數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對分析，選取一致性在98%以上的近緣性物種，用MEGA 6.06軟件按照鄰接法(Neighbor-Joining)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，自展值為1 000。

1.2.3 菲降解菌生長特性 按2%接種量將菌株F-1接種于以菲(100 mg/L)為唯一碳源的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，采用濁度法分別考察菌株F-1在不同溫度(4、10、20、25、30、40和50 ℃)、不同pH值(2、3、4、5、6、7、8、9和10)、不同鹽度(0%、0.3%、0.5%、1%、2%、3%、4%、5%、6%和7%)條件下的生長狀況，震蕩培養(yǎng)24 h后測定OD600值，確定菌株F-1的最適生長溫度、pH和鹽度。

1.2.4 菲降解菌降解特性 取F-1菌液轉(zhuǎn)接到以菲(100 mg/L)為唯一碳源的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，30 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)，在4、8、12、24、28、32、36、48、52、56 h對其進(jìn)行取樣涂平板計數(shù)，計算菌株在該培養(yǎng)基中生長數(shù)量。將菌株F-1分別接種于含有不同質(zhì)量濃度菲(50、100、150、200、250、400、600、800 mg/L)為唯一碳源的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，30 ℃、180 r/min震蕩培養(yǎng)24 h后測定OD600值，確定其菲的耐受范圍，并采用平板涂布法進(jìn)行菌落計數(shù)。同時考察菌株F-1在以聯(lián)苯、萘、蒽、菲、芘、直鏈烴(正癸烷、十二烷、十四烷、十六烷、十八烷、二十二烷、二十四烷和二十八烷)為唯一碳源的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的降解特性。

1.2.5 菲的測定 以環(huán)己烷作溶劑，精確配置 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mg/L菲的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在波長為251 nm處用紫外分光光度計進(jìn)行菲濃度的測定，繪制菲的標(biāo)準(zhǔn)曲線。同樣采用環(huán)己烷萃取實驗樣品，多次萃取，合并萃取液，經(jīng)無水硫酸鈉脫水后，定容至50 mL，作為待測樣品。并于251 nm波長處測定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算培養(yǎng)基中殘留菲的濃度，從而計算降解率。

1.2.6 降解動力學(xué)研究 將多環(huán)芳烴菲的濃度隨時間變化的趨勢與零級、一級、二級動力學(xué)方程進(jìn)行擬合，取相關(guān)系數(shù)高者為相應(yīng)的反應(yīng)級數(shù)。

零級降解動力學(xué)方程：c=-κt+c0(1)

t1/2=c0/(2κ) (2)

一級降解動力學(xué)方程：lnc=-κ1t+c0(3)

t1/2=ln2/κ1(4)

二級降解動力學(xué)方程： 1/c=κ2t+1/c0(5)

t1/2=1/(κ2·c0) (6)

式中：c為菲質(zhì)量濃度(mg/L)；t為降解時間(h)；t1/2為降解半衰期(h)；κ為零級降解速率常數(shù)；κ1為一級降解速率常數(shù)；κ2為二級降解速率常數(shù)。

1.2.7 菌株F-1對直鏈烷烴的GC-MS分析 分別稱取正癸烷、十二烷、十四烷、十六烷、十八烷各3.75 g，二十二烷、二十四烷及二十八烷各1.25 g，用正己烷定容至25 mL，配制成正癸烷、十二烷、十四烷、十六烷、十八烷的終質(zhì)量濃度為750 mg/L，二十二烷、二十四烷及二十八烷的終質(zhì)量濃度為25 mg/L的混合液，每100 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入2 mL混合液，并接入2%的F-1菌液，30 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)3 d。采用正己烷萃取實驗樣品，多次萃取，合并萃取液，經(jīng)無水硫酸鈉脫水后，定容至50 mL。用GC-MS測定其降解率[20]，十五烷作內(nèi)標(biāo)，在中國科學(xué)院蘭州化學(xué)物理研究所完成。

1.2.8 芳烴降解基因的PCR檢測 參考菌株AcinetobacterjohnsoniiXBB1基因序列(登錄號為CP010350)，選擇與芳烴降解相關(guān)的鄰苯二酚-1,2-雙加氧酶、苯甲酸鹽雙加氧酶、鐵氧化還原蛋白還原酶、乙醇脫氫酶、二羥酸脫水酶、醛縮酶和氧化還原蛋白基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。設(shè)計特異性引物見表1，反應(yīng)條件同1.2.2。

