張曉偉，郭敏瑞，郭慧靜，陳國剛

(石河子大學(xué) 食品學(xué)院，新疆 石河子 832000)

Argonaute蛋白在小RNA分子(siRNA、piRNA、miRNA)沉默通路中起到重要的作用，它是RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RISC)的核心成分[1]。成熟的小RNA需要被結(jié)合到Argonaute蛋白以及其他相關(guān)蛋白質(zhì)上形成RNA誘導(dǎo)的RISC[2]。RISC可以催化小RNA去抑制mRNA的翻譯或者直接降解靶mRNA，從而實現(xiàn)小RNA的生理功能[3]。目前研究發(fā)現(xiàn)，Argonaute蛋白廣泛存在于生物界中，是高度保守的一類蛋白質(zhì)[4]。Argonaute蛋白質(zhì)通常由N末端、PAZ、MID和PIWI 4個結(jié)構(gòu)域組成，主要結(jié)構(gòu)域是PAZ和PIWI。PAZ結(jié)構(gòu)域含有110個氨基酸，結(jié)合到siRNA的3′的二核苷酸突出端，是小RNA的結(jié)合位點[5-6]。盡管大多數(shù)種類的小RNA在一定程度上都能和不同類型的Argonaute蛋白結(jié)合，但特定的小RNA與特定的Argonaute蛋白結(jié)合更容易[7]。PIWI結(jié)構(gòu)域是一類生殖系細胞專一性蛋白，是Argonaute蛋白家族行使切割功能的活性中心，一些Argonaute蛋白質(zhì)的PIWI結(jié)構(gòu)域賦予slicer以內(nèi)切酶的活性，切割并降解靶mRNA[8]。Argonaute蛋白的作用非常廣泛而且極其重要，目前Argonaute蛋白的基本結(jié)構(gòu)、功能和作用機制已經(jīng)成為研究熱點。Argonaute蛋白家族不僅分布的數(shù)量和種類具有物種差異性，而且成員之間所發(fā)揮的生物學(xué)功能也具有特異性[9]。根據(jù)溫劍[10]的研究，作為真核生物的代表，釀酒酵母體內(nèi)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了近32種miRNA分子，這些小RNA分子中的大多數(shù)可能與動植物細胞中的小RNA一樣，也是通過與Argonaute蛋白結(jié)合作用靶mRNA來影響mRNA的穩(wěn)定性或翻譯，進一步調(diào)控生物體的基因表達。但研究人員發(fā)現(xiàn)，作為RISC核心物質(zhì)存在的Dicer酶和Argonaute蛋白在釀酒酵母中是沒有的[11]，因此本研究將海洋細菌Argonaute蛋白基因在釀酒酵母細胞中進行表達，用以研究海洋細菌Argonaute蛋白的功能。相關(guān)研究表明，在動物體中，小RNA中的成員miRNAs參與了脂肪細胞分化、脂代謝等多種生物過程調(diào)控，而其自身也受到轉(zhuǎn)錄因子、脂肪細胞因子和環(huán)境因子等調(diào)控[12]，但這些具有調(diào)控功能的小RNA通常都是和相關(guān)蛋白質(zhì)結(jié)合而發(fā)揮其功能，因此Argonaute蛋白很可能參與脂肪酸代謝通路的調(diào)控過程。Argonaute蛋白作為RISC的關(guān)鍵蛋白在所有已知的小RNA沉默通路中起到關(guān)鍵作用。在動植物中，Argonaute蛋白還具有切割活性，能抑制靶mRNA的翻譯，在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后層面具有調(diào)控作用[13]。由此可見，無論是在復(fù)雜或簡單的生物體中，Argonaute蛋白和小RNA的相互作用都是普遍存在且具有特殊功能的。多種動植物和真菌的Argonaute蛋白基因已被克隆并驗證了功能，并且已有的研究主要集中在高等的動植物中[14-15]。目前，關(guān)于海洋細菌的Argonaute蛋白功能性研究鮮有報道，尤其是海洋細菌Argonaute蛋白能否通過與miRNA結(jié)合從而對脂肪酸代謝產(chǎn)生調(diào)控作用還尚未被研究。海蘇特氏菌(Joostellamarina)是一種從海水中分離出來的海洋細菌，其基因組中包含Argonaute蛋白基因。為了克隆和表達Jm-Argonaute蛋白基因并驗證其對釀酒酵母脂肪酸的影響，本研究克隆了含有SIR2和Piwi結(jié)構(gòu)域的海蘇特氏菌Argonaute蛋白基因，并構(gòu)建基因表達載體轉(zhuǎn)化至釀酒酵母BY4742細胞進行表達，分析該蛋白對酵母脂肪酸含量和種類的影響。實驗結(jié)果為研究Argonaute蛋白提供了新的思路，也為進一步探究Argonaute蛋白在釀酒酵母脂肪酸合成和分解代謝過程中的作用，進而為應(yīng)用基因工程技術(shù)改造釀酒酵母脂肪酸代謝途徑，用以生產(chǎn)油脂的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質(zhì)粒以及引物設(shè)計 海蘇特氏菌(Joostellamarina)購自中國普通微生物菌種保藏管理中心，按照說明書復(fù)蘇并活化菌株，使用海洋細菌培養(yǎng)基2216E在30 ℃條件下培養(yǎng)。釀酒酵母細胞表達載體pCRCT由本實驗室保存。所有的大腸埃希菌DH5α感受態(tài)細胞均購自青島擎科生物技術(shù)有限公司，釀酒酵母細胞BY4742由國家海洋局第一海洋研究所饋贈。研究中所涉及到

