劉 靜，王秋英，陳 瓊，吳喜江，閆銘鋒，宣小強(qiáng)，程 寧，4

(1.蘭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，甘肅蘭州 730000;2.金川集團(tuán)有限公司職工醫(yī)院，甘肅金昌 737103;3.蘭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院流行病與衛(wèi)生統(tǒng)計(jì)學(xué)研究所，甘肅蘭州730000;4.甘肅省新藥臨床前研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州 730000)

羰基鎳是化學(xué)冶金工業(yè)生產(chǎn)中的劇毒化合物之一［1］。急性肺損傷是羰基鎳中毒的最突出表現(xiàn)［2］，肺泡上皮細(xì)胞和肺毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞是主要受損靶點(diǎn)。近年來(lái)對(duì)急性羰基鎳中毒主要采用激素、驅(qū)鎳和對(duì)癥治療，甲潑尼龍可減輕肺泡上皮及毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，減少滲出、降低毛細(xì)血管通透性和減輕炎癥反應(yīng);扎西他濱，化學(xué)名二乙基二硫代氨基甲酸鈉(sodium diethyl dithiocarbamate，DDC)是研究較多的急性羰基鎳中毒解毒劑;研究表明，亞硒酸鈉分解的Se與進(jìn)入到生物體的重金屬產(chǎn)生拮抗作用［3］;中藥也是目前探討的問(wèn)題。本研究選取了甲潑尼龍、DDC、亞硒酸鈉和中藥參附回陽(yáng)湯4種藥物，通過(guò)單細(xì)胞凝膠電泳實(shí)驗(yàn)(single cell gel electrophoresis，SCGE)、組織病理學(xué)以及細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察，評(píng)價(jià)對(duì)大鼠急性羰基鎳中毒肺組織和細(xì)胞損傷修復(fù)情況。

1 材料與方法

1.1 藥物和儀器

甲潑尼龍，輝瑞制藥比利時(shí)分公司，進(jìn)口藥品注冊(cè)證號(hào):H20060054;DDC，天津市化學(xué)試劑研究所，批號(hào):20010819;亞硒酸鈉，天津市德恩化學(xué)試劑有限公司，批號(hào):20071020;參附回陽(yáng)湯包括組分:參附注射液，四川雅安三九藥業(yè)有限公司，批號(hào):080815;丹參注射液，四川三精升和制藥有限公司，批號(hào):081109;甘草注射液，日本米諾發(fā)源制藥株式會(huì)社，批號(hào):01877。IX71-A12FL/PH型熒光顯微鏡和 H42604例置顯微鏡，日本 Olympus公司;IFM-1230型透視電子顯微鏡，日本JEOL公司。

1.2 動(dòng)物分組與給藥

SPF級(jí)SD大鼠220只，體重180～200 g，購(gòu)于西安交大基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(陜)2007-001。動(dòng)物共分為7組，正常對(duì)照組和染毒對(duì)照組各10只，其余為甲潑尼龍20 mg·kg－1，DDC 100 mg·kg－1，亞硒酸鈉10 μmol·kg－1，參附回陽(yáng)湯 0.25 ml，甲潑尼龍 20 mg·kg－1+DDC 100 mg·kg－1組，每組40只。除正常對(duì)照組其余各組大鼠靜態(tài)吸入羰基鎳250 mg·m－3染毒30 min，分別于染毒后4和30 h ip給藥，給藥后3 d和7 d取材，每小組各10只大鼠。

1.3 單細(xì)胞凝膠電泳實(shí)驗(yàn)檢測(cè)肺細(xì)胞DNA損傷

取大鼠肺組織約0.2 g，勻漿，過(guò)濾，收集細(xì)胞懸液，預(yù)冷PBS液情況和稀釋，4℃保存?zhèn)溆谩CGE檢測(cè)方法見(jiàn)文獻(xiàn)［4］，膠體調(diào)整為底膠層、細(xì)胞層低熔點(diǎn)膠層、低熔點(diǎn)膠層。選擇515～560 nm波長(zhǎng)激發(fā)光照射樣本，熒光顯微鏡觀察每個(gè)樣本，隨機(jī)選擇25個(gè)細(xì)胞拍攝，每組共計(jì)100個(gè)細(xì)胞，用CASP彗星分析軟件分別測(cè)量所選細(xì)胞的彗星尾長(zhǎng)(tail length，TL)、olive 尾矩(olive tail moment，OTM)等指標(biāo)。

