蘭美兵，李嘯紅，江惠彩，張 宏，余永莉

(遵義醫(yī)學(xué)院珠海校區(qū)人體解剖學(xué)與組織胚胎學(xué)教研室，廣東珠海 519041)

艾葉為菊科植物艾(Artemisia argyi Levl.et Vant.)的干燥葉，具有溫經(jīng)止血、散寒止痛、外用祛濕止癢等功效，但有小毒［1］。艾葉油是從艾葉中提取出來的揮發(fā)油，既是艾葉的功效成分也是其毒性成分［2］，為臨床常用的中藥制劑。目前已報(bào)道有艾葉油急性和亞急性毒性研究［3－5］，但其是否具有遺傳毒性與胚胎毒性未見報(bào)道。為指導(dǎo)與開拓艾葉油在臨床上安全、有效、合理的應(yīng)用，尤其是為育齡期人群的安全用藥提供實(shí)驗(yàn)參考依據(jù)，本研究通過觀察胎鼠的身長、尾長、前肢芽Neubert評(píng)分及主要骨骼發(fā)育骨化點(diǎn)出現(xiàn)的數(shù)量探討艾葉油對胚胎骨骼發(fā)育的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

昆明種小鼠，普通級(jí)，由遵義醫(yī)學(xué)院珠海校區(qū)醫(yī)學(xué)動(dòng)物中心提供，其雌性體重25～30 g，雄性體重30～35 g。飼養(yǎng)條件:室溫為26～30℃，排風(fēng)扇通風(fēng)，相對濕度為70% ～80%，自由飲食，進(jìn)水。

1.2 藥品、試劑與儀器

艾葉油(珠海德信行，水蒸氣蒸餾提取，純度98%，產(chǎn)地:甘肅，批號(hào):20081127。經(jīng)氣相色譜-質(zhì)譜法分析，主要組分為桉油素 20.45%、蒿醇12.12%、樟腦 6.99%、蒿酮 5.85%、龍腦4.274%、傘花烴3.07%和側(cè)柏酮2.58%等)，環(huán)磷酰胺(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批號(hào):20070310)，花生油(金龍魚食用油有限公司，市售)，阿利新藍(lán)(上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司，批號(hào):090130)，茜素紅(天津石英鐘廠，批號(hào):971213)。其余試劑均為國產(chǎn)分析純。阿利新藍(lán)染液、茜素紅染液、胚胎骨骼透明液均參照文獻(xiàn)［6］配制。

游標(biāo)卡尺，上海恒量量具公司;電子恒溫水浴鍋，汕頭市醫(yī)學(xué)設(shè)備公司;SZ-61體視鏡，日本Olympus公司。

1.3 動(dòng)物分組

將健康小鼠按雌、雄2∶1的比例于每晚18:00時(shí)合籠，次日晨6:00～8:00時(shí)檢查陰栓，查見陰栓者定為孕0 d。選25只孕0 d小鼠隨機(jī)分為5組，每組5只。正常對照組，每只給予花生油0.4 ml;艾葉油組，根據(jù)本課題組測定的ig給予艾葉油LD50為4.11 ml·kg－1，設(shè)計(jì)艾葉油劑量分別為 1/2，1/4 和1/8LD50的量，用花生油配制艾葉油，分別為2，1和0.5 ml·kg－1。孕鼠于孕第 12 ～16 天 ig 給藥;環(huán)磷酰胺組，只于孕第13天ip環(huán)磷酰胺12.5 mg·kg－1。每天觀察孕鼠的攝食、飲水、生長等一般狀況。

1.4 胎仔身長和尾長的測量

各組孕鼠于孕第16天最后一次用藥2h后，頸椎脫臼法處死、解剖腹部、分離子宮取出胎鼠。游標(biāo)卡尺測量胎仔身長和尾長。

1.5 Neubert評(píng)分法［7］評(píng)價(jià)胎鼠前肢芽軟骨及全身主要骨骼的骨化

每窩隨機(jī)選取1/2胎鼠浸泡于80℃的水浴鍋中10 s后，用鑷和眼科剪仔細(xì)剔除皮膚與內(nèi)臟，浸入阿利新藍(lán)染液中染色48 h，隨時(shí)在體視鏡下觀察標(biāo)本中軟骨呈現(xiàn)藍(lán)色(較染色液顏色略深)時(shí)，再用自來水輕輕沖洗2～3次，再浸入茜素紅染液中36～48 h，每隔12 h左右換液1次，直到胎鼠骨骼呈清晰的紫紅色為止，用自來水輕輕沖洗2～3次。將雙染后的胎鼠放入新配制的透明液溶液中36～48 h。體視鏡下觀察胚胎軟骨呈藍(lán)色，骨骼骨化部分呈現(xiàn)紫紅色。用Neubert評(píng)分法評(píng)價(jià)胎鼠前肢芽軟骨及全身主要骨骼的骨化等發(fā)育情況。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 艾葉油對胎鼠身長和尾長的影響