表1 菌株和質(zhì)粒Table 1 Strains and plasmids

的野生型菌株、重組菌株以及原始質(zhì)粒和重組質(zhì)粒均由本實驗室完成，由青島擎科生物技術(shù)有限公司測序驗證正確性，結(jié)果如表1所示。實驗過程中用到的引物均由本實驗室自己設(shè)計，由青島擎科生物技術(shù)有限公司合成，引物序列如表2所示。

表2 實驗中用到的所有引物Table 2 All of the primers used in this study

1.1.2 培養(yǎng)基 所有的大腸埃希菌DH5α(TSINGKE China)均用LB液體培養(yǎng)基(蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L)在37 ℃下培養(yǎng)，并按照劑量要求加入100 mg/L的氨芐抗生素。釀酒酵母BY4742(國家海洋局第一海洋研究所饋贈)保種從-80 ℃取出，并轉(zhuǎn)接至5 mL YPD液體培養(yǎng)基(葡萄糖 20 g/L，蛋白胨20 g/L，酵母膏10 g/L)過夜活化。然后轉(zhuǎn)接2 mL菌液至100 mL YPD液體培養(yǎng)基中，將突變菌株與對照組OD600 nm值調(diào)節(jié)至0.2，30 ℃、250 r/min搖床培養(yǎng)72 h，通過離心和冷凍干燥收集細胞，-20 ℃保存?zhèn)溆?。URA缺陷型液體培養(yǎng)基：0.8 g/mL URA，調(diào)節(jié)pH值至6～6.5，滅菌后加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的葡萄糖。

1.1.3 試劑與儀器TaqDNA聚合酶T5，高保真DNA聚合酶I5均購自TaKaRa公司；細菌DNA提取試劑盒、細菌質(zhì)粒小提試劑盒、酵母細胞質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒均購自O(shè)mega公司；無縫克隆試劑盒購自青島擎科生物技術(shù)有限公司；DNA maker、蛋白maker、酵母提取物、胰蛋白胨、瓊脂糖等購自青島瑞德合益商貿(mào)有限公司；其他化學(xué)試劑均為分析純和色譜純購自國藥?；蛎}沖電轉(zhuǎn)儀(BIO-RAD，USA)。

1.2 方法

1.2.1 Jm-Argonaute基因克隆與表達載體的構(gòu)建 依據(jù)NCBI上已有的海蘇特氏菌Argonaute蛋白基因，使用primer5.0軟件設(shè)計P1、P2、P3和P4四種PCR引物并送至青島擎科生物技術(shù)有限公司合成。使用細菌DNA試劑盒提取海蘇特氏菌基因組DNA作為模板，進行巢式PCR擴增目的基因，設(shè)計引物為目的基因兩端添加核定位信號，并組裝各表達原件，最后使用Hieff CloneTM一步PCR無縫克隆試劑盒將重疊PCR的產(chǎn)物TEF1-Jm-Argonaute-ADH2組裝到pZMG中，得到pZMG-Jm-Argonaute基因表達載體。

