王思華，陳小玉

(1.河南省職業(yè)病防治研究院勞動(dòng)衛(wèi)生科，河南鄭州 450052;2.鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院毒理學(xué)教研室，河南鄭州 450001)

環(huán)境雌激素是較為重要的一類內(nèi)分泌干擾物，環(huán)境雌激素樣物質(zhì)既具有其自身的化學(xué)特性，還具有雌激素樣作用，無論這些物質(zhì)雌激素樣作用的強(qiáng)弱，都能增加額外的雌激素負(fù)荷［1］。當(dāng)親代暴露于環(huán)境雌激素樣物質(zhì)，不僅對(duì)機(jī)體自身內(nèi)分泌、神經(jīng)、生殖和免疫等多系統(tǒng)造成損害，而且能夠?qū)ψ哟斐刹豢赡娴膿p害［2-6］，最近幾年引起廣泛關(guān)注。汞和鎘廣泛存在于生產(chǎn)和生活環(huán)境中，它們對(duì)人類和動(dòng)物的損害作用是否也是通過內(nèi)分泌干擾作用，而且兩者聯(lián)合是否有雌激素樣作用，目前還未有確切證據(jù)。本研究采用去卵巢大鼠子宮增重實(shí)驗(yàn)和大鼠子宮內(nèi)膜增殖實(shí)驗(yàn)探討HgCl2和CdCl2及二者聯(lián)合應(yīng)用的雌激素樣作用，為進(jìn)一步研究其生殖發(fā)育毒性作用機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

HgCl2，分析純，北京化工廠。CdCl2，分析純，中國亭生化學(xué)試劑廠。雌二醇(estradiol，E2)，Sigma公司產(chǎn)品。核仁組成區(qū)相關(guān)嗜銀蛋白 (argyrophilic nucleolar organizer region-associated proteins，Ag-NORs)銀染工作液的配制:用體積分?jǐn)?shù)為10%的甲酸配制體積分?jǐn)?shù)為2%的明膠溶液，再將明膠溶液與體積分?jǐn)?shù)為50%的硝酸銀按體積比1∶2混合即成。

868045型普通光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司)，切片機(jī)(湖北徠克醫(yī)療儀器有限公司)、電子天平(德國Sartorius公司)。

1.2 動(dòng)物和去卵巢大鼠模型的建立

成年雌性SD大鼠66只，體重210～230 g，由河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物許可證號(hào):醫(yī)動(dòng)字第410117號(hào)。飼養(yǎng)環(huán)境溫度為 18～22℃，濕度60% ～70%，晝夜周期為12 h/12 h，普通飼料飼養(yǎng)，自由飲水進(jìn)食。

將性成熟雌性SD大鼠實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)3 d后，稱重，剪毛，ip給予2%戊巴比妥鈉 2.0 ml·kg-1麻醉成功后，腹臥位固定，用碘酊消毒手術(shù)區(qū)皮膚，沿背中線切開皮膚，切口上端達(dá)最后一肋骨處，下端止骶骨。脊柱兩側(cè)切開肌層，到達(dá)腹腔，取出子宮和卵巢，分離脂肪組織，暴露輸卵管，沿輸卵管處切除卵巢，復(fù)位子宮，縫合切口，ip給予慶大霉素1 ml，防止動(dòng)物手術(shù)后感染。

去卵巢SD大鼠于手術(shù)后第3天，每只大鼠行陰道涂片，連續(xù)5 d，即用棉簽蘸少量生理鹽水，插入陰道內(nèi)輕輕旋轉(zhuǎn)兩圈，取出，在玻璃片上涂抹數(shù)次，于低倍鏡下觀察白細(xì)胞和角化上皮細(xì)胞出現(xiàn)情況，判斷卵巢摘除是否完全。連續(xù)涂片5 d，鏡下均見大量白細(xì)胞和少量黏液，未見典型的角化上皮細(xì)胞出現(xiàn)判定為卵巢摘除完全;若有大量的典型角化上皮細(xì)胞出現(xiàn)，而只有少量的白細(xì)胞出現(xiàn)判定為卵巢摘除不完全。