1.4 大鼠肺組織病理變化觀察

將大鼠肺組織5 mm×5 mm，10%甲醛固定，脫水，常規(guī)石蠟包埋，間隔連續(xù)切片，厚5～8μm，HE染色，光鏡觀察病理組織學(xué)變化。

1.5 細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察

取大鼠肺組織2 mm×2 mm×2 mm，2.5%戊二醛固定，脫水，橡膠包埋，透視電鏡超薄切片，JEM-1230透射電鏡觀察。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 多種藥物對(duì)羰基鎳中毒大鼠細(xì)胞DNA的影響

2.1.1 多種藥物對(duì)羰基鎳中毒大鼠細(xì)胞“彗星”尾長(zhǎng)的影響

表1結(jié)果為給藥后3 d的取材結(jié)果。與正常對(duì)照組比較，甲潑尼龍4和30 h組，DDC 4 h組及甲潑尼龍+DDC 4 h組尾長(zhǎng)無(wú)明顯差異，與染毒對(duì)照組比較，甲潑尼龍、DDC、亞硒酸鈉、參附回陽(yáng)湯及甲潑尼龍+DDC組彗星尾長(zhǎng)明顯縮短(P＜0.05);提示甲潑尼龍4和30 h組，DDC 4 h組及甲潑尼龍+DDC 4 h組DNA損傷已恢復(fù)到和正常水平接近，治療作用優(yōu)于其他藥物組。甲潑尼龍及甲潑尼龍+DDC 4 h給藥尾長(zhǎng)顯著小于30 h給藥組(P＜0.05)，提示4 h給予甲潑尼龍及甲潑尼龍+DDC療效優(yōu)于30 h給藥。

表2結(jié)果為給藥后7 d的取材結(jié)果。與染毒對(duì)照組比較，甲潑尼龍組、DDC(4 h給藥)及甲潑尼龍+DDC組大鼠染毒后4 h和30 h給藥7 d的“彗星”尾長(zhǎng)顯著縮短(P＜0.05)，提示這些藥物對(duì)急性羰基鎳中毒后大鼠肺細(xì)胞DNA損傷修復(fù)均有一定作用(P＜0.05);與正常對(duì)照組比較，除甲潑尼龍4 h和30 h組及DDC 4 h組外，其余各組尾長(zhǎng)顯著增加(P＜0.05)，提示其中甲潑尼龍 4 h、30 h組和DDC 4 h取材組DNA損傷已恢復(fù)到接近正常水平，治療作用優(yōu)于其他組。其中同為7 d取材甲潑尼龍組和參附回陽(yáng)湯組4 h給藥尾長(zhǎng)明顯小于30 h(P＜0.05)，提示染毒后4 h給予甲潑尼龍和參附回陽(yáng)湯療效果優(yōu)于染毒后30 h給藥。

表1 大鼠染毒4 h和30 h后給藥3 d的彗星尾長(zhǎng)Tab.1 The comet tail length at 4 and 30 h delivery after 3 d in rats exposed

表2 大鼠染毒后4 h和30 h給藥7 d的彗星尾長(zhǎng)Tab.2 The comet tail lenght at 4 and 30 h delivery after 7 d in rats exposed

2.1.2 多種藥物不同時(shí)間給藥對(duì)羰基鎳中毒大鼠細(xì)胞“彗星”olive尾矩的影響

表3結(jié)果顯示，與染毒對(duì)照組尾矩比較，甲潑尼龍、DDC、亞硒酸鈉、參附回陽(yáng)湯及甲潑尼龍+DDC在統(tǒng)計(jì)學(xué)上均有顯著性差異(P＜0.05)，提示這些藥物對(duì)急性羰基鎳中毒后大鼠肺細(xì)胞DNA損傷修復(fù)均有一定作用;與正常組尾矩比較，甲潑尼龍、DDC、亞硒酸鈉 30 h給藥差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，提示甲潑尼龍、DDC、亞硒酸鈉使 DNA損傷已恢復(fù)正常水平水平。甲潑尼龍、參附回陽(yáng)湯和甲潑尼龍 +DDC4 h給藥尾矩小于30 h(P＜0.05)，提示4 h給予甲潑尼龍、參附回陽(yáng)湯和甲潑尼龍+DDC療效果優(yōu)于30 h給藥。

表3 大鼠染毒后4 h和30 h給藥3 d觀察的“彗星”olive尾矩Tab.3 The comet olive tail moment at 4 and 30 h delivery after 3 d in rats exposed