1.2.2 重組質(zhì)粒的電轉(zhuǎn)化 按照基因脈沖電轉(zhuǎn)儀說明書，制備釀酒酵母BY4742感受態(tài)細胞，準(zhǔn)備用于電轉(zhuǎn)化。隨后將構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒pZMG加入到含有釀酒酵母BY4742感受態(tài)細胞的1.5 mL微量離心管中，使用基因脈沖電轉(zhuǎn)儀調(diào)節(jié)至真核細胞脈沖參數(shù)后對混合后的樣品進行電擊，脈沖電擊一次后，立即加預(yù)冷1 mL山梨醇復(fù)蘇釀酒酵母BY4742細胞，同時做對照，30 ℃孵育1 h后涂板30 ℃過夜培養(yǎng)，用于挑選陽性克隆測序鑒定。

1.2.3 海蘇特氏菌Argonaute蛋白基因的生物學(xué)信息分析 使用引物P1和P2擴增海蘇特氏菌基因組得到3 165 bp的CDS區(qū)片段，經(jīng)測序鑒定序列正確后與其他生物Argonaute蛋白序列進行多重序列比對，利用SMART數(shù)據(jù)庫在線分析海蘇特氏菌Argonaute蛋白序列的結(jié)構(gòu)域。

1.2.4 重組菌株海蘇Argonaute蛋白的表達 將鑒定成功的重組菌株單克隆接種于20 mL URA缺陷型液體培養(yǎng)基(含5%的葡萄糖)中，置于恒溫培養(yǎng)箱30 ℃培養(yǎng)12 h。待OD600值達到2.0后取5 mL轉(zhuǎn)接至100 mL URA缺陷型液體培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)(30 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)72 h)，取10 mL發(fā)酵菌液超聲破碎(功率30 kW)處理，4 ℃、8 000 r/min離心5 min后分別取上清和沉淀用于SDS-PAGE電泳檢測。

1.2.5 重組菌株脂肪酸的GC-MS分析 將含有原始質(zhì)粒pCRCT和重組質(zhì)粒pCRCT-Jm-Argonaute的菌株轉(zhuǎn)接至URA缺陷型液體培養(yǎng)基中，將兩組OD600值調(diào)為0.2左右后再同時于30 ℃、200 r/min搖床培養(yǎng)72 h，離心并收集菌液，冷凍干燥后置于-20 ℃保存，用于脂肪酸的測定。參考Leber等[16]方法提取兩株菌的脂肪酸送GC-MS上機檢測，GC-MS分析所得脂肪酸含量數(shù)據(jù)均使用成對樣本均值分析t檢驗計算樣本間的顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 海蘇特氏菌Argonaute蛋白基因的克隆與載體的構(gòu)建

從海蘇特氏菌中克隆了Argonaute蛋白基因，隨后通過巢式擴增得到了海蘇特氏菌Argonaute蛋白基因的編碼區(qū)，產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳檢測，與預(yù)期大小3 156 bp一致。NCBI比對分析表明該基因包括SIR2 和 Piwi_piwi-like_ProArk結(jié)構(gòu)域。對片段長度為3 156 bp的海蘇特氏菌Argonaute蛋白基因進行擴增和測序驗證。使用DNA man軟件分析表明，海蘇特氏菌Argonaute蛋白基因編碼1 052 bp氨基酸的蛋白質(zhì)，分子量約為121.467 kDa。利用Hieff CloneTM一步PCR無縫克隆試劑盒將TEF1-Jm-Argonaute-ADH2組裝到pZMG中，得到pZMG-Jm-Argonaute基因表達載體，通過測序驗證載體序列正確無突變位點。

2.2 海蘇特氏菌Argonaute蛋白基因多重序列比對及結(jié)構(gòu)域分析

利用GeneBank對海蘇特氏菌Argonaute蛋白及其同源序列進行BLAST比對，為了發(fā)現(xiàn)海蘇特氏菌Argonaute蛋白與其他Argonaute蛋白家族的關(guān)系，將各類Argonaute蛋白家族的代表性成員與其進行多重序列比對，使用Clustal-W進行所有Argonaute蛋白質(zhì)序列比對，通過鄰接方法，用MEGA v5軟件分析，基于序列比對構(gòu)建了來自植物、動物、真菌和其他代表性Argonaute蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹,結(jié)果表明海蘇特氏菌Argonaute蛋白與動植物以及真菌類Argonaute蛋白親緣關(guān)系較遠，屬于某些細菌類蛋白家族，這也證明Argonaute蛋白在進化上是高度保守的(圖1)。

