楊敬華，巫生文，劉秋芳，張立豐，齊 鳴，魯 帥，蔡 原

(中國(guó)醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院衛(wèi)生毒理學(xué)教研室，遼寧沈陽(yáng) 110001)

近十幾年來(lái)，稀土元素在我國(guó)的應(yīng)用涉及農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)和水產(chǎn)養(yǎng)殖等多個(gè)領(lǐng)域，越來(lái)越多的稀土元素進(jìn)入環(huán)境，并通過(guò)食物鏈進(jìn)入人體。稀土元素對(duì)生物體具有毒物興奮效應(yīng)作用，即低水平的稀土元素能促進(jìn)機(jī)體的生長(zhǎng)，而高水平的稀土元素對(duì)機(jī)體具有毒性作用［1］。人群調(diào)查顯示，稀土礦區(qū)兒童的智商均數(shù)和學(xué)習(xí)記憶等認(rèn)知能力明顯低下［2］。鑭屬于自然界中含量較多的輕稀土元素。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，鑭可以影響神經(jīng)行為發(fā)育以及學(xué)習(xí)記憶能力［3－4］，但其機(jī)制仍未完全闡明。海馬是腦內(nèi)與學(xué)習(xí)記憶有關(guān)的重要結(jié)構(gòu)，即刻早期基因c-fos和c-jun與學(xué)習(xí)記憶關(guān)系密切［5］。本實(shí)驗(yàn)室前期的研究已發(fā)現(xiàn)，鑭損害學(xué)習(xí)記憶的機(jī)制與海馬CA1區(qū)c-fos表達(dá)水平降低有關(guān)［6］。cAMP應(yīng)答元件結(jié)合蛋白(cAMP response element binding protein，CREB)是誘導(dǎo)即刻早期基因轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵性因素，在學(xué)習(xí)記憶中發(fā)揮重要作用［7］。CREB的Ser133位點(diǎn)磷酸化是其活化形式，鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅳ(calmodulin dependent protein kinaseⅣ，CaMKⅣ)是磷酸化CREB Ser133位點(diǎn)的重要蛋白激酶［8］。因此，觀察氯化鑭(lanthanum chloride，LaCl3)對(duì)大鼠海馬CA1區(qū)CaM活性和CaMKⅣ，CREB磷酸化以及c-jun基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)的影響，研究鑭的毒性及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑

LaCl3，分析純(國(guó)藥沈陽(yáng)化學(xué)試劑有限公司)，蛋白定量試劑盒(普利來(lái)基因技術(shù)有限公司)，RTPCR試劑盒(TaKaRa BIO)，磷酸二酯酶，環(huán)磷腺苷和蝮蛇蛇毒(Sigma)，兔抗大鼠p-CaMKⅣ抗體，兔抗大鼠p-CREB抗體，兔抗大鼠c-jun抗體和兔抗大鼠GAPDH抗體(Santa Cruz)。

1.2 儀器

GRADIENT96型PCR儀(德國(guó)，Biometra公司)、X-7電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(美國(guó)，Thermo Elemental公司)、CS150GXL型低溫高速離心機(jī)(日本，Hitachi公司)、JY96-IIN型超聲波細(xì)胞破碎機(jī)(中國(guó)，寧波新芝生物科技股份有限公司)、HH42型快速恒溫?cái)?shù)顯水箱(中國(guó)，常州國(guó)華電器有限公司)、PAC300水平電泳儀(美國(guó)，Bio-Rad Power公司)、DYY-6B型垂直電泳儀(中國(guó)，北京六一儀器廠)和IMAGER5500凝膠圖像分析系統(tǒng)(美國(guó)，Alpha公司)。

1.3 動(dòng)物分組與染毒

清潔級(jí) Wistar大鼠〔證號(hào):SYXK(遼)，2003-0013〕由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，60只，體重250～270 g，雌雄比例2∶1。正式實(shí)驗(yàn)前飼養(yǎng)7 d，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物室溫度17～23℃，相應(yīng)濕度45% ～55%，動(dòng)物飼料由實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。將40只雌性Wistar大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、LaCl30.25%、0.5% 和1.0%染毒組，然后將雌性大鼠與雄性大鼠按2∶1同籠進(jìn)行交配，次日晨發(fā)現(xiàn)陰栓或陰道分泌物鏡檢有精子者定為受孕，記為妊娠第0天。對(duì)照組孕鼠飲用蒸餾水。鑭染毒組仔鼠在斷乳前經(jīng)由吸吮母乳染鑭，斷乳后則通過(guò)自行飲用LaCl30.25%，0.5%和1.0%蒸餾水溶液染鑭1個(gè)月，然后進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)測(cè)定。每項(xiàng)指標(biāo)均從每組隨機(jī)取8只仔鼠進(jìn)行檢測(cè)。