表4結(jié)果顯示，與染毒對(duì)照組比較，甲潑尼龍及甲潑尼龍+DDC治療后的尾矩差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，提示這兩組藥物對(duì)急性羰基鎳中毒后大鼠肺細(xì)胞DNA損傷修復(fù)均有一定作用;與正常組比較，DDC組和亞硒酸鈉組尾長(zhǎng)在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有明顯差異(P＜0.05)，提示甲潑尼龍和甲潑尼龍 +DDC組治療后DNA損傷已恢復(fù)到正常水平，療效優(yōu)于其余給藥組。甲潑尼龍4 h給藥olive尾矩小于30 h(P＜0.05)，提示4 h給予甲潑尼龍療效果優(yōu)于30 h給藥。

圖1所示急性羰基鎳中毒大鼠分別在4 h和30 h給藥后3 d和7 d取材觀察肺細(xì)胞DNA損傷修復(fù)“彗星”圖，可見(jiàn)甲潑尼龍和甲潑尼龍+DDC組“彗星”拖尾不明顯，基本接近正常組，DDC、亞硒酸鈉及參附回陽(yáng)湯組“彗星”拖尾明顯。

表4 大鼠染毒后4 h和30 h給藥7 d觀察的“彗星”O(jiān)live尾矩Tab.4 The comet olive tail moment at 4 and 30 h delivery after 7 d in rats exposed

2.2 藥物對(duì)羰基鎳中毒大鼠肺組織病理改變的影響

組織病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，羰基鎳250 mg·m－3染毒對(duì)照組主要以急性滲出性改變?yōu)橹?，伴有輕微增生性改變，表現(xiàn)為肺泡內(nèi)中度水腫，少量紅細(xì)胞及纖維素沉積，肺泡Ⅱ型上皮增生，肺泡間隔增寬并有融合性改變，部分肺泡腔內(nèi)有泡沫樣細(xì)胞及透明膜樣物(圖2A)。甲潑尼龍組肺急性損傷明顯減輕，輕度肺水腫，間隔增寬范圍減少，炎性反應(yīng)較輕(圖2B)。DDC組輕度氣腫或氣腫不明顯，小支氣管、細(xì)支氣管腔內(nèi)少量炎性滲出，間質(zhì)部分增寬，氣管間質(zhì)少量散在或小灶狀炎細(xì)胞浸潤(rùn)(圖2C);甲潑尼龍+DDC組:肺改變好于單用甲潑尼龍和DDC組，炎性反應(yīng)輕，僅呈氣管急性黏膜炎表現(xiàn)(圖2D)。

2.3 藥物對(duì)羰基鎳中毒大鼠肺細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響

超微結(jié)構(gòu)觀察如圖3所示，與染毒對(duì)照組比較甲潑尼龍4 h給藥組大部分肺泡結(jié)構(gòu)正常，肺泡Ⅱ型細(xì)胞核形態(tài)正常，胞質(zhì)內(nèi)見(jiàn)較多板層體結(jié)構(gòu)，肺泡間質(zhì)膠原纖維明顯減少，線粒體無(wú)腫脹出現(xiàn)(圖3B);甲潑尼龍30 h給藥組大部分肺泡結(jié)構(gòu)正常，肺泡壁未見(jiàn)增厚，大部分肺泡Ⅱ型細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，少部分肺泡Ⅱ型細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)線粒體輕度腫脹，板層體減少，空泡增多，局部肺泡腔見(jiàn)脫落的細(xì)胞碎屑(圖3E)，提示甲潑尼龍4 h給藥療效優(yōu)于30 h給藥;DDC 4 h給藥組大部分肺泡結(jié)構(gòu)正常，肺泡腔脫落的細(xì)胞碎屑也有所減少，但部分肺泡Ⅱ型細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)仍可見(jiàn)到線粒體腫脹，線粒體脊減少或溶解等情況(圖3C);甲潑尼龍+DDC 4 h給藥組為基本正常肺泡Ⅱ型細(xì)胞結(jié)構(gòu)(圖3D);甲潑尼龍+DDC 30 h給藥組肺泡結(jié)構(gòu)、肺泡腔、肺泡Ⅱ型細(xì)胞、肺泡壁及肺泡間質(zhì)基本恢復(fù)到正常水平(圖3F)。

圖1 大鼠羰基鎳染毒后不同時(shí)間給藥和取材肺細(xì)胞DNA“彗星”圖像.動(dòng)物分組處理見(jiàn)表1.圖中1和2為4 h給藥3 d和7 d取材;3和4為30 h給藥3 d和7 d取材;A－B:正常對(duì)照組分別為3 d和7 d取材;C－D:染毒對(duì)照組分別3 d和7 d取材;E:甲潑尼龍;F:DDC;G:亞硒酸鈉;H:參附回陽(yáng)湯;I:甲潑尼龍+DDC.Fig.1 DNA comet image of lung cells in rats exposed in carbonyl nickel were given different drugs at different times.

