余永莉，王傳銅，馮國(guó)紋，唐于川，趙晟珣，王 霞，蘭美兵，李嘯紅

(遵義醫(yī)學(xué)院珠海校區(qū)人體解剖與組織胚胎教研室，廣東珠海 519041)

環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide，CP)是臨床上常用的氮芥類的抗腫瘤藥物，進(jìn)入人體后在肝臟或血液中經(jīng)活化生成烷基化的代謝產(chǎn)物，進(jìn)而發(fā)揮抗腫瘤的作用，其主要的不良反應(yīng)是嚴(yán)重?fù)p傷骨髓細(xì)胞的造血功能，引起白細(xì)胞減少以及導(dǎo)致感染等嚴(yán)重后果，影響治療效果。同時(shí)它也是一種誘變劑 ，可明顯誘發(fā)骨髓細(xì)胞微核和姐妹染色單體互換，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中它常用作研究遺傳毒性和生殖毒性實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性對(duì)照組模型的造模劑。因此，尋找對(duì)于CP所致?lián)p傷具有防護(hù)作用的物質(zhì)，對(duì)于臨床上減輕使用CP進(jìn)行治療的患者的不良反應(yīng)具有重要意義。對(duì)于保護(hù)職業(yè)性接觸這種化學(xué)物質(zhì)的人群也有一定意義。

桉葉是民間常用的草藥。桉葉可提取桉葉油(eucalyptus)，主要化學(xué)成分是萜類、萜醇、醚、酮類和酯等含氧化合物［1］，氣味芳香，具有揮發(fā)性。是醫(yī)藥、香料和化學(xué)工業(yè)的重要原料，也是常用的食品添加劑。其藥理作用有抗菌［2－4］、抗氧化［5－8］、抗炎［9］、促滲［10－11］、殺蟲驅(qū)蚊［12－15］及防腐。隨著桉葉油在抑菌殺蟲方面的研究和應(yīng)用越來(lái)越深入，對(duì)于桉葉油的生物活性機(jī)制研究也引起了普遍重視。本研究用桉葉油ig給予小鼠，研究桉葉油的遺傳毒性及其對(duì)CP所致小鼠的遺傳毒性是否有保護(hù)作用，為其作為食品添加劑、香料利用，或藥品開(kāi)發(fā)提供一些遺傳毒性方面的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

昆明種小鼠購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào):SCXK(粵)2007-0002。飼養(yǎng)條件:室溫為24～27℃，通風(fēng)，相對(duì)濕度為68% ～80%，每日光照12 h，自由攝食飲水。

1.2 藥品及試劑

桉葉油(桉葉素99.5%)購(gòu)自德信行(珠海)香精香料有限公司，批號(hào)H071126。CP購(gòu)自山西普德藥業(yè)有限公司，批號(hào)08061521。

1.3 急性毒性實(shí)驗(yàn)

1.3.1 測(cè)定桉葉油對(duì)小鼠的半數(shù)致死量

小鼠50只，體重18～23 g，隨機(jī)分成5組，雌雄各半。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)各組小鼠分別ig給予桉葉油1700，1750，1800，1850 和1900 mg·kg－1。觀察并記錄2周動(dòng)物的死亡情況。利用SPSS13.0計(jì)算LD50和95%的可信區(qū)間。

1.3.2 骨髓微核實(shí)驗(yàn)測(cè)定桉葉油對(duì)小鼠微核率的影響

另取小鼠50只，體重18～23 g，隨機(jī)分成5組，每組10只，雌雄各半。其中，桉葉油400，200和100 mg·kg－1組，以及溶劑對(duì)照組(花生油0.4 ml)和陽(yáng)性對(duì)照組(CP)。桉葉油組小鼠每天ig給予1次，連續(xù)5 d。陽(yáng)性對(duì)照組于處死前2 d開(kāi)始ip給予CP 40 mg·kg－1，每天1次。各組于末次用藥2 h后脫頸椎處死，每只小鼠取其兩側(cè)股骨骨髓，按李嘯紅等［16］實(shí)驗(yàn)方法制片。細(xì)胞涂片置顯微鏡油鏡下觀察，每只小鼠骨髓涂片計(jì)數(shù)1000個(gè)骨髓嗜多染紅細(xì)胞，微核率以含微核的嗜多染紅細(xì)胞數(shù)的千分率計(jì)。每組微核率比值采用單因素方差分析，SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。