蛋白結(jié)構(gòu)域在線分析軟件SMART分析表明，海蘇特氏菌Argonaute蛋白不僅具有Argonaute蛋白行使切割活性的Piwi結(jié)構(gòu)域，還具有與壽命通路和基因沉默機制相關(guān)的SIR2結(jié)構(gòu)域，并且其已被證明可調(diào)節(jié)基因沉默、DNA修復(fù)及酶的代謝。其中研究最多的功能是基因沉默，包括調(diào)控關(guān)鍵基因、使染色體結(jié)構(gòu)域失活、將其包裝成DNA結(jié)合蛋白不可接近的專門染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)等[17]。

2.3 重組菌株目的蛋白的表達

將構(gòu)建好的重組載體pZMG-Jm-Argonaute電轉(zhuǎn)化至釀酒酵母BY4742感受態(tài)細胞中，培養(yǎng)一定時間后，分別取上清液和超聲破碎后的沉淀用于SDS-PAGE檢測，發(fā)現(xiàn)沉淀中有1條分子量為120 kD左右的蛋白條帶(見圖2)，與目的蛋白分子量一致，而上清液中無特異性條帶，這是海蘇特氏菌Argonaute蛋白基因兩端核定位信號引導(dǎo)的結(jié)果，對照菌株無特異性條帶，證明pZMG-Jm-Argonaute蛋白在核定位信號的引導(dǎo)下成功在釀酒酵母BY4742細胞內(nèi)特異性表達。

圖1 Jm-Argonaute蛋白結(jié)構(gòu)域圖示及進化樹分析Fig.1 Jm-Argonaute protein domain and phylogenetic tree analysisA：Jm-Argonaute蛋白結(jié)構(gòu)域: Jm-Argonaute protein結(jié)構(gòu)域包括了SIR2和Piwi-like亞結(jié)構(gòu)域；B：與其他Argonaute蛋白家族的系統(tǒng)發(fā)育分析: 包括來自NCBI BLAST 的擬南芥Argonaute蛋白(8),秀麗隱桿線蟲Argonaute蛋白(5)和其他文獻中討論的Argonaute蛋白。 進化樹被分為5組( ■ 擬南芥、 ◆ 秀麗隱桿線蟲、△ Piwi、● 原核和原始真核生物、○ Jm-Argonaute蛋白)。系統(tǒng)發(fā)育樹顯示了Jm-Argonaute蛋白質(zhì)與其他Argonaute蛋白家族的關(guān)系A(chǔ)：Jm-Argonaute protein domain: Jm-Argonaute protein domain includes both SIR2 and Piwi-like superfamily domains；B：phylogenetic analysis of other Argonaute protein families: Included are Argonaute proteins found using NCBI BLAST from Arabidopsis (eight),Caenorhabditis elegans (five) and others discussed in the literature.The tree has been divided into four groups ( ■Arabidopsis,◆C.elegans-specific,△Piwi,●prokaryote and primitive eukaryote,and ○Jm-Argonaute protein family).Phylogenetic tree indicating the relationship of Jm-Argonaute protein relative to other Argonaute protein families

2.4 重組菌株脂肪酸成分和含量

在計算釀酒酵母BY4742的脂肪酸含量之前，通過測量37種飽和、不飽和脂肪酸甲酯混合物建立了標(biāo)準(zhǔn)曲線，釀酒酵母中脂肪酸主要以合成C14∶0、C16∶0、C16∶1和C18∶1為主[18]。實驗結(jié)果表明，重組菌株和對照菌株都包含C12∶0、C14∶0、C16∶0、C16∶1 、C18∶0 和C18∶1脂肪酸，這表明Argonaute基因沒有改變釀酒酵母BY4742脂肪酸的種類。

為了清晰地了解海蘇特氏菌Argonaute蛋白對脂肪酸代謝的影響，使用GC-MS分析了重組菌株和對照菌株的脂肪酸成分和含量(表3和圖3)，與帶有原始載體的對照菌株相比，重組菌株具有更高的總脂肪酸含量，達到98.8 mg/g。t-檢驗結(jié)果表明2株菌在脂肪酸含量上具有顯著性差異(P(T<=t)=0.017<0.05)，同時不飽和脂肪酸C16∶1的含量提高得最多，具有顯著性差異(P(T<=t)=0.013<0.05)。綜上所述，發(fā)現(xiàn)海蘇特氏菌Argonaute蛋白對釀酒酵母脂肪酸含量的提高起到了調(diào)控作用，并且主要提高的是不飽和脂肪酸C16∶1的含量。