1.4 電感耦合等離子體質(zhì)譜法［9］檢測(cè)仔鼠海馬CA1區(qū)鑭含量

仔鼠麻醉后，用生理鹽水全身灌流以消除血液的影響。取海馬CA1區(qū)組織，置于特氟綸(Teflon)管內(nèi)，加入65%硝酸2 ml和H2O21 ml，用特氟綸塞密封后置于鋼罐中。鋼罐密封后在180℃加熱4 h以消化海馬組織樣品，然后用2%(V/V)硝酸稀釋已消化的組織樣品至10 ml，采用電感耦合等離子體質(zhì)譜儀測(cè)定海馬CA1區(qū)組織樣品中的鑭含量。儀器工作參數(shù):入射功率:1200 W;反向功率:3 W;霧化氣流速:0.78 L·min－1;輔助氣流速:0.70 L·min－1;冷卻氣流速:13.0 L·min－1;樣品提升量:1.2 ml·min－1;質(zhì)量采集方式:脈沖;數(shù)據(jù)采集方式:跳峰;停留時(shí)間:10 ms;掃描次數(shù):50;分辨率:l25;每個(gè)質(zhì)量通道數(shù):3。在上述工作條件下，鑭標(biāo)準(zhǔn)系列溶液和組織樣品液依次進(jìn)入ICP-MS后，以鑭標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度和對(duì)應(yīng)信號(hào)值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出組織樣品液中鑭濃度。然后按下式計(jì)算鑭含量:組織樣品中鑭含量(μg·g－1組織)=組織樣品液鑭濃度(mg·L－1)×組織樣品液總體積(ml)×組織樣品的質(zhì)量(g)－1。

1.5 磷酸二酯酶法［10］檢測(cè)仔鼠海馬CA1區(qū)CaM活性

取海馬CA1區(qū)組織，充分勻漿，超聲波破碎細(xì)胞，20 000×g離心15 min，取上清，加入含PDE的反應(yīng)緩沖液，再加入20 mmol·L－1的環(huán)磷腺苷以啟動(dòng)反應(yīng)，轉(zhuǎn)入30℃水浴下反應(yīng)30 min。反應(yīng)到時(shí)后轉(zhuǎn)移至沸水浴中終止反應(yīng)，然后立即移至冰浴中冷卻，再加入蝮蛇蛇毒1 g·L－1，于30℃水浴中反應(yīng)，加入55%TCA終止反應(yīng)。以20 000×g離心15 min，取上清液，加入定磷試劑，在850 nm處測(cè)定吸光度值(A)。以KH2PO4標(biāo)準(zhǔn)系列溶液濃度和對(duì)應(yīng)A值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出組織樣品液中磷濃度。CaM的1個(gè)活性單位(U)是指在上述反應(yīng)條件下，每分鐘由底物生成1μmol磷。按下式計(jì)算CaM活性:組織樣品中CaM活性(U·g－1蛋白)=樣品液磷濃度(mmol·L－1)×樣品液總體積(ml)×組織蛋白含量(g)－1×?xí)r間(min)－1。

1.6 Western印跡法檢測(cè)仔鼠海馬 CA1區(qū)p-CaMKIV，p-CREB和c-jun蛋白含量

取海馬CA1區(qū)組織，提取蛋白，采用酚試劑法進(jìn)行蛋白定量。取總量相同的蛋白，在10%SDS-聚丙烯酰胺中電泳，然后將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，將膜于4℃、5%脫脂奶粉中封閉2 h，TTBS洗3次，兔抗大鼠 p-CaMKⅣ(1∶100)、p-CREB 抗體(1∶200)、c-jun 抗 體 (1∶200)或 GAPDH 抗 體(1∶1000)中4℃孵育過(guò)夜，TTBS洗3次，室溫下二抗中孵育2 h。應(yīng)用ECL顯示反應(yīng)產(chǎn)物，曝光，顯影，定影。采用圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行蛋白表達(dá)水平分析，兔抗GAPDH抗體作為內(nèi)參校正上述蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。積分吸光度 A(integrated absorbance，IA)表示海馬中蛋白的表達(dá)水平。