1.3.3 精子畸形實(shí)驗(yàn)測(cè)定桉葉油對(duì)小鼠精子畸形率的影響

昆明種小鼠，雄性30只，20～25 g，隨機(jī)分為5組，每組6只。各組用藥劑量同微核實(shí)驗(yàn)。受試藥物組及陰性對(duì)照組小鼠每天ig給予1次，陽(yáng)性對(duì)照組ip給予CP 40 mg·kg－1，每天1 次，連續(xù)5 d。各組小鼠于第一次給藥后35 d，脫頸椎處死，取出其雙側(cè)附睪放入盛有生理鹽水的離心管中，按胡怡秀等［17］方法制片、鏡檢。每只小鼠觀察1000個(gè)精子，記錄畸形(鐮刀形、雙尾、胖頭、無(wú)鉤和無(wú)定形等)數(shù)目并統(tǒng)計(jì)畸形率(‰)。

1.4 桉葉油的保護(hù)作用

1.4.1 小鼠骨髓微核率的測(cè)定

小鼠50只，雌雄各半，18～23 g，隨機(jī)分成5組，每組10只。其中桉葉油100，200和400 mg·kg－1組，花生油(溶劑對(duì)照)0.4 ml和 CP 40 mg·kg－1(陽(yáng)性對(duì)照)組。桉葉油組與溶劑對(duì)照組小鼠每天上午9時(shí)ig給藥，連續(xù)5 d，在處死前2 d各組與陽(yáng)性對(duì)照組一起ip給予CP 40 mg·kg－1，每天1次。第5天末次給藥2 h后脫頸椎處死小鼠取骨髓細(xì)胞涂片，進(jìn)行骨髓嗜多染紅細(xì)胞中的微核計(jì)數(shù)。

1.4.2 小鼠精子畸形率的測(cè)定

雄性昆明種小鼠，30只，體重20～25 g，隨機(jī)分為5組，每組6只。各組用藥劑量同1.4.1。桉葉油組及溶劑對(duì)照組小鼠每天ig 1次，連續(xù)10 d，第6天起與陽(yáng)性對(duì)照組一起每天ip給予CP 1次，連續(xù)5 d。各組小鼠于第一次注射CP后35 d，脫頸椎處死，取精子觀察精子畸形率。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 桉葉油急性毒性

小鼠ig給予桉葉油后，小鼠精神萎靡，活動(dòng)量少，飲食量少。但桉葉油≤1800 mg·kg－1組2～3 d后活動(dòng)、飲食恢復(fù)常態(tài)。小鼠ig給予桉葉油1700～1900 mg·kg－1后，桉葉油的 LD50為 1824.01 mg·kg－1，95%可信限為 1799.48 ～1851.19 mg·kg－1。

小鼠ig給予桉葉油400，200和100 mg·kg－15 d后，骨髓嗜多染紅細(xì)胞中的微核率分別為0，(0.1 ±0.3)‰，(0.2 ±0.6)‰，與溶劑對(duì)照組比較無(wú)顯著差異，但明顯低于陽(yáng)性對(duì)照組(17.8±4.6)‰(P＜0.05)，提示桉葉油對(duì)小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞數(shù)微核率無(wú)明顯影響。

雄小鼠 ig給予桉葉油 400，200 和 100 mg·kg－15 d后，精子畸變率分別為(3.7 ±1.6)‰，(3.5 ±1.5)‰和(6.5 ±2.5)‰，與溶劑對(duì)照組(6.8 ±2.8)‰比較無(wú)顯著性差異，但明顯低于CP(陽(yáng)性對(duì)照)組精子畸變率(67±26.4)‰(P ＜0.05)，提示桉葉油對(duì)小鼠精子畸形無(wú)明顯影響。

