黃新蓉,劉 劼,葉長蕓

2.湖北省黃岡市婦幼保健院,黃岡 436100;

3.傳染病預(yù)防控制國家重點實驗室,中國疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所,北京 102206

感染性腹瀉病(Infectious diarrhea diseases)是目前世界性的公共衛(wèi)生問題〔1〕,是一組由多種病原體引起的以腹瀉為主要癥狀的疾病,這些病原體包括細(xì)菌〔2〕、病毒〔3〕和寄生蟲〔4〕,成人主要以細(xì)菌性和寄生蟲性腹瀉為主,兒童主要以病毒性腹瀉為主〔5〕。目前,引起感染性腹瀉病的細(xì)菌主要有大腸桿菌屬(包括傳統(tǒng)的大腸埃希菌、志賀菌以及新近出現(xiàn)的O157 ∶H7 大腸桿菌〔6〕)、沙門氏菌屬 、霍亂弧菌 、金黃色葡萄球菌屬(產(chǎn)腸毒素型)等。長期以來,對于腹瀉患者的臨床細(xì)菌學(xué)檢測主要是分離糞便標(biāo)本中的沙門氏菌、志賀菌、霍亂弧菌等腹瀉病原菌,然而,由于大多數(shù)患者發(fā)病后很快使用抗生素,而使細(xì)菌的分離培養(yǎng)結(jié)果不理想。同時,對一些新出現(xiàn)的腹瀉病原菌可能目前還沒有成熟的方法進行分離培養(yǎng)。因此,傳統(tǒng)的糞便細(xì)菌學(xué)檢驗方法已不能滿足診治的要求。近年來,16S rDNA克隆文庫作為一種不依賴于細(xì)菌培養(yǎng)、適合于在細(xì)菌種群多樣性體系中快速篩查疑似病原菌的新技術(shù)而引人關(guān)注。

傳染病預(yù)防控制國家重點實驗室經(jīng)過反復(fù)試驗,建立了一套較完善的16S rDNA細(xì)菌學(xué)檢測技術(shù)平臺,該平臺適用于不同部位的標(biāo)本,如糞便、痰液等〔7-8〕。本研究以該技術(shù)平臺為基礎(chǔ),對某地腹瀉病暴發(fā)的病原體進行了篩查,并對篩查的結(jié)果進行了驗證?，F(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1研究對象 2006年7月,某地突然暴發(fā)100余例腹瀉病,當(dāng)時實驗室沒有檢測到明確的病原體,因此,確定本次為不明原因腹瀉病暴發(fā)。本研究共收集到12例腹瀉患者的糞便標(biāo)本,隨機抽取3例進行糞便總細(xì)菌16S rDNA檢測。3例腹瀉患者的基本資料為：1男,25歲,發(fā)病于2006年7月15日,2女,分別為46歲和 26歲,發(fā)病于2006年7月16日和18日。

1.2 方法〔7-8〕

1.2.1 標(biāo)本采集 取腹瀉患者的水樣便或膿血便10g置于30ml無菌管中,加入磷酸鹽緩沖液(pH 7.2)15ml,振蕩混勻,200 r/min離心10min,棄掉沉渣,混懸液振蕩混勻,-20℃保存。

1.2.2 核酸提取 從-20℃凍存的試管中取200μ l水樣便或膿血便,按 QIAamp DNA Stool Mini Kit說明書提取糞便中的總細(xì)菌基因組。

1.2.3 引物設(shè)計 引用文獻上常用的27F-519R引物〔9〕,引物序列為上游引物(27F)：5'-aga gtt tga tcy tgg yty ag-3',下游引物(519R)：5'-gwa tta ccg cgg ckg ctg-3',簡并堿基的含義為：y代表t或c,w代表a或t,k代表 g或t。

1.2.4 PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件：含Mg2+10×buffer 5μ L,10mmoL/l dNTPs 3μ L,正反向引物(濃度均為 10mmol/L)1μ L,混合酶(Taq：pfu=4 ∶1)5U,BSA(1mg/ml)5μ L,DNA 模板 100ng,加滅菌去離子水至總體系50μ L。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5min;95℃30s,58℃ 30s,72℃1 min,30個循環(huán);72℃10 min。

