柴振海，楊 東，蔡永明，申秀萍，劉昌孝

(天津藥物研究院天津市藥代動力學(xué)與藥效動力學(xué)國家重點實驗室，天津 300193)

重組人集成干擾素 α(recombinant human consensus interferonα，rh-CINF)是深圳九先生物工程有限公司研制的具有自主知識產(chǎn)權(quán)的一種非天然存在的重組人Ⅰ型干擾素，由166個氨基酸組成，其生物活性遠高于傳統(tǒng)干擾素，臨床用于治療丙型肝炎［1－2］。在結(jié)構(gòu)上rh-CINF與Amgen公司的干擾素制劑Infergen(干復(fù)津)基本相同，都是通過對多種人源干擾素α亞型氨基酸順序的掃描分析，并通過在氨基酸順序的每一位置指定出現(xiàn)頻率最高的氨基酸而衍生出來的集成干擾素［3］。rh-CINF和Infergen的唯一區(qū)別僅為一個氨基酸的差異，即第158位氨基酸位點由亮氨酸改為纈氨酸［1］，這也是中國人干擾素與美國人干擾素唯一的一個氨基酸差異。因此，rh-CINF具有中國人自己的遺傳特性，更適合中國人使用，在我國開發(fā)該藥具有更好的臨床應(yīng)用前景。為了評價其安全性，本實驗室根據(jù)ICH S5A對生殖毒性的技術(shù)要求和ICH S6對生物技術(shù)藥物臨床前安全性評價的一般要求，選用rh-CINF的敏感動物金黃地鼠作為實驗動物模型，對rh-CINF的胚胎-胎鼠毒性進行研究，以為臨床安全用藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 藥物、試劑和儀器

rh-CINF，無色透明液體，含量 25 mg·L－1，批號:20020602，由深圳九先生物工程有限公司提供。4～8℃冰箱保存。實驗時用賦形劑配成25，7.5和1.25 mg·L－1，分 別 用 于 rh-CINF 100，30 和 5 μg·kg－1劑量組。賦形劑為無色透明液體，組成:PB 20 mmol·L－1，NaCl 0.1 mol·L－1，pH 6.8 ～ 7.2，批號:20020301，由深圳九先生物工程有限公司提供。4～8℃冰箱保存。T2000型電子天平，美國雙杰兄弟(集團)有限公司常熟雙杰測試儀器廠;PL203電子天平，梅特勒托利多儀器(上海)有限公司;游標(biāo)卡尺，陜西航空硬質(zhì)合金工具廠;實體顯微鏡，日本Olympus株式會社。

1.2 動物

妊娠第0天金黃地鼠，80只，體重92～146 g，由北京生物制品研究所動物室提供，動物合格證號:0025104，動物許可證號:京動許字(1999)第012號。飼養(yǎng)設(shè)施為天津藥物研究院屏障系統(tǒng)(實驗動物使用許可證號:津?qū)嵲O(shè)施準(zhǔn)字012號)，觀察室溫度20～25℃，光照為12 h明、12 h暗;飼料為金黃地鼠專用飼料，并每日補充新鮮的大麥芽，飲用水為生活用自來水。

1.3 劑量設(shè)計

本實驗設(shè)3個藥物組和1個賦形劑對照組。rh-CINF臨床擬用劑量為9～15μg(日用量)，按體表面積折算成金黃地鼠(按平均體重118 g計)的等效劑量為1.02 ～1.70 μg·kg－1。本實驗分別選用rh-CINF臨床擬用最高劑量的59，18和3倍即100，30 和5 μg·kg－1作為 rh-CINF 實驗劑量。

1.4 動物分組與給藥

妊娠第0天金黃地鼠80只，隨機分成賦形劑對照組，rh-CINF 5，30和100 μg·kg－1組，每組20只。在妊娠第5～14天sc給予賦形劑或rh-CINF，每天1次，給藥體積為每100 g體重0.4 ml。

1.5 動物一般情況觀察［4］

妊娠動物在給藥前每日觀察1次一般情況。在給藥期間每日觀察藥后2 h內(nèi)的一般毒性反應(yīng)。若發(fā)現(xiàn)毒性反應(yīng)，則增加觀察時間或觀察次數(shù)。一般觀察的內(nèi)容包括外觀體征、行為活動、腺體分泌、呼吸和陰道出血等。在妊娠的第0天和第5～15天稱重。