2.2 桉葉油對(duì)環(huán)磷酰胺致小鼠骨髓微核率及精子畸形率的影響

小鼠預(yù)先ig給予桉葉油100，200 和400 mg·kg－1，CP誘發(fā)小鼠的骨髓嗜多染紅細(xì)胞中的微核率分別為(10.7 ±4.1)‰，(7.3 ±4.3)‰，(9.0 ±2.6)‰，明顯低于陽(yáng)性對(duì)照CP誘發(fā)的微核率(18.5±5.6)‰(P＜0.05)，但花生油(溶劑組)(17.5 ±3.3)‰無(wú)此作用(表1)，提示桉葉油可降低CP誘發(fā)的小鼠骨髓微核率，花生油無(wú)此作用。

表1 桉葉油對(duì)環(huán)磷酰胺誘發(fā)骨髓嗜多染細(xì)胞微核率的影響Tab.1 Effect of eucalyptus on micronucleus of bone narrow induced by cyclophosphamide in mice

小鼠 ig給予桉葉油400，200和100 mg·kg－110 d后，CP誘發(fā)小鼠精子畸形率分別為(37.2±22.7)‰，(31.3 ±24.3)‰和(46 ±14.9)‰，明顯低于陽(yáng)性對(duì)照CP所致小鼠精子畸形率(67±26.37)‰(P ＜0.05)，但 ig 給予花生油(17.5 ±3.3)‰無(wú)此作用(表2)。提示桉葉油可降低CP致小鼠精子畸形率，花生油無(wú)此作用。

表2 桉葉油對(duì)環(huán)磷酰胺誘發(fā)精子畸形率的影響Tab.2 Effect of eucalyptus on sperm malformation rate induced by cyclophosphamide in mice

3 討論

桉葉油可以抑制炎癥早期血管通透性的增強(qiáng)，滲出和水腫，抑制前列腺素(PG)合成、釋放或其致炎作用，阻止組胺從 RBL-2H3細(xì)胞中釋放、消除氧自由基改善炎癥癥狀。通過(guò)激活紅細(xì)胞中的過(guò)氧化氫酶起到抗過(guò)氧化作用［18－19］。

隨著桉葉油研究的不斷深入，其應(yīng)用也越來(lái)越廣泛，醫(yī)藥用桉葉油主要以富含1，8-桉葉油素的精油為主 ，分離提純1，8-桉葉油素可以治療流感 、感冒、細(xì)菌性痢疾和腸炎等各種感染。在口腔醫(yī)學(xué)中可用作口腔清潔劑的除臭組分。1，8-桉葉油素還有抑制食欲的作用，用它配制的水劑和藥片，對(duì)治療食欲亢進(jìn)和減肥，有很好的效果［19－20］。桉葉油在食品中最高參考量為軟飲料含 1.7 mg·kg－1;冷飲含0.5～50 mg·kg－1;酒類含1.0 mg·kg－1;焙烤食品含76 mg·kg－1。本實(shí)驗(yàn)采取桉葉油100，200 和 400 mg·kg－1的劑量，均大于規(guī)定的范圍。且本研究結(jié)果顯示，桉葉油400 mg·kg－1ig給予小鼠5 d，小鼠的骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核率和精子畸形率與溶劑對(duì)照組比較無(wú)明顯的差異，在預(yù)實(shí)驗(yàn)中桉葉油400 mg·kg－1ig給予成年小鼠2周，小鼠的骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核率和精子畸形率與溶劑對(duì)照組比較也無(wú)明顯的差異，提示桉葉油無(wú)誘發(fā)微核和精子畸形的遺傳毒性。但預(yù)先給予桉葉油的小鼠對(duì)CP所致的骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核率和精子畸形率較未服用桉葉油組有明顯下降(P＜0.05)。提示桉葉油具有拮抗CP誘發(fā)的骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核率和精子畸形率升高的作用。桉葉油的這一作用對(duì)降低臨床用CP化療患者的藥物副作用的影響，具有一定的意義，而其確切的作用機(jī)制，尚有待進(jìn)一步研究。

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