1.7 RT-PCR法檢測(cè)仔鼠海馬 CA1區(qū) c-jun mRNA水平

取海馬CA1區(qū)組織，提取總RNA，進(jìn)行RNA定量與純度鑒定。用TaKaRa RT-PCR Kit(AMV)的二步法進(jìn)行 RT-PCR。c-jun引物序列:上游5'-AGCAATGGGCACATCACC-3'，下游5'-TCTGCGGCTCTTCCTTCA-3'，PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度451 bp;β肌動(dòng)蛋白引物序列:上游 5'-TTTTGTGCCTTGATAGTTCGC-3'，下游5'-GAGTCCTTCTGACCCATACCC-3'，PCR 產(chǎn)物長(zhǎng)度264 bp。所得產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳，凝膠圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行灰度掃描，以c-jun條帶灰度值與β肌動(dòng)蛋白條帶灰度值的比值表示c-jun mRNA的表達(dá)水平。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 鑭染毒仔鼠海馬CA1區(qū)鑭含量

與正常對(duì)照組相比，各染毒組仔鼠海馬CA1區(qū)鑭含量顯著增高(P＜0.05)，并與鑭染毒劑量呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù) r=0.989(P ＜0.05)(表1)。

表1 染毒仔鼠海馬CA1區(qū)鑭含量Tab.1 Lanthanum contents in the hippocampal CA1 area of rat pups after lanthanum exposure

2.2 鑭對(duì)仔鼠海馬CA1區(qū)鈣調(diào)蛋白活性的影響

表2結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，鑭染毒使仔鼠海馬CA1區(qū)鈣調(diào)蛋白活性降低(P＜0.05)，并隨著染毒劑量的增加而逐漸降低，LaCl30.25%，0.5%和1.0%染毒組仔鼠海馬CA1區(qū)鈣調(diào)蛋白活性分別降低至正常對(duì)照組的 80.7%，59.9%和 30.6%(P＜0.05)，說(shuō)明鑭染毒以劑量依賴性方式下調(diào)鈣調(diào)蛋白活性。

表2 鑭對(duì)仔鼠海馬CA1區(qū)鈣調(diào)蛋白(CaM)活性的影響Tab.2 Effect of lanthanum on calmodulin(CaM)activity in the hippocampal CA1 area of rat pups

2.3 鑭對(duì)仔鼠海馬CA1區(qū)p-CaMKⅣ蛋白表達(dá)的影響

圖1結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比，LaCl30.25%，0.5%和1.0%染毒使仔鼠海馬CA1區(qū)p-CaMKⅣ蛋白表達(dá)降低，分別降低至正常對(duì)照水平的83.0%，57.4%和27.7%(P ＜0.05)，說(shuō)明鑭染毒以劑量依賴性方式下調(diào)p-CaMKⅣ蛋白表達(dá)水平。

圖1 鑭對(duì)仔鼠海馬CA1區(qū)磷酸化鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅳ(pCaMKⅣ)蛋白表達(dá)的影響.動(dòng)物處理見(jiàn)表1.1:正常對(duì)照組;2－4:LaCl3 0.25%，0.5%和1.0%組.±s，n=8.*P＜0.05，與正常對(duì)照組比較;△P ＜0.05，與 LaCl3 0.25% 組比較;#P ＜0.05，與 LaCl3 0.5%組比較.Fig.1 Effect of lanthanum on phosphorylated-calmodulin dependent protein kinaseⅣ(p-CaMKⅣ)in the hippocampal CA1 area of rat pups.

2.4 鑭對(duì)仔鼠海馬CA1區(qū)p-CREB蛋白表達(dá)的影響

圖2 結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比，LaCl30.25%，0.5%，1.0%染毒使仔鼠海馬CA1區(qū)p-CREB蛋白表達(dá)降低，分別降低了 24.4%，36.6%和 73.2%(P＜0.05)，說(shuō)明鑭染毒與 p-CREB蛋白表達(dá)下降之間具有一定的劑量-反應(yīng)關(guān)系。

圖2 鑭對(duì)仔鼠海馬CA1區(qū)磷酸化環(huán)磷酸腺苷應(yīng)答元件結(jié)合蛋白(p-CREB)蛋白表達(dá)的影響.動(dòng)物處理見(jiàn)表1.1:正常對(duì)照組;2－4:LaCl3 0.25%，0.5%和1.0%組.±s，n=8.*P＜0.05，與正常對(duì)照組比較;△P ＜0.05，與 LaCl3 0.25% 組比較;#P ＜0.05，與 LaCl3 0.5%組比較.Fig.2 Effect of lanthanum on phosphorylated-cAMP response element binding protein(p-CREB)in the hippocampal CA1 area of rat pups.