圖2 大鼠染毒后4 h給藥3 d取材肺組織病理改變 (×100).動(dòng)物分組及處理見(jiàn)表1.A:染毒對(duì)照組;B:甲潑尼龍;C:DDC;D:甲潑尼龍+DDC.Fig.2 Pathological changes in lung tissues in rats exposed in carbonyl nickel were given drugs at 4 h after exposure and sacrificed after 3 d.

圖3 大鼠羰基鎳染毒后4 h給藥3 d取材肺組織超微結(jié)構(gòu)表現(xiàn)(×6000).動(dòng)物分組及處理見(jiàn)表1.A:染毒對(duì)照;B:甲潑尼龍4 h給藥;C:DDC 4 h給藥;D:甲潑尼龍+DDC 4 h給藥;E:甲潑尼龍30 h給藥;F:甲潑尼龍+DDC 30 h給藥.Fig.3 Ultrastructure of lung cells in rats exposed in carbonyl nickel were given drugs at 4 h after exposure and sacrificed after 3 d.

3 討論

急性羰基鎳中毒相關(guān)治療藥物的效果有待評(píng)估，影響了急性羰基鎳中毒的臨床治療。目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者認(rèn)為糖皮質(zhì)激素可減輕肺的滲出性損害，防止或減輕急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)以及多臟器功能障礙綜合征，如Meduri等［5］研究顯示，適量、短療程的運(yùn)用甲潑尼龍對(duì)ARDS造成的肺損傷有治療作用，且可降低多臟器功能障礙綜合征發(fā)病率和患者死亡率。有研究顯示大鼠羰基鎳吸入染毒15 min后立即口服雙硫侖(戒酒硫)或DDC，結(jié)果DDC效果明顯好于雙硫侖［6］。Sunderman 等［7］用 DDC 治療50例尿鎳為100～2470 mg·L－1的中毒患者，療效均明顯，并于3周后恢復(fù)工作。Seet等［8］曾報(bào)道螯合劑DDC與雙硫侖用于治療羰基鎳中毒，雖然動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中結(jié)果良好，但因羰基鎳中毒病例稀少和中毒后不能及時(shí)診斷等限制，其作用尚待進(jìn)一步證實(shí)。我們選取甲潑尼龍、DDC、亞硒酸鈉和參附回陽(yáng)湯四類藥物，通過(guò)染毒后不同時(shí)間給藥，篩選和評(píng)估療效最佳藥物及最佳給藥時(shí)間。SCGE、組織病理學(xué)及電鏡結(jié)果均提示甲潑尼龍和甲潑尼龍+DDC兩組藥物治療效果明顯，這一結(jié)果與臨床急性羰基鎳中毒病例使用甲潑尼龍后癥狀緩解較快相符，但甲潑尼龍聯(lián)合DDC使用后，效果不如單用甲潑尼龍明顯，可能與DDC藥物加重某些臟器損傷有關(guān)［6］。

肺心病患者使用參附注射液進(jìn)行治療，患者臨床療效、血?dú)夂头喂δ苤笜?biāo)等優(yōu)于未使用該藥的患者，表明常規(guī)治療基礎(chǔ)上加參附注射液對(duì)肺心病急性發(fā)作期的治療具有較好的臨床價(jià)值［9］。本研究在參附注射液基礎(chǔ)上加入丹參、甘草配制成參附回陽(yáng)湯，觀察其對(duì)急性羰基鎳中毒大鼠肺細(xì)胞DNA損傷的修復(fù)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)使用參附回陽(yáng)湯后肺的充血反而加重，考慮與丹參活血化瘀功效和多活性成分之間存在協(xié)同、拮抗作用作用方式有關(guān)。

本研究結(jié)果提示，急性羰基鎳中毒早期使用藥物干預(yù)效果較好，為臨床治療提供了參考依據(jù)。DDC等特效解毒藥物的療效尚需繼續(xù)研究。

志謝:感謝金川公司鎳鈷工業(yè)衛(wèi)生研究所黃克英、毛曉麗、任秀芳、祁光偉、徐東偉和邱菊花在動(dòng)物飼養(yǎng)等方面幫助，感謝蘭州大學(xué)閆銘鋒、張小培、羅琴和李宇在樣本取材處理上的幫助!

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