1.3 動(dòng)物分組及給藥

［7］將完全摘除卵巢的大鼠，于術(shù)后第8天隨機(jī)分為11組，每組6只，分別為去卵巢模型對(duì)照組(給予生理鹽水);E20.08 mg·kg-1(陽性對(duì)照組)，以花生油為溶劑;HgCl20.04，0.20 和1.00 mg·kg-1組;CdCl20.08，0.40 和2.00 mg·kg-1組，HgCl2+CdCl2(0.04+0.08)，(0.04+0.40)和(0.04+2.00)mg·kg-1，給藥容積為2.0 ml·kg-1，每天 ip 給予1 次，連續(xù)3 d。

1.4 取材和制片

最后一次給藥后24 h，稱重，頸椎脫臼處死大鼠，處死前2 h每只大鼠ip給予秋水仙堿4 mg·kg-1，使細(xì)胞分裂停滯于有絲分裂中期。迅速取出子宮，稱質(zhì)量后，于子宮中段垂直于子宮角長(zhǎng)軸朝子宮體方向切取約1 cm子宮組織，經(jīng)Bouin固定液固定，在24 h內(nèi)，用體積分?jǐn)?shù)為70%乙醇洗滌直至苦味酸的黃色消失。常規(guī)石蠟包埋，一半切片進(jìn)行常規(guī)HE染色;另一半進(jìn)行硝酸銀染色。

1.5 子宮臟器系數(shù)測(cè)定

準(zhǔn)確稱量子宮質(zhì)量(g)和體重(g)，子宮臟器系數(shù)=子宮質(zhì)量(g)/體重(g)×100。

1.6 有絲分裂指數(shù)測(cè)定

參照文獻(xiàn)［8］在油鏡下，常規(guī) HE染色的每個(gè)切片隨機(jī)選取10個(gè)視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)40個(gè)子宮內(nèi)膜腺體細(xì)胞，記錄處于有絲分裂的細(xì)胞數(shù)，按下式計(jì)算有絲分裂指數(shù)(mitotic index，MI)(%)=有絲分裂細(xì)胞數(shù)/觀察細(xì)胞數(shù)×100%。每只大鼠觀察2張切片，結(jié)果取平均值。

1.7 Ag-NORs顆粒數(shù)觀察

Ag-NORs顆粒為黑色顆粒，位于核仁中與細(xì)胞核內(nèi)(細(xì)胞核背景呈淡黃色)。在油鏡下，每個(gè)切片隨機(jī)選取10個(gè)視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)40個(gè)染色均勻、背景清晰的細(xì)胞，計(jì)數(shù)Ag-NORs顆粒數(shù)，并計(jì)算每個(gè)細(xì)胞Ag-NORs顆粒數(shù)。每只大鼠觀察2張切片，結(jié)果取平均值。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 HgCl2或Cd Cl2及二者聯(lián)合對(duì)去卵巢SD大鼠子宮的增重作用

表1結(jié)果表明，與去卵巢模型對(duì)照組比較，HgCl21.00 mg·kg-1組、CdCl22.00 mg·kg-1組及HgCl2+CdCl2(0.04+0.08)和(0.04+2.00)mg·kg-1組大鼠的子宮臟器系數(shù)明顯升高(P＜0.05);與相應(yīng)劑量 CdCl2組比較，HgCl2+CdCl2(0.04+0.08)mg·kg-1組的子宮臟器系數(shù)明顯升高(P＜0.05)。

表1 氯化汞(HgCl2)或氯化鎘(Cd Cl2)及其二者聯(lián)合對(duì)去卵巢大鼠子宮子宮臟器系數(shù)的影響Tab.1 Effect of mercury chloride(HgCl2)，chromium chloride(Cd Cl2)and their combination on the uterine organ coefficient in ovariectomized rats

2.2 HgCl2或CdCl2及二者聯(lián)合對(duì)去卵巢SD大鼠子宮內(nèi)膜細(xì)胞有絲分裂指數(shù)的影響

表2結(jié)果顯示，與去卵巢模型對(duì)照組相比，除了 CdCl20.08 mg·kg-1組外，其余各組大鼠的 MI有明顯差異(P＜0.05);與相應(yīng)劑量 CdCl2組比較，HgCl2+CdCl2(0.04+0.08)和(0.04+0.40)mg·kg-1的 MI值明顯增高(P ＜0.05)。

表2 HgCl2或Cd Cl2及二者聯(lián)合對(duì)去卵巢大鼠子宮內(nèi)膜細(xì)胞有絲分裂指數(shù)的影響Tab.2 Effect of HgCl2，CdCl2 and their combination on the mitotic index of endometrial cells in ovariectomized rats