1.6 解剖檢查

1.6.1 母鼠

母鼠在妊娠第15天進行解剖檢查。檢查內(nèi)容包括腹腔、胸腔和顱腔有無積液，主要器官有無粘連，各器官的色澤、大小、形狀和表面是否正常。發(fā)現(xiàn)異常臟器時固定保存，并同時保存足夠的對照組相應(yīng)器官，供必要時進行組織病理學(xué)檢查。

1.6.2 胚胎

檢查羊水的顏色和量及胎盤的顏色和大小，然后檢查著床點數(shù)及活胎、死胎和吸收胎數(shù)量。

1.6.3 黃體計數(shù)

計數(shù)雙側(cè)卵巢上的黃體數(shù)。

1.6.4 胎鼠

胎鼠稱重并進行外觀檢查和身長、尾長測量。各窩活胎一半制成骨骼標(biāo)本，一半制成內(nèi)臟標(biāo)本，并進行內(nèi)臟和骨骼畸形檢查。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 rh-CINF對母鼠一般情況的影響

rh-CINF 100，30 和 5 μg·kg－1組及賦形劑對照組母鼠在妊娠期間(包括給藥期間)被毛光澤，精神狀態(tài)、行為活動和呼吸均正常，未發(fā)現(xiàn)分泌物增多、腹瀉、陰道出血和流產(chǎn)等現(xiàn)象，但 rh-CINF 100 μg·kg－1組孕鼠在給藥期間體重增長顯著減緩(P ＜0.01)，rh-CINF 30 μg·kg－1組孕鼠在給藥期間體重增長亦有減緩的趨勢(表1)。

2.2 rh-CINF對孕鼠生育能力的影響

在金黃地鼠受精卵著床至生產(chǎn)前sc給予rh-CINF，rh-CINF 100，30 和 5 μg·kg－1組孕鼠的黃體數(shù)、植入數(shù)、植入前丟失率及性別比例與賦形劑對照組比較無統(tǒng)計學(xué)差異(表2，表3)。rh-CINF5 μg·kg－1組孕鼠吸收胎數(shù)、死胎數(shù)、活胎數(shù)及植入后丟失率與賦形劑對照組比較無統(tǒng)計學(xué)差異;rh-CINF 30μg·kg－1組孕鼠活胎數(shù)減少、植入后丟失率增加，與賦形劑對照組比較差異顯著(P＜0.05);rh-CINF 100 μg·kg－1組孕鼠活胎數(shù)顯著減少，吸收胎數(shù)(窩)、死胎數(shù)及植入后丟失率顯著增加，與賦形劑對照組比較有顯著差異(P＜0.01)(表3)。表明rh-CINF具有一定的胚胎毒性。

表1 重組人集成干擾素α(rh-CINF)對妊娠金黃地鼠體重的影響Tab.1 Effects of recombinant human consensus interferonα(rh-CINF)on the body weight gain of golden Syrian hamsters

表2 rh-CINF對金黃地鼠黃體和植入的影響Tab.2 Effects of rh-CINF on the corpora lutea and implantation in golden Syrian hamsters

表3 rh-CINF對金黃地鼠胚胎的影響Tab.3 Effects of rh-CINF on the conceptus in golden Syrian hamsters

2.3 rh-CINF對胎鼠生長發(fā)育的影響

rh-CINF 100 μg·kg－1組胎鼠身長較短、平均胎鼠體重較輕，與賦形劑對照組比較有顯著差異(P ＜0.01);rh-CINF 30 和 5 μg·kg－1組胎鼠身長、尾長以及平均胎鼠體重及rh-CINF 100μg·kg－1組胎鼠尾長與賦形劑對照組比較無統(tǒng)計學(xué)差異。表明rh-CINF 100 μg·kg－1對胎鼠的生長發(fā)育有一定影響(表4)。

2.4 rh-CINF的致畸作用

2.4.1 rh-CINF 對胎鼠外觀的影響

在金黃地鼠妊娠第15天解剖后對胎鼠的外觀檢查中發(fā)現(xiàn)，各劑量組中均見個別胎鼠皮下出血，但給藥組皮下出血胎仔數(shù)及皮下出血窩數(shù)與賦形劑對照組比較無統(tǒng)計學(xué)差異。除胎鼠皮下出血外，在rh-CINF 100，30 和5 μg·kg－1組和賦形劑對照組中未發(fā)現(xiàn)外觀畸形或變異胎鼠(表5)。