1.2.5 連接、轉(zhuǎn)化和克隆子篩選 將PCR純化產(chǎn)物與T載體16℃水浴連接16 h,轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細(xì)胞,并設(shè)空白對照和陽性對照。根據(jù)α-互補的原理進行克隆子藍(lán)白斑篩選,每份標(biāo)本隨機挑選150個左右的白色克隆接送測序公司測序。

1.2.6 序列比對與分析 將得到的有效序列在網(wǎng)上進行Blast比較,根據(jù)比對結(jié)果判定每一個序列所對應(yīng)的細(xì)菌,其判定標(biāo)準(zhǔn)為：1)取相似性(Identities)最高者;2)同一菌屬的相似性≥97%;3)當(dāng)相似性最高者為 Uncultured bacteria,但在相似性 ≥97%中存在已知菌屬時,選擇已知菌屬作為比對結(jié)果。數(shù)據(jù)庫建立和統(tǒng)計圖繪制使用SPSS 14.0。

1.2.7 糞便標(biāo)本中志賀菌的驗證 對用16S rDNA技術(shù)檢測到志賀菌屬的糞便標(biāo)本,用志賀菌的特異性毒力基因ipaH引物進行兩次PCR擴增,取第一次PCR產(chǎn)物1μ L作為第二次PCR的模板。ipaH引物序列〔10〕為上游引物(ipaHF)：5'-tgg aaa aac tca gtg cct ct-3',下游引物(ipaH R)：5'-cca gtc cgt aaa ttc att ct-3'。預(yù)期PCR產(chǎn)物大小為420bp。

1.3 主要試劑與儀器 T-easy載體購自Promega,Taq酶、pfu酶、dNTPs、JM109感受態(tài)細(xì)胞購自Takara公司,糞便核酸提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、PCR產(chǎn)物膠純化試劑盒等購自QIAGEN公司,IPTG、X-Gal購自Sigma公司。引物合成和測序均在上海生物工程有限公司進行。PCR儀為型號為PE 9600。

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)結(jié)果3例患者的糞便標(biāo)本志賀菌、沙門氏菌、霍亂弧菌、副溶血弧菌的培養(yǎng)結(jié)果均為陰性。

2.2 16S rDNA檢測結(jié)果

2.2.1 1號患者16S rDNA檢測結(jié)果共提交130條有效序列,其糞便標(biāo)本中的菌群分布如圖1所示。

2.3 志賀菌特異性毒力基因驗證結(jié)果 對以上3例標(biāo)本進行志賀菌的特異性毒力基因iapH檢測,結(jié)果見圖4。

2.4 12例腹瀉標(biāo)本中志賀菌的檢出率 用針對志賀菌的特異基因iapH的引物對其它9份腹瀉糞便標(biāo)本進行PCR檢測,共檢出6份陽性,總的檢出率為66.7%(8/12)。

3 討 論

目前,人類對腸道細(xì)菌的認(rèn)識主要來自分離培養(yǎng)〔11〕,正常人群糞便標(biāo)本的細(xì)菌數(shù)為 1012個菌細(xì)胞/g干便〔12-13〕,人的胃腸道寄居有400～500種細(xì)菌〔11〕,但約有60%～80%的胃腸道細(xì)菌是不可培養(yǎng)的〔12-13〕,因而影響了對腸道菌群的正確認(rèn)識。雖然隨著培養(yǎng)基的不斷改進和新的細(xì)菌自動鑒定儀器的使用,以及對病毒性腹瀉和寄生蟲性腹瀉病原體的認(rèn)識加深,腹瀉病原體的檢出率不斷提高,但仍有相當(dāng)部分細(xì)菌性腹瀉難以查明病因,一方面是由于標(biāo)本采集前可能已經(jīng)使用抗生素,使致病菌達(dá)不到分離培養(yǎng)的數(shù)量,另一方面可能是由于新的病原菌引起。自 1996年 Wilson KH〔14〕用 16S rDNA 基因克隆文庫的方法分析一個正常人的結(jié)腸菌群以來,有不少關(guān)于16S rDNA菌群分布的研究,但研究對象大多是健康人或慢性疾病患者〔15-16〕,如 Antonia Suau等〔17〕分析了一個健康成年男子糞便標(biāo)本的284個克隆子,發(fā)現(xiàn)了許多新的細(xì)菌核酸種類,提示了糞便標(biāo)本中細(xì)菌的多樣性和16S rDNA基因克隆檢測未知細(xì)菌的可能性。