圖2 海蘇特氏菌Argonaute蛋白表達Fig.2 Induced expression of Argonaute protein from Joostella marina1.61代表對照菌株；海蘇代表重組菌株；兩者表達條件一致1.61 represents the control strain,D represents the mutant strain,and the expression of both is consistent

表3 Jm-Argonaute對釀酒酵母BY4742成分和含量的影響Table 3 Affection of Jm-Argonaute on the composition and content of S.cerevisiae BY4742

注：a代表100 mg的干燥粉末樣品用于計算脂肪酸含量；b代表每個樣品做3組生物學(xué)平行并且數(shù)值加減誤差值(n=3)

圖3 Jm-Argonaute對釀酒酵母脂肪酸含量的影響Fig.3 Ffatty acid content in Mutant and wild S.Cerevisiae“*”代表兩組間具有顯著性差異“*”represents a significant difference between the two groups

3 討 論

釀酒酵母脂肪酸代謝涉及兩個過程：脂肪酸生物合成和分解代謝過程。其中包含不同的輔酶因子和催化酶。相關(guān)研究表明，在脂肪酸生物合成途徑中，各種飽和以及不飽和脂肪酸的形成受到不同酶的調(diào)節(jié)，例如乙酰輔酶A羧化酶、脂肪酸延長酶、脂肪酸去飽和酶等[19]。與脂肪酸合成途徑不同，脂肪酸分解代謝是釋放能量的過程，特別是β-氧化通路最為重要，但此過程也需要與脂肪酸分解相關(guān)的酶系統(tǒng)參與，如?；o酶A合成酶和肉堿?；D(zhuǎn)移酶等[20]。根據(jù)本研究結(jié)果，推測與脂肪酸代謝相關(guān)的關(guān)鍵酶基因與其調(diào)節(jié)因子可能在海蘇特氏菌Argonaute蛋白參與的小RNA基因轉(zhuǎn)錄后R 調(diào)控中受到調(diào)節(jié)，從而影響了與釀酒酵母脂肪酸代謝相關(guān)的生物通路，進一步影響了釀酒酵母脂肪酸的含量，但是具體調(diào)控機制尚不清楚。雖然一些miRNAs具有調(diào)節(jié)脂類代謝的功能[21]，但是作為小RNA調(diào)控脂肪酸代謝通路中的重要參與者，Argonaute蛋白在其中的具體功能尚不清楚，這有待于進一步實驗探究。

本研究分離純化并鑒定了海蘇特氏菌Argonaute蛋白基因，SMART軟件分析顯示其結(jié)構(gòu)域包含與細胞壽命相關(guān)SIR2結(jié)構(gòu)域[22]，這在以往的Argonaute蛋白基因研究中未被報道，SIR2結(jié)構(gòu)域的存在不僅是Argonaute蛋白基因一個新的序列，也表明本研究中得到的海蘇特氏菌Argonaute蛋白基因在進化水平上可能與以往的Argonaute蛋白基因不同，為深入研究不同生物Argonaute蛋白進化關(guān)系提供了新的信息。本研究中，重組酵母飽和脂肪酸占總脂肪酸的百分比含量與對照菌株無明顯變化，但不飽和脂肪酸的百分比含量由對照的86.4%上升至90.5%(數(shù)據(jù)中未顯示)，其中重組菌株脂肪酸C16∶1的含量與對照菌株有顯著性差異(P(T<=t)=0.013 5<0.05)，這證實海蘇特氏菌Argonaute蛋白基因可能具有調(diào)控脂肪酸碳鏈延長和去飽和的功能。實驗結(jié)果雖然表明海蘇特氏菌Argonaute蛋白基因與釀酒酵母脂肪酸代謝有關(guān)，但具體機制尚不明確。

海蘇特氏菌Argonaute蛋白基因不僅具有與長壽通路和基因沉默機制相關(guān)的SIR2結(jié)構(gòu)域，并且在釀酒酵母BY4742的脂肪酸代謝途徑中起到了提高含量的調(diào)控作用，這些發(fā)現(xiàn)可能為海洋細菌Argonaute蛋白在脂肪酸代謝中的功能提供新的研究方向,并且Argonaute蛋白可以作為一種可行的工具用來研究釀酒酵母中的RNAi通路，需要進一步探究海蘇特氏菌Argonaute蛋白對釀酒酵母BY4742脂肪酸代謝的潛在調(diào)控機制。