2.4.2 rh-CINF 對胎鼠骨骼的影響

表 6檢查結(jié)果顯示，rh-CINF 100，30和 5 μg·kg－1組顱骨、頸椎、胸椎、腰椎、骶椎和四肢骨均發(fā)育良好，上枕骨骨化程度均為0級;檢查中發(fā)現(xiàn)的主要異常有胸骨發(fā)育不全、缺失和錯節(jié)及14肋，但rh-CINF 100，30和5 μg·kg－1組中胸骨發(fā)育不全、胸骨缺失、胸骨錯節(jié)及長有14肋的胎仔數(shù)與賦形劑對照組比較統(tǒng)計學(xué)差異均不顯著。

表4 rh-CINF對金黃地鼠胎鼠發(fā)育的影響Tab.4 Effects of rh-CINF on the fetus development in golden Syrian hamsters

表5 rh-CINF對金黃地鼠胎鼠外觀的影響Tab.5 Effects of rh-CINF on the fetus externals in golden Syrian hamsters

表6 rh-CINF對金黃地鼠胎鼠骨骼發(fā)育的影響Tab.6 Effects of rh-CINF on the fetus skeleton system in golden Syrian hamsters

2.4.3 rh-CINF對胎鼠內(nèi)臟的影響

胎鼠的內(nèi)臟檢查采用徒手切片法，通過對不同切面的觀察，對胎鼠的眼、鼻、腭、舌、腦、氣管、食管、脊髓、胸腺、肺、縱隔、心、胃、腸、腎、腎上腺及生殖器官等進行了系統(tǒng)的檢查。檢查結(jié)果顯示，rh-CINF 100，30和5μg·kg－1和賦形劑對照組中均未見任何內(nèi)臟異常、錯位或畸形胎鼠。

3 討論

傳統(tǒng)的小分子藥物一般都沒有種屬特異性，在進行生殖發(fā)育毒性評價時一般選用嚙齒類動物大鼠和非嚙齒類動物兔作為實驗動物模型。有些生物技術(shù)藥物也不具有種屬特異性，可以和小分子藥物一樣，使用大鼠和兔作為實驗?zāi)Ｐ瓦M行生殖發(fā)育毒性評價，但大多數(shù)生物技術(shù)藥物都具有種屬特異性，這時就必須根據(jù)具體藥物選擇合適的實驗動物模型。實驗動物模型應(yīng)該選擇能夠表達其生物學(xué)活性或能夠發(fā)揮藥理學(xué)效應(yīng)的動物種屬。rh-CINF作為生物技術(shù)藥物，具有明顯的種屬特異性，其安全性評價用實驗動物模型的選擇亦應(yīng)遵循上述原則。據(jù)文獻報道［5］，利用多個種屬的動物細胞系(大鼠、小鼠、豚鼠、兔、貓、狗和猴)進行的體外抗病毒細胞病理效應(yīng)測定結(jié)果顯示，Infergen只在來自于恒河猴和金黃地鼠的細胞系中才具有病毒保護作用。Infergen的體內(nèi)抗病毒研究也都是用猴和金黃地鼠進行的，且都顯示了明顯的抗病毒活性［5－6］。另外Infergen的生殖毒性研究也是使用恒河猴和金黃地鼠進行的［5］。因Infergen與筆者研究的rh-CINF同屬于重組人集成干擾素α，具有幾乎相同的結(jié)構(gòu)和相同的生物學(xué)活性，因此rh-CINF生殖毒性研究的實驗動物模型選用猴和金黃地鼠比較合適。

Ⅰ型干擾素在獼猴中具有高度免疫原性，妊娠獼猴在給予人源干擾素2周后即產(chǎn)生中和抗體［7］。由于獼猴的胚胎-胎鼠毒性實驗的給藥時間均在30 d或更長時間，這樣就不可避免地會在給藥后期出現(xiàn)降低藥物在母體的暴露水平和消除藥理學(xué)效應(yīng)的情況。因此，若使用猴進行胚胎-胎鼠毒性實驗，還必須調(diào)整給藥方案以分別測定妊娠敏感期不同階段給藥后藥物對胚胎-胎鼠的影響。由于金黃地鼠妊娠周期短，給藥期間不存在免疫原性問題，因此金黃地鼠是rh-CINF胚胎-胎鼠毒性實驗的一種理想和經(jīng)濟的動物模型。