1.2.9 鄰苯二酚-1,2-雙加氧酶活力的測定 將菌株F-1接種到液體LB培養(yǎng)基及菲質(zhì)量濃度分別為50、100、150 mg/L的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，過夜培養(yǎng)16 h，離心收集菌體，用磷酸緩沖液重懸。采用超聲破碎儀在冰浴中進(jìn)行破碎，8 500 r/min、4 ℃下離心30 min后取上清液(粗酶液)。石英比色皿中分別加入粗酶液(0.2 mL)、磷酸緩沖液(2.4 mL)和20 μmol/L鄰苯二酚溶液(0.4 mL)，37 ℃恒溫水浴鍋中反應(yīng)30 min。在253 nm處測定光吸度值，計算光吸度增加值。酶活力單位(U)定義：37 ℃反應(yīng)30 min條件下，每分鐘內(nèi)OD值變化0.001為1個酶活力單位(U)。

表1 菌株F-1降解基因檢測引物Table 1 Primers for PCR detection of phenanthrene-degrading related genes

2 結(jié)果與分析

2.1 高效降解菲菌株篩選結(jié)果

采用篩選培養(yǎng)基從石油廢水中共分離獲得6株可以利用菲的菌株，分別編號為S-1、S-2、F-1、F-2、F-3、F-4。分別以2%的接種量接種到以菲(100 mg/L)為唯一碳源的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，30 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)5 d后，菲的降解率如圖1。其中菌株F-1降解菲的能力最強(qiáng)，降解率為43.57%。因此，將菌株F-1作為后續(xù)研究的主要對象。

圖1 不同菌株對菲的降解率Fig.1 Phenanthrene degradation rate of the different strains

2.2 菌株F-1的鑒定結(jié)果

菌株F-1在LB固體培養(yǎng)基上30 ℃過夜培養(yǎng)后，菌落呈乳白色，表面光滑，革蘭染色結(jié)果顯示為陰性細(xì)菌。菌株F-1部分生理生化特性結(jié)果見表2，該菌株除精氨酸、鳥氨酸、賴氨酸及尿素是陽性反應(yīng)外，其余均為陰性反應(yīng)。基于16S rDNA序列分析比對結(jié)果，采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖2。從圖2中可以看出，菌株F-1與約翰遜不動桿菌屬細(xì)菌聚為一類，親緣關(guān)系最近，與AcinetobacterjohnsoniiATCC 17909 16S rDNA序列一致性為100%。因此，結(jié)合菌落形態(tài)和生理生化實驗結(jié)果進(jìn)一步說明菌株F-1為約翰遜不動桿菌屬。提交GenBank數(shù)據(jù)庫，登錄號為MF447530。

表2 菌株F-1部分生理生化特性Table 2 Biochemical tests performed on the strain F-1

注：“+”表示陽性反應(yīng)；“-”表示陰性反應(yīng)

圖2 菌株F-1系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic tree of the bacteria F-1 based on the 16S rDNA sequences

2.3 菲降解菌F-1的生長特性

菌株F-1在不同pH、溫度、初始濃度、鹽度及時間的生長情況見圖3。由圖3A可知，菌株F-1在4～50 ℃范圍內(nèi)能正常生長。最適生長溫度為30 ℃，生長速度最快；在低溫(4～20 ℃)和高溫(>50 ℃)條件下生長較為緩慢。圖3B顯示菌株 F-1在pH為5～9能夠正常生長。最適pH為7，偏酸性；而在pH為2和10時幾乎不能生長。圖3C顯示其最適鹽度為0.3%，隨著鹽度升高，菌株生長情況逐漸降低，最大耐受鹽濃度可達(dá)7%。圖3D說明菌株F-1在菲初始質(zhì)量濃度為250 mg/L時生長最好，在800 mg/L的質(zhì)量濃度下依然可以生長，但生長微弱。可見，該菌株具有較好的環(huán)境適應(yīng)性和較高菲濃度耐受性。

圖3 菲降解菌生長特性Fig.3 Growth characteristics of the phenanthrene-degrading bacteria

2.4 降解動力學(xué)

分別將降解率與時間關(guān)系用零級、一級、二級動力學(xué)方程擬合[21-22]，得到降解動力學(xué)擬合方程，結(jié)果如圖4。降解半衰期分別為136.24、143.21和153.89 h。從圖4中可以看出，二級方程擬合系數(shù)為0.986 75，線性相關(guān)性良好。在120 h內(nèi)將菲的含量從100 mg/L降解到56.43 mg/L,降解率為43.57%。