利用16S rDNA基因克隆文庫的方法可能從種類繁多的微生物群中得到病原菌的信息提示。本研究所涉及的某地腹瀉病暴發(fā),糞便標(biāo)本采集時大多數(shù)患者都經(jīng)過2～3 d的抗生素治療,實驗室培養(yǎng)沒有檢測到明確的致病菌。在未明原因的情況下,隨機抽查3例患者進行16S rDNA基因檢測,發(fā)現(xiàn)3例患者的菌群分布基本一致,第一優(yōu)勢菌均為Ruminococcus(瘤胃菌屬),該細(xì)菌屬于腸道正常菌群,其主要作用是分解纖維素,有利于食物的消化。瘤胃菌屬成為3位腹瀉患者的第一優(yōu)勢菌群,其主要原因可能是患者使用抗生素以后,致病菌受到了抑制。在2號患者和3號患者的糞便標(biāo)本中都篩到志賀菌或大腸桿菌,志賀菌是腹瀉的致病菌,因此,16S rDNA克隆文庫篩查的結(jié)果提示志賀菌可能是導(dǎo)致某地腹瀉暴發(fā)的原因。進一步用志賀菌的特異性毒力基因ipaH進行PCR檢測,在2號患者和3號患者中均檢測到了志賀菌核酸,驗證了16S rDNA克隆文庫的篩查結(jié)果。在所有收集的12份標(biāo)本中,志賀菌檢出標(biāo)本占66.7%(8/12),因此,志賀菌可能是本次腹瀉病暴發(fā)的主要病原體。16S rDNA克隆文庫篩查結(jié)果顯示,3號標(biāo)本志賀菌在糞便細(xì)菌組成中占3.4%(5/149),2號標(biāo)本只占0.6%(1/154);志賀菌iapH基因的檢測結(jié)果顯示,在相同的PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件下,3號標(biāo)本ipaH基因的PCR條帶明顯比2號標(biāo)本的亮,說明3號標(biāo)本的志賀菌基因組在糞便總細(xì)菌基因組中所占的比例比2號標(biāo)本高,與16S rDNA克隆文庫篩查的結(jié)果一致。因此,16S rDNA基因克隆文庫的檢測結(jié)果基本能反映菌群組成的比例,經(jīng)特異性毒力基因的驗證,其篩查的結(jié)果比較可靠。

在傳統(tǒng)分類學(xué)上,志賀菌和大腸桿菌分別屬于志賀菌屬和埃希菌屬,但二者的16S rDNA序列相似性大于99%,即用16S rDNA序列分析的方法不能鑒別志賀菌和大腸桿菌,但大腸桿菌多數(shù)情況下屬于正常菌群,且缺乏ipaH毒力基因,本實驗用16S rDNA序列結(jié)合ipaH基因的方法證明在12份糞便標(biāo)本中8份存在志賀菌,排除了大腸桿菌是本次腹瀉暴發(fā)的原因。

傳染病預(yù)防控制工作多是應(yīng)對群體性事件,應(yīng)用16S rDNA克隆文庫研究暴發(fā)比散發(fā)更容易得到臨床和流行病學(xué)資料的支持,因人群中多個個體感染同一種病原體,其菌群改變具有相似性,分析起來更有規(guī)律,更易發(fā)現(xiàn)目標(biāo)病原菌;同時,相同病例多,從身體其它部位(如血液、組織等)檢測到細(xì)菌的機會增多;多種支持證據(jù)是確證病原菌的重要條件。因糞便標(biāo)本菌群組成復(fù)雜,細(xì)菌相互之間及與宿主之間關(guān)系復(fù)雜,腹瀉的原因又多種多樣,用16S rDNA基因文庫分析腸道菌群,在大海撈針般的病原菌搜索中,可起到定位和導(dǎo)航的作用,是一種較好的篩查方法。然而,該方法也受到很多因素的影響(如不同病程患者糞便中的致病菌數(shù)量不同,糞便細(xì)菌基因組的提取等),且工作量大,費用昂貴,因而實際中很難進行大樣本的操作。因此,要利用16S rDNA克隆文庫篩查及確證有菌部位標(biāo)本中的病原菌,尚需大量的經(jīng)驗和各種相關(guān)資料的支持。

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