2.3 HgCl2或CdCl2及二者聯(lián)合對(duì)去卵巢SD大鼠子宮內(nèi)膜細(xì)胞Ag-NORs顆粒數(shù)的影響

表3結(jié)果顯示，與去卵巢模型對(duì)照組相比，HgCl21.00 mg·kg-1組、CdCl22.00 mg·kg-1組及HgCl2+CdCl2(0.04+0.08)和(0.04+2.00)mg·kg-1組的去卵巢大鼠子宮內(nèi)膜Ag-NORs顆粒數(shù)有明顯增高(P＜0.05);與相應(yīng)劑量的CdCl2組比較，僅HgCl2+CdCl2(0.04+0.08)mg·kg-1組的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

3 討論

子宮增重實(shí)驗(yàn)是最早建立的檢測(cè)雌激素活性的經(jīng)典方法，目前仍被廣泛應(yīng)用。大鼠去卵巢后，當(dāng)給予其雌激素樣物質(zhì)后，能誘導(dǎo)靶細(xì)胞增殖與分化，表現(xiàn)為子宮重量增加，測(cè)定子宮重量或子宮臟器系數(shù)，就能夠反映雌激素活性和強(qiáng)度［9-10］。在去卵巢SD雌性大鼠子宮增重實(shí)驗(yàn)中，陽性對(duì)照雌二醇組子宮臟器系數(shù)明顯高于去卵巢模型對(duì)照組。HgCl2組和CdCl2組子宮臟器系數(shù)呈劑量-效應(yīng)關(guān)系，但經(jīng)單因素方差分析，僅高劑量組與去卵巢模型對(duì)照組相比，有顯著差異(P ＜ 0.05)，與申立軍等［7］和 H?fer等［11］研究結(jié)果一致，進(jìn)一步證明了HgCl2和CdCl2在高劑量時(shí)具有雌激素活性。

表3 HgCl2或CdCl2及二者聯(lián)合對(duì)去卵巢大鼠子宮內(nèi)膜細(xì)胞Ag-NORs顆粒數(shù)的影響Tab.3 Effect of HgCl2 and CdCl2 and combination on the Ag-NORs number of endometrial cells in ovariectomized rats

Soto等［12］亦認(rèn)為子宮增重實(shí)驗(yàn)所采用的子宮重量變化等指標(biāo)的敏感性不夠。為此，本研究選用去卵巢大鼠子宮內(nèi)膜增殖實(shí)驗(yàn)，根據(jù)MI的變化來判斷細(xì)胞的增殖速率、細(xì)胞周期和有絲分裂時(shí)間［8］。本研究結(jié)果顯示，與去卵巢模型對(duì)照組相比，除HgCl20.04 mg·kg-1組外，HgCl2和 CdCl2各劑量組 MI均明顯增加，且隨著染毒劑量的增加而遞增(P＜0.05)。此實(shí)驗(yàn)結(jié)果佐證了HgCl2和CdCl2具有雌激素活性。

核仁組成區(qū)(nuclear organizer region，NOR)具有嗜銀性，因此可以用膠體銀染色技術(shù)加以檢測(cè)。Ag-NORs是被硝酸銀染色的NOR區(qū)，由某些染色體上聚集的蛋白質(zhì)組成［13］(即具有轉(zhuǎn)錄活性的r-DNA區(qū)域周圍的酸性非組蛋白(B23蛋白和C23蛋白))，主要生物學(xué)功能為參與調(diào)控核糖體前RNA的轉(zhuǎn)錄、加工和裝配或調(diào)節(jié)RNA聚合酶Ⅰ亞單位，起維持RNA鏈伸展的作用，可以反映核仁結(jié)構(gòu)與功能的變化，還可以作為細(xì)胞r-DNA轉(zhuǎn)錄活性的標(biāo)志物［14］，是反映細(xì)胞增殖的良好指標(biāo)。本研究通過Ag-NORs這個(gè)敏感指標(biāo)，觀察HgCl2與CdCl2的雌激素活性。結(jié)果表明，HgCl2和 CdCl2各劑量組Ag-NORs呈劑量-效應(yīng)關(guān)系;與去卵巢模型對(duì)照組相比，高劑量HgCl2組和CdCl2組Ag-NORs有明顯差異(P＜0.05)，亦佐證了HgCl2和CdCl2在高劑量時(shí)具有雌激素活性。