2.5 鑭對(duì)仔鼠海馬CA1區(qū)c-jun mRNA表達(dá)的影響

圖3結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比，LaCl30.25%，0.5%和1.0%染毒使仔鼠海馬CA1區(qū)c-jun mRNA表達(dá)降低，分別降低了14.8%，27.2%和76.5%(P ＜0.05)，說(shuō)明鑭與 c-jun mRNA 表達(dá)下降之間具有一定的劑量-效應(yīng)關(guān)系。

圖3 鑭對(duì)仔鼠海馬CA1區(qū)c-jun mRNA表達(dá)的影響.動(dòng)物處理見(jiàn)表1.1:正常對(duì)照組;2－4:LaCl3 0.25%，0.5%和1.0%組.xˉ±s，n=8.*P＜0.05，與正常對(duì)照組比較;△P＜0.05，與LaCl3 0.25%組比較;#P ＜0.05，與 LaCl3 0.5%組比較.Fig.3 Effect of lanthanum on c-jun mRNA in the hippocampal CA1 area of rat pups.

2.6 鑭對(duì)仔鼠海馬CA1區(qū)c-jun蛋白表達(dá)的影響

圖4 鑭對(duì)仔鼠海馬CA1區(qū)c-jun蛋白表達(dá)的影響.動(dòng)物處理見(jiàn)表1.1:正常對(duì)照組;2－4:LaCl3 0.25%，0.5%和1.0%組.xˉ±s，n=8.*P＜0.05，與正常對(duì)照組比較;△P＜0.05，與LaCl3 0.25%組比較;#P ＜0.05，與 LaCl3 0.5%組比較.Fig.4 Effect of lanthanum on c-jun protein in the hippocampal CA1 area of rat pups.

圖4 結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比，LaCl30.25%，0.5%，1.0%染毒使仔鼠海馬CA1區(qū)c-jun蛋白表達(dá)降低，分別降低了36.1%，45.9%和83.6%(P ＜0.05)，說(shuō)明鑭染毒與c-jun蛋白表達(dá)下降之間具有一定的劑量-反應(yīng)關(guān)系。

3 討論

有研究表明，REEs可進(jìn)入腦組織，并在腦組織內(nèi)長(zhǎng)期蓄積，其中鑭在腦組織中的蓄積性較強(qiáng)［11］。Feng等［12］在大鼠4周 ～6月齡期間 ig給予 LaCl30.1，2 和 40 mg·kg－1染毒，結(jié)果發(fā)現(xiàn) LaCl340 mg·kg－1染毒組大鼠的腦組織內(nèi)明顯蓄積，大腦皮質(zhì)、海馬和小腦中鑭含量分別達(dá)到0.039，0.014和0.015μg·g－1組織。本研究顯示，出生后至斷乳后 1個(gè)月期間LaCl3暴露造成鑭在大鼠海馬CA1區(qū)明顯蓄積，鑭在海馬CA1區(qū)的蓄積量與染鑭劑量呈明顯正相關(guān)。任麗寶等［13］對(duì)鑭在大鼠腦組織中吸收規(guī)律和蓄積特點(diǎn)的研究結(jié)果也顯示，大鼠腦組織中鑭含量隨其攝入量增加而逐漸增高，存在一定的量效關(guān)系。海馬是腦內(nèi)與學(xué)習(xí)記憶有關(guān)的重要結(jié)構(gòu)和關(guān)鍵部位，海馬包括CA1，CA2和CA3區(qū)和齒狀回區(qū)域，其中CA1區(qū)和學(xué)習(xí)記憶關(guān)系更為密切。因此，本研究中LaCl3大于0.25%暴露造成鑭在海馬CA1區(qū)蓄積，這可能是LaCl3影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)(尤其是海馬)結(jié)構(gòu)和功能的基礎(chǔ)。