使用妊娠金黃地鼠進行的rh-CINF胚胎-胎鼠毒性實驗結(jié)果表明，妊娠金黃地鼠sc給予rh-CINF 100μg·kg－1可抑制孕鼠的體重增長，并對孕鼠的胚胎有致死作用，對存活胎鼠的生長發(fā)育包括胎仔身長和體重也均有明顯影響;妊娠金黃地鼠sc給予rh-CINF 30 μg·kg－1可抑制孕鼠體重增長，并對孕鼠胚胎有致死作用，但作用弱于高劑量組，且對存活胎鼠的生長發(fā)育沒有影響。妊娠金黃地鼠sc給予rh-CINF 5 μg·kg－1對孕鼠生長、胚胎存活及胎鼠發(fā)育均沒有影響。在對胎鼠的外觀、內(nèi)臟和骨骼檢查中均未見與藥物有關(guān)的胎鼠變異或畸形。該實驗結(jié)果與FDA文件中描述的Infergen的生殖毒性實驗結(jié)果相似。5μg·kg－1可作為rh-CINF對孕鼠和胚胎-胎鼠的無可見不良反應(yīng)劑量。

干擾素類生物工程藥物一般都具有抗增殖作用［8］，這與本實驗中rh-CINF引起金黃地鼠母體體重增長緩慢是相一致的，但rh-CINF的致胚胎死亡作用和對胚胎生長的影響是否與干擾素類藥物的抗增殖作用有關(guān)，以及rh-CINF對胚胎的影響是母體介導(dǎo)的毒性反應(yīng)，還是藥物穿過胎盤屏障直接作用于胚胎，這些問題都需要進一步的研究。

胚胎致死作用和生長發(fā)育遲緩是生殖毒性的兩個重要指標(biāo)。雖然在受精卵著床至生產(chǎn)前妊娠金黃地鼠sc給予rh-CINF 5μg·kg－1(相當(dāng)于人用最大劑量的3倍)對金黃地鼠母體和胚胎均沒有明顯的影響，但更高劑量時已出現(xiàn)明顯的母體毒性、胚胎致死作用和胎鼠生長遲緩。由于物種差異和動物實驗結(jié)果外推至人類仍存在很多不確定性，因此，在沒有獲得足夠的臨床證據(jù)之前，rh-CINF和Infergen一樣，應(yīng)歸在妊娠用藥分級目錄中的C級，即妊娠或準(zhǔn)備懷孕的婦女在使用前應(yīng)被告知使用rh-CINF可能對胎兒造成的危害，并建議婦女在使用rh-CINF期間采取避孕措施。

［1］徐 冰，王淑琴，李玉環(huán)，陶佩珍.重組集成干擾素α體外抗病毒的藥效學(xué)研究［J］.山東大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版)，2006，44(8):831-833，839.

［2］Yasuda S，Miyata K.Interferon alfacon-1(Advaferon):a novel synthetic interferon for the treatment of hepatitis C，its pharmacological and clinical profile［J］.Nippon Yakurigaku Zasshi，2002，120(6):421-426.

［3］Blatt LM， Davis JM， Klein SB， Taylor MW. The biologic activity and molecular characterization of a novel synthetic interferon-alpha species，consensus interferon［J］.J Interferon Cytokine Res，1996，16(7):489-499.

［4］袁伯俊，王治喬.生殖毒性試驗［M］∥袁伯俊，王治喬.新藥臨床前安全性評價與實踐.北京:軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)出版社，1997:133-134.

［5］Fish EN， Banerjee K， Levine HL， Stebbing N.Antiherpetic effects of a human alpha interferon analog，IFN-alpha Con1，in hamsters［J］.Antimicrob Agents Chemother，1986，30(1):52-56.

［6］Gowen BB，Barnard DL，Smee DF，Wong MH，Pace AM，Jung KH，et al.Interferon alfacon-1 protects hamsters from lethal pichinde virus infection［J］.Antimicrob Agents Chemother，2005，49(6):2378-2386.

［7］Martin PL.Reproductive toxicity testing for biopharmaceuticals［M］∥Cavagnaro JA.Preclinical Safety Evaluation for Biopharmaceuticals.New York:John Wiley＆Sons，Inc.，2008:361.

［8］Gad SC，Drug Safety Evaluation［M］.New York:John Wiley ＆ Sons，Inc.，2002:416-417.