2.5 菌株F-1對直鏈烷烴的GC-MS分析

菌株F-1在以菲(100 mg/L)為唯一碳源的培養(yǎng)基中生長情況見圖5A，可見在12～24 h菌株生長情況最好，24 h后呈下降趨勢。菌株F-1在不同芳烴中的生長情況見圖5B，菌株F-1分別在聯(lián)苯、萘、蒽、菲和芘(各終濃度均為100 mg/L)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中生長24 h后，測得其在聯(lián)苯以及菲中生長旺盛，但在萘、蒽和芘中的生長情況較差。采用GC-MS分析菌株F-1對直鏈烷烴正癸烷、十二烷、十四烷、十六烷、十八烷、二十二烷、二十四烷、二十八烷的降解效果，GC-MS檢測如圖5C、D，培養(yǎng)3 d后，正癸烷的降解率為25.3%，十二烷為10.2%，十四烷為11.6%，十六烷為15.6%，十八烷為27.4%，二十二烷為16%，二十四烷12%，二十八烷11%。由此可知，菌株F-1不僅可以高效的降解多環(huán)芳烴菲，對直鏈烷烴也有較好的降解效果。

圖4 菌株F-1對菲的降解動力學(xué)曲線Fig.4 Dynamics curve of the degradation of phenanthrene of strain F-1

圖5 降解特性及菌株F-1降解直鏈烷烴的GC-MS分析Fig.5 GC-MS analysis of the straight-chain alkane by the Strain F-1

2.6 菲降解相關(guān)基因檢測

微生物降解與代謝烴類化合物主要依賴于基因組多種功能性基因協(xié)作調(diào)控完成的。采用PCR特異性擴(kuò)增從菌株F-1全基因組中檢測到鄰苯二酚-1,2-雙加氧酶、苯甲酸鹽雙加氧酶、鐵氧化還原蛋白還原酶、乙醇脫氫酶、二羥酸脫水酶、醛縮酶、氧化還原蛋白7種基因存在，電泳結(jié)果見圖6。這些基因的存在進(jìn)一步證明了菌株F-1具有降解菲以及其他烴類化合物的能力，具體基因之間如何協(xié)作調(diào)控還有待進(jìn)一步研究。

圖6 菌株F-1降解基因PCR檢測電泳圖Fig.6 Electrophoresis of the phenanthrene-degrading genes of the strains F-1M: DNA Maker； 1、4: 二羥酸脫水酶DAD和DAD2; 2: 醛縮酶A; 3:鄰苯二酚-1,2-雙加氧酶C12D; 5: 氧化還原蛋白; 6: 乙醇脫氫酶AD; 7: 鐵氧化還原蛋白還原酶FR; 8: 苯甲酸鹽雙加氧酶 B12DM: DNA Marker; 1,4: dihydroxy-acid dehydratase DAD&DAD2; 2: aldolase A; 3: catechol-1,2-dioxygenase C12D; 5: ferredoxin; 6: alcohol dehydrogenase AD; 7: ferredoxin reductase FR; 8: benzoate-1,2-dioxygenase B12D

2.7 鄰苯二酚-1,2-雙加氧酶活力

鄰苯二酚-1,2-雙加氧酶是參與多環(huán)芳烴降解的關(guān)鍵性酶[23]。分別將F1接種在含不同濃度菲為唯一碳源的培養(yǎng)基和LB培養(yǎng)基中，30 ℃、180 r/min培養(yǎng)16 h后，測定鄰苯二酚-1,2-雙加氧酶活力，結(jié)果見圖7。由圖7可知，隨著培養(yǎng)基中菲濃度的升高，鄰苯二酚-1,2-雙加氧酶活力呈極顯著性增加(P<0.01)，而在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)菌株的酶活力僅為1.3 U。這可能是因為缺少了菲作為底物的誘導(dǎo)，使得鄰苯二酚-1,2-雙加氧酶在菌體中的組成型表達(dá)量減少，由此說明鄰苯二酚-1,2-雙加氧酶是環(huán)境誘導(dǎo)性酶，而且有研究表明，菲濃度與酶活力之間存在正相關(guān)關(guān)系[24-25]，與本文研究結(jié)果一致。

圖7 不同碳源和菲濃度中的酶活力Fig.7 Activity of catechol-1,2-dioxygenase under different phenanthrene concentrations and different source of carbon

