Email：zjhzzhumd@163.com

膠體金免疫技術(shù)是一項(xiàng)繼免疫熒光、免疫酶、放射免疫三大標(biāo)記技術(shù)之后發(fā)展起來(lái)的新標(biāo)記技術(shù),已被廣泛用于醫(yī)學(xué)和生物學(xué)等諸多領(lǐng)域,如人類免疫缺陷病毒、甲胎蛋白、幽門螺桿菌、布魯氏菌病及華支睪吸蟲等檢測(cè)〔1-4〕。目前血吸蟲病免疫學(xué)診斷方法主要采用間接血凝試驗(yàn)(IHA)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA),2種方法均存在操作步驟復(fù)雜,檢測(cè)速度慢等缺點(diǎn)。為提高血吸蟲病檢測(cè)的水平和時(shí)效,我們對(duì)膠體金免疫技術(shù)快速診斷血吸蟲病作進(jìn)一步研究,現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 膠體金免疫層析法(GICA)診斷試劑 由浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院研制。將噴有質(zhì)控線、檢測(cè)線的硝酸纖維素膜切成0.4cm×6cm長(zhǎng)條,在其上端貼上吸水墊,下端貼上金標(biāo)墊及樣品吸收墊;置于塑料卡中,加干燥劑密封后室溫保存。

1.1.2 斑點(diǎn)金免疫滲濾法(DIGFA)和間接血凝試(IHA)診斷試劑 由浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院研制。

1.1.3 病人血清 采用浙江省輸入性血吸蟲病糞檢陽(yáng)性病人血清和安徽省血吸蟲病糞檢陽(yáng)性病人血清。

1.1.4 健康人血清 采用非血吸蟲病流行區(qū)山西省大同市天鎮(zhèn)縣陸家灣鎮(zhèn)健康人血清。

1.1.5 交叉血清 采用本實(shí)驗(yàn)室保留的肺血吸蟲病人、華支睪吸蟲病人和乙肝病人血清。

1.2 方法

1.2.1 GICA操作 在檢測(cè)板加樣孔內(nèi)加入待檢血清10μ L,待滲入后,加入生理鹽水 100μ L,5min后觀察結(jié)果。檢測(cè)線和質(zhì)控線均出現(xiàn)紅色為陽(yáng)性;檢測(cè)線無(wú)色,質(zhì)控線出現(xiàn)紅色為陰性。

1.2.2 DIGFA和 IHA操作 參照浙施曉華等報(bào)道〔5-6〕和血吸蟲病防治手冊(cè)〔7〕。

1.2.3 敏感性測(cè)試 檢測(cè)血吸蟲病糞檢陽(yáng)性病人血清,觀察陽(yáng)性符合率。

1.2.4 特異性測(cè)試 檢測(cè)血吸蟲病非流行區(qū)健康人血清,觀察陰性符合率。

1.2.5 交叉反應(yīng)測(cè)試 檢測(cè)肺血吸蟲病人、華支睪吸蟲病人和乙肝病人血清,觀察交叉反應(yīng)。

1.2.6 穩(wěn)定性和重現(xiàn)性試驗(yàn) 將保存于室溫下的GICA試劑,每隔3個(gè)月用同批血清測(cè)定1次,連續(xù)測(cè)定5次(1年)。每次測(cè)定病人和健康人血清。觀察試劑的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性試驗(yàn)。

1.2.7 GICA與DIGFA及IHA比較 檢測(cè)病人和健康人血清,比較3種試劑的敏感性和特異性。

1.2.8 試驗(yàn)原則與統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 樣本檢測(cè)按照單盲試驗(yàn)原則,實(shí)驗(yàn)結(jié)果由2人共同判讀。GICA、DIGFA及IHA檢測(cè)結(jié)果數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié) 果

2.1 GICA敏感性及特異性的測(cè)試 GICA檢測(cè)病人血清106份,陽(yáng)性98份,陽(yáng)性率92.5%;檢測(cè)健康人血清120份,陽(yáng)性5份,陽(yáng)性率4.2%;其敏感性和特異性分別達(dá)到92.5%和95.8%,youden指數(shù)為0.883。

2.2 GICA交叉反應(yīng)測(cè)試 GICA檢測(cè)肺吸蟲病人血清10份,陽(yáng)性3份;檢測(cè)華支睪吸蟲病人血清12份,陽(yáng)性 3份;檢測(cè)乙肝病人血清 35份均為陰性。

2.3 重現(xiàn)性試驗(yàn)和穩(wěn)定性試驗(yàn) 將保存于室溫下的GICA試劑,每隔3個(gè)月,測(cè)試1次,每次檢測(cè)病人血清30份和健康人血清30份,先后重復(fù)測(cè)試5次。結(jié)果病人血清29份陽(yáng)性,1份陰性;健康人血清,均陰性。重復(fù)檢測(cè)5次結(jié)果一致。

2.4 GICA、DIGFA及IHA 3種方法檢測(cè)血吸蟲病敏感性、特異性比較見表1。

表1 GICA、DIGFA及IHA檢測(cè)血吸蟲病敏感性、特異性比較Table 1 Cooperation of sensitivity and specificity on schistosomiasis with GICA,DIGFA and IHA