表1結(jié)果顯示，與正常對照組比較，艾葉油2，1和0.5 ml·kg－1組身長和尾長無顯著性差異;陽性對照環(huán)磷酰胺 12.5 mg·kg－1組胎鼠發(fā)育遲緩，其身長和尾長顯著縮短(P＜0.05)。與陽性對照環(huán)磷酰胺組比較，艾葉油各組身長和尾長發(fā)育良好，明顯長于環(huán)磷酰胺組(P＜0.05)。說明環(huán)磷酰對胎鼠身長和尾長的發(fā)育有抑制作用，而艾葉油對胎鼠身長和尾長的發(fā)育無影響。

表1 艾葉油對胎鼠身長和尾長的影響Tab.1 Effect of volatile oil from A.argyi on body and cauda length of the embryonic mice

2.2 艾葉油對胎鼠前肢芽軟骨發(fā)育的影響

表2結(jié)果顯示，與正常對照組比較，艾葉油2，1和 0.5 ml·kg－1組小鼠胚胎前肢芽 Neubert總評(píng)分無顯著性差異。陽性對照環(huán)磷酰胺12.5 mg·kg－1組前肢芽各軟骨發(fā)育分化較差，Neubert評(píng)分較低。與陽性對照環(huán)磷酰胺組比較，艾葉油2，1和0.5 ml·kg－1組小鼠胚胎前肢芽發(fā)育分化良好，其Neubert總評(píng)分明顯高于環(huán)磷酰胺組(P＜0.05)。說明艾葉油在本實(shí)驗(yàn)條件下對胎鼠肢芽的發(fā)育分化無毒性作用。

2.3 艾葉油對胎鼠椎骨與四肢遠(yuǎn)端骨骼骨化點(diǎn)形成的影響

經(jīng)雙染后軟骨成藍(lán)色，骨化部分成紫紅色。孕第16天胎鼠的尾椎、腕骨和跖趾骨在此階段仍為軟骨，因此骨化點(diǎn)均為0。表3結(jié)果顯示，與正常對照組比較，艾葉油各組的主要骨骼發(fā)育骨化點(diǎn)出現(xiàn)的數(shù)量無顯著性差異;但各組與環(huán)磷酰胺12.5 mg·kg－1組相比較，具有顯著性差異(P＜0.05)。說明艾葉油在本實(shí)驗(yàn)條件下對胎鼠的骨骼骨化無影響。

表2 艾葉油對胎鼠前肢芽軟骨發(fā)育的影響Tab.2 Effect of volatile oil from A.argyi on differentiation of the embryonic mice forelimb buds

表3 艾葉油對胎鼠椎骨及四肢遠(yuǎn)端骨骼發(fā)育骨化點(diǎn)數(shù)的影響Tab.3 Effect of volatile oil from A.argyi on skeletal developmental ossification points of the embryonic mice vertebrae and limbs distal end

3 討論

隨著近年來中藥的不良反應(yīng)和毒性報(bào)道的增加，中藥的毒副作用得到了高度重視。胚胎毒性作為中藥不良反應(yīng)的重要方面之一，正日益受到重視。應(yīng)用各種胚胎發(fā)育毒性實(shí)驗(yàn)技術(shù)研究中藥的胚胎毒性，已成為當(dāng)前中藥毒理學(xué)研究的一個(gè)重要領(lǐng)域［8］?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究證明，艾葉油具有鎮(zhèn)咳平喘［9］、抑菌［10］、抗腫瘤［11］以及關(guān)節(jié)軟骨的保護(hù)［12］等作用，具有較高的醫(yī)藥價(jià)值，已開發(fā)出艾葉油軟膠囊、艾葉油滴丸和復(fù)方艾葉油軟膏等應(yīng)用于臨床。艾葉油是多成分的混合物，不同的產(chǎn)地，成分也有所差異［13］。本實(shí)驗(yàn)所用艾葉油的主要功效成分為桉油素、樟腦、龍腦和傘花烴等，但同時(shí)也含有毒性成分，如側(cè)柏酮。因此，研究各地的艾葉及其制劑的生殖毒性具有重要的意義。

胎鼠器官發(fā)育的關(guān)鍵期為7.5～16 d。因此，在此階段內(nèi)用藥可以了解對胎鼠器官的影響情況。骨骼畸形是評(píng)價(jià)外界化合物對機(jī)體影響的主要內(nèi)容之一。常常通過骨骼染色來觀察骨骼的發(fā)育情況。Menegola等［14］認(rèn)為，通過阿利新藍(lán)和茜素紅雙染可以較準(zhǔn)確地判斷外界物對骨骼發(fā)育的影響。將肢芽發(fā)育分化用于評(píng)價(jià)藥物對骨的發(fā)育毒性是可靠和敏感的［15］。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用艾葉油2，1 和0.5 ml·kg－1在小鼠胚胎器官發(fā)育敏感期給藥，觀察艾葉油對小鼠胚胎骨骼發(fā)育毒性和致畸作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示艾葉油 2，1 和 0.5 ml·kg－1對小鼠胚胎全身主要骨骼無發(fā)育毒性。

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