3 討 論

石油及化學(xué)加工業(yè)的快速發(fā)展，導(dǎo)致多環(huán)芳烴被帶入環(huán)境，大面積的土壤及水源受到了威脅。由于多環(huán)芳烴在環(huán)境中的難降解性、致癌性、致畸性及致突變性，使其成為污染生態(tài)學(xué)研究的重點(diǎn)污染物。菲一直是科研人員在多環(huán)芳烴研究中的代表性污染物。因此，篩選出能有效降解菲的菌株更具應(yīng)用價值。Janikowski等[26]實驗表明鞘氨醇單胞菌屬對菲的降解率在75 h達(dá)98 mg/(L·h) 。鄧軍等[27]從受多環(huán)芳烴污染的土壤中篩選出1株氧化節(jié)桿菲降解菌，在含菲的基礎(chǔ)培養(yǎng)基(初始質(zhì)量濃度為50 mg/L)5 d降解率可達(dá)60%。徐成斌等[28]從活性污泥中篩選出耳炎假單胞菌，培養(yǎng)96 h后降解率為65.8%。

大量研究表明，微生物對多環(huán)芳烴代謝主要通過各種芳烴加氧酶去除芳香環(huán)取代基和引入羥基，使芳香環(huán)打開后進(jìn)一步降解。馬迎飛等[29]從活性污泥中篩選出假單胞菌屬，經(jīng)PCR擴(kuò)增和體外克隆獲得雙加氧酶基因。Meyer等[30]從廢水以及土壤中分離出紅球菌屬和假單胞菌屬兩種菲降解菌，利用PCR技術(shù)檢測出鄰苯二酚雙加氧酶。Chang-Hyun Chang等[31]從土壤中篩選出3株菲降解菌，通過PCR擴(kuò)增檢測出鄰苯二酚2，3-雙加氧酶。Taylo等[32]、Seo等[33]相繼對PAHs降解菌的相關(guān)基因做了研究。而細(xì)菌對菲的降解主要有兩個途徑即水楊酸途徑和鄰苯二甲酸途徑[34]。Robin等[35]篩選出1株分枝桿菌，能夠降解多環(huán)芳烴(PAHs)，驗證該菌是通過鄰苯二甲酸途徑降解菲。何麗娟等[36]從石油污染土壤中分離到1株鞘氨醇桿菌屬，對降解途徑的初步研究顯示，該菌株通過水楊酸途徑降解菲。曹軍偉等[37]從深海環(huán)境篩選出1株CeleribacterindicusP73，通過GC-MS聯(lián)用技術(shù)鑒定出該菌降解菲的兩個重要代謝產(chǎn)物為1-羥基-2-萘甲酸和1-萘酚。

多環(huán)芳烴由于自身穩(wěn)定的環(huán)狀結(jié)構(gòu)以及較差的水溶性，使得其難以被微生物利用。多環(huán)芳烴污染的土壤中含有較高濃度的鹽類物質(zhì)，而鹽濃度過高會抑制微生物的生長，從而影響微生物對多環(huán)芳烴的降解效率。微生物的生理活動也受環(huán)境pH值變化的影響，過高或過低的pH值都會影響微生物的生長及降解酶的活性，進(jìn)而降低對多環(huán)芳烴的降解速率[38]。被多環(huán)芳烴嚴(yán)重污染的地區(qū)，因污染物濃度過高，微生物無法生存，導(dǎo)致污染物無法被有效降解。因此，進(jìn)一步豐富多環(huán)芳烴降解微生物菌種庫，闡明多環(huán)芳烴的降解機(jī)制是至關(guān)重要的。

本研究從石油廢水中分離到1株以菲為唯一碳源生長的約翰遜不動桿菌屬細(xì)菌F-1，該菌株有較強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)能力，在25～40 ℃、pH值5.0～9.0、鹽度0%～2.0%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))范圍內(nèi)良好生長。在30 ℃、pH 7.0、鹽度0.3%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))、轉(zhuǎn)速180 r/min條件下，培養(yǎng)5 d對菲(終質(zhì)量濃度為100 mg/L)降解率為43.57%，降解過程符合一級動力學(xué)特征。同時能以聯(lián)苯、萘、蒽、芘為唯一碳源良好生長。對直鏈烷烴正癸烷的降解率為25.3%，十二烷為10.2%，十四烷為11.6%，十六烷為15.6%，十八烷為27.4%，二十二烷為16%，二十四烷12%，二十八烷11%。菌株F-1基因組中存在大量與烴類化合物代謝相關(guān)的基因，進(jìn)一步研究對含菲廢水及多環(huán)芳烴污染的處理和深度修復(fù)有著潛在的應(yīng)用前景。