經(jīng)χ2檢驗(yàn)3種方法檢測(cè)血吸蟲病敏感性、特異性結(jié)果之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

3 討 論

目前血吸蟲病免疫學(xué)診斷主要采用間接血凝試驗(yàn)(IHA)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)方法,2種方法存在操作步驟復(fù)雜,檢測(cè)速度慢等缺點(diǎn)。金標(biāo)記技術(shù)是近年發(fā)展起來(lái)的新標(biāo)記技術(shù),國(guó)內(nèi)已有學(xué)者對(duì)金標(biāo)記技術(shù)用于血吸蟲病診斷進(jìn)行研究,已有應(yīng)用斑點(diǎn)金免疫滲濾法(DIGFA)研發(fā)了血吸蟲病診斷試劑〔5-6〕;還有對(duì)快速膠體金免疫層析法的建立及其對(duì)血吸蟲病診斷效果研究〔8〕,均取得了較理想的結(jié)果。

本研究對(duì)膠體金免疫層析快速診斷血吸蟲病試劑的敏感性、特異性和交叉反應(yīng)進(jìn)行了研究。結(jié)果顯示GICA試劑敏感性和特異性分別達(dá)到92.5%和95.8%,Youden指數(shù)為0.883;符合試劑應(yīng)用要求。GICA試劑未發(fā)現(xiàn)與乙肝病人有交叉反應(yīng);但發(fā)現(xiàn)與肺吸蟲和華支睪吸蟲病人存在較高交叉反應(yīng),可能這3種吸蟲之間存在某些共同抗原,有待于進(jìn)一步研究和改進(jìn)。

免疫診斷試劑除了要求有較高的敏感性和特異性外,還必須具有良好的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性,穩(wěn)定性和重現(xiàn)性是診斷試劑質(zhì)量的又一重要指標(biāo),也是試劑保存條件和有效期限的惟一依據(jù)。對(duì)保存于室溫下的GICA試劑,1年內(nèi)重復(fù)測(cè)試5次,結(jié)果不變。表明GICA試劑具有很好的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性,室溫保存有效期限至少1年。

GICA與DIGF和IHA 3種方法檢測(cè)血吸蟲病人和健康人血清結(jié)果比較,3種方法之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。IHA是一種傳統(tǒng)血吸蟲病免疫診斷方法,具有較高的敏感性和特異性,但其操作步驟比較復(fù)雜,使用器械多,血清用量25μ L,檢測(cè)時(shí)間性長(zhǎng)(1h),需花費(fèi)較多的人力和物力;DIGFA具有敏感性強(qiáng),特異性高優(yōu)點(diǎn),且操作簡(jiǎn)便,血清用量25μ L,檢測(cè)速度快(2min),但試劑為液體,保存期限短;膠體金免疫層析法(GICA)同樣具有試劑敏感、特異外,血清用量更少(10μ L),操作更為簡(jiǎn)便,試劑為固態(tài),攜帶方便,保存期長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn),適合于血吸蟲病流行病學(xué)調(diào)查及現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用,為血吸蟲病的防治提供一種新的手段。

〔1〕曹錫坤,陶義訓(xùn),韓松,等.滴金免疫測(cè)定法在檢測(cè)血清甲胎蛋白中的應(yīng)用〔J〕.上海免疫學(xué)雜志,1991,11(3)：154-156.

〔2〕沈麗英,干小仙,丁建祖,等.檢測(cè)幽門螺桿菌抗體的金標(biāo)免疫滲濾法的建立與應(yīng)用〔J〕.浙江實(shí)用醫(yī)學(xué),1997,2(4)：14-15.

〔3〕王鵬,郭英,石麗媛,等.鼠疫FI單克隆抗體的膠體金標(biāo)記及斑點(diǎn)滲濾法檢測(cè)FI抗原方法的建立〔J〕.中國(guó)地方學(xué)病雜志,2005,24(5)：479-481.

〔4〕朱明東,洪林娣,等.膠體金免疫層析法快速診斷布魯氏菌病的研究〔J〕.國(guó)際流行病學(xué)傳染病學(xué)雜志,2008,35(3)：158-160.

〔5〕施曉華,湯益,將健敏,等.滴金免疫測(cè)定法(DIGFA)檢測(cè)血吸蟲抗體的研究〔J〕.中國(guó)血吸蟲病防治雜志,1999,11(3)：132-133.

〔6〕沈麗英,干小仙,丁建祖,等.金標(biāo)免疫滲濾法快速檢測(cè)血吸蟲循環(huán)抗原的研究〔J〕.中國(guó)人獸共患病雜志,2000,16(1)：12-16.

〔7〕中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部疾病控制司.血吸蟲病防治手冊(cè)〔M〕.3版.上海科學(xué)技術(shù)出版社,2000：88-90.

〔8〕曾小軍,陳紅根,袁建華,等.快速膠體金免疫層析法的建立及其對(duì)血吸蟲病診斷效果〔J〕.中國(guó)血吸蟲病防治雜志,2005,17(1)：24-27.