CaM是一個(gè)廣泛存在于真核細(xì)胞生物中的多功能蛋白，它廣泛分布于腦組織中。CaM在細(xì)胞內(nèi)有兩種存在形式，一種是非活性CaM，以游離狀態(tài)存在于細(xì)胞的胞漿里;一種是活性CaM，與Ca2+和酶/蛋白結(jié)合。當(dāng)CaM與Ca2+結(jié)合時(shí)，形成Ca2+-CaM復(fù)合物，CaM構(gòu)象發(fā)生改變，暴露出肽鏈表面的疏水基團(tuán)，保證CaM與靶酶/蛋白的結(jié)合完全匹配［14］。CaM在Ca2+參與的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中起關(guān)鍵作用，而且CaM直接參與長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)的形成［15］。在本研究中，染鑭造成仔鼠海馬 CA1區(qū)CaM活性顯著降低，可見(jiàn)染鑭造成仔鼠海馬中具有生物活性的CaM水平下降，其原因可能是由于CaM是細(xì)胞內(nèi)La3+作用的靶點(diǎn)之一，La3+與Ca2+競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合于CaM，La3+與CaM的結(jié)合力強(qiáng)于Ca2+與CaM的結(jié)合力，影響 Ca2+與 CaM 的正常結(jié)合［16－18］，從而造成海馬中具有生物活性的CaM水平降低。隨著LaCl3染毒劑量的增加，仔鼠海馬CaM活性進(jìn)一步下降，其原因可能是更多的La3+與Ca2+競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合于CaM，造成具有生物活性的CaM水平進(jìn)一步降低。

CaMK包括 CaMKⅠ，CaMKⅡ，CaMKⅢ和CaMKⅣ，其活化有賴于CaM。其中CaMKⅣ又稱做CaMK Gr，主要在神經(jīng)元的細(xì)胞核中表達(dá)，它是磷酸化轉(zhuǎn)錄因子CREB的重要蛋白激酶，在突觸可塑性、學(xué)習(xí)記憶過(guò)程中發(fā)揮重要作用［19］。磷酸化對(duì)于CaMKⅣ的激活是必需的，即磷酸化的CaMKⅣ是其活化形式。在本研究中，染鑭組仔鼠海馬CA1區(qū)p-CaMKⅣ蛋白表達(dá)水平顯著低于對(duì)照水平，可見(jiàn)在LaCl3的作用下，由于仔鼠海馬CA1區(qū)CaM活性顯著降低，激活CaMKⅣ的能力下降，造成仔鼠海馬CA1區(qū)活化的CaMKⅣ(即p-CaMKⅣ)表達(dá)水平顯著減少，CaMKⅣ的生物學(xué)作用受到削弱。

CREB屬于含亮氨酸拉鏈的轉(zhuǎn)錄因子家族成員，是細(xì)胞內(nèi)多種信號(hào)通路的一種關(guān)鍵成分，具有調(diào)節(jié)包括學(xué)習(xí)記憶在內(nèi)的廣泛的生物學(xué)功能。研究表明，CREB依賴性轉(zhuǎn)錄是學(xué)習(xí)記憶和可塑性形成過(guò)程所必需的［20］。在本研究中，鑭染毒組仔鼠海馬CA1區(qū)p-CREB的表達(dá)水平顯著低于對(duì)照水平，可見(jiàn)染鑭造成仔鼠海馬CA1區(qū)CREB的磷酸化水平顯著下降。c-jun基因是即刻早期基因家族成員，CREB的Ser133位點(diǎn)磷酸化是觸發(fā)c-jun轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵所在。研究顯示，c-jun與c-fos基因的表達(dá)產(chǎn)物結(jié)合成復(fù)合物，作用于異源二聚體激活蛋白-1結(jié)合位點(diǎn)，激活編碼突觸成分、影響突觸傳遞的基因，從而較長(zhǎng)時(shí)間地改變神經(jīng)元的結(jié)構(gòu)和功能，影響突觸可塑性［21－22］。本研究顯示，鑭染毒組仔鼠海馬CA1區(qū)c-jun mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯低于正常對(duì)照組水平，c-jun蛋白表達(dá)水平的變化趨勢(shì)與其基因轉(zhuǎn)錄水平的變化一致，而且海馬CA1區(qū)c-jun mRNA和蛋白表達(dá)水平和染毒劑量之間具有一定的劑量-效應(yīng)關(guān)系，說(shuō)明鑭染毒造成海馬CA1區(qū)c-jun基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)水平降低，損害突觸可塑性，因而損害大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。

本研究表明鑭損害學(xué)習(xí)記憶能力的機(jī)制可能與鑭造成海馬CA1區(qū)CaM活性和CaMKⅣ、CREB磷酸化以及c-jun基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)水平下降有關(guān)，但鑭損害學(xué)習(xí)記憶能力的確切機(jī)制尚需進(jìn)一步探討。

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