去卵巢SD大鼠子宮增重實(shí)驗(yàn)和Ag-NORs顆粒數(shù)實(shí)驗(yàn)中，HgCl20.04 和 0.20 mg·kg-1未表現(xiàn)出雌激素活性，CdCl20.08 和 0.40 mg·kg-1亦未表現(xiàn)出雌激素活性。

HgCl20.04 mg·kg-1和 CdCl20.08 mg·kg-1均不能提高去卵巢SD雌性大鼠子宮臟器系數(shù)，但二者聯(lián)合作用后，能夠提高去卵巢SD雌性大鼠子宮臟器系數(shù)，與去卵巢模型對(duì)照組和CdCl2相應(yīng)劑量組相比差異顯著(P＜0.05)，說明二者聯(lián)合具有雌激素活性，提示二者能夠產(chǎn)生聯(lián)合效應(yīng)。未顯示雌激素活性劑量的HgCl2與各劑量CdCl2混合后的子宮臟器系數(shù)均比相應(yīng)劑量CdCl2組的子宮臟器系數(shù)增加，說明低劑量HgCl2能夠提高CdCl2各劑量組雌激素活性，尤其(HgCl2+CdCl2)低劑量組與相應(yīng)劑量CdCl2組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，說明未顯示雌激素活性劑量的HgCl2可使不顯示激素活性劑量CdCl2顯示雌激素活性。二者之間能夠產(chǎn)生聯(lián)合作用，可能與HgCl2和CdCl2同為二價(jià)重金屬，具有相似的作用機(jī)制和靶位點(diǎn)有關(guān)。

去卵巢子宮內(nèi)膜細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)亦表明，HgCl20.04 mg·kg-1能夠明顯提高 CdCl2各劑量組 MI值(P＜0.05)。與相應(yīng)劑量的CdCl2組比較，中、低劑量組的有明顯差異(P＜0.05)，說明HgCl2能夠增強(qiáng)CdCl2的雌激素活性，使原本未顯示雌激素活性劑量的CdCl2表現(xiàn)有雌激素活性，而高劑量CdCl2雌激素活性增加不明顯，但仍具有明顯的雌激素活性。

HgCl20.04 mg·kg-1能夠提高 CdCl2各劑量組Ag-NORs顆粒數(shù)，與相應(yīng)的CdCl2組比較，僅低劑量組的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);但與去卵巢模型對(duì)照組相比，高、低劑量組有明顯差異(P＜0.05)。同樣說明了低劑量HgCl2能夠增強(qiáng)CdCl2的雌激素活性，使原本未顯示雌激素活性劑量的CdCl2表現(xiàn)有雌激素活性劑量。

本研究中，子宮增重實(shí)驗(yàn)、子宮內(nèi)膜細(xì)胞有絲分裂指數(shù)和子宮內(nèi)膜細(xì)胞Ag-NORs顆粒數(shù)三項(xiàng)指標(biāo)結(jié)果均能證明未顯示雌激素活性劑量的HgCl2可使不顯示激素活性劑量CdCl2顯示雌激素活性，說明了二者有聯(lián)合作用。但上述三項(xiàng)結(jié)果均為HgCl2+CdCl2(0.04+0.40)mg·kg-1最低，可能由于樣本量小，需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究。

本研究提示環(huán)境雌激素之間能夠產(chǎn)生聯(lián)合作用，特別是低劑量時(shí)聯(lián)合作用更加明顯，即使是以未顯示雌激素活性的劑量混合，仍然能夠顯示出雌激素活性。事實(shí)上，在環(huán)境中HgCl2和CdCl2多以較低濃度混合存在，如單獨(dú)研究其中一種物質(zhì)在較低劑量時(shí)的雌激素樣作用，往往會(huì)發(fā)現(xiàn)它們對(duì)生物體幾乎不產(chǎn)生任何損害作用。人類在生活、生產(chǎn)中，往往同時(shí)或相繼接觸二者，當(dāng)以無雌激素樣作用劑量或低雌激素樣作用劑量混合進(jìn)入機(jī)體后，一部分經(jīng)代謝排出，但大部分能夠在體內(nèi)蓄積，產(chǎn)生聯(lián)合作用。另外，HgCl2和CdCl2具有不易降解、殘存期長(zhǎng)等特點(diǎn)，因而應(yīng)廣泛關(guān)注其危害。

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