陳韶紅,張永年,李樹清,艾 琳,陳家旭

2.上海出入境檢驗(yàn)檢疫局

近年來,隨著社會(huì)的發(fā)展,人們的膳食結(jié)構(gòu)及烹飪方式也在逐步發(fā)生變化,特別是生食和半生食方式的引入和推廣,鮮活魚類(包括蟹、螺、蛙、龜、魚)等水產(chǎn)品的攝入量較以往大大增加,使得食源性寄生蟲的人體感染率猛增。水產(chǎn)品中華支睪吸蟲和并殖吸蟲的感染度在許多地區(qū)呈上升趨勢(shì),并殖吸蟲病和華支睪吸蟲病在一些大中城市屢見暴發(fā),水產(chǎn)品中寄生蟲囊蚴的檢測(cè)已經(jīng)成為食品安全的首要問題。傳統(tǒng)檢測(cè)水產(chǎn)品中寄生蟲囊蚴的方法是用消化法解剖鏡下檢查吸蟲囊蚴〔1〕,但需要檢測(cè)人員具有豐富的鏡檢經(jīng)驗(yàn),且有操作時(shí)間長(zhǎng)、易漏檢的缺點(diǎn),本研究在傳統(tǒng)鏡檢的基礎(chǔ)上,建立了FTA法檢測(cè)水產(chǎn)品中吸蟲囊蚴的定量PCR技術(shù),為相關(guān)的監(jiān)督執(zhí)法、行政的監(jiān)督監(jiān)測(cè)等提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 水產(chǎn)品樣本 含華支睪吸蟲囊蚴的麥穗魚(采自廣西省北海市);含并殖吸蟲囊蚴的溪蟹(采自浙江省永嘉縣)、含東方次睪吸蟲囊蚴的淡水魚(采自廣西省北海市)。

1.2 主要儀器 PCR儀(美國ThermoPX2),凝膠分析成像系統(tǒng)(Bio-RAD公司Quantity on 4.6.6),低溫離心機(jī)(美國Thermo公司);直徑6mm打孔機(jī)(Whatman公司)

1.3 主要試劑

1.3.1 FTA卡(Whatman公司)

1.3.2 FTA卡洗液T E buffer(0.01 mol/L T ris-HCl,pH 8.0 0.1 mmol/L EDTA)(Whatman公司)

1.3.3 2×Taq PCR Master Mix(0.1U Taq Polymerase/L 、500 μ mol/L dNTP 、20mmol/L Tris-HCl(pH8.3)、100mmol/L KCl、3mmol/L MgCL2 、其它穩(wěn)定劑和增強(qiáng)劑)-由上海生工生物制品有限公司。

1.3.4 TAE電泳緩沖液(儲(chǔ)備液 50×)：Tris堿242g、冰醋酸 57.1mL、0.5 mol/L EDTA(pH 8.0)100 mL,用蒸餾水定容至1000 mL,混勻,室溫保存。使用時(shí)取2 mL 50×TAE電泳緩沖液,稀釋為200 mL工作液(0.5×)即可。

1.3.5 溴化乙錠、瓊脂糖、0.1 mmol/L EDTA(pH 8.0)、10 mmol/L T ris-HCl、2%胃蛋白酶 。

1.3.6 Wizard SV Genomic DNA Purification System Promega試劑盒。

1.4 引物合成

1.4.1 華支睪吸蟲囊蚴引物合成：引物由上海生工生物技術(shù)公司合成(見表1)。

1.4.2 并殖吸蟲囊蚴引物合成 由上海生工生物技術(shù)公司合成(見表2)。

1.4.3 東方次睪吸蟲囊蚴引物合成：由上海生工生物技術(shù)公司合成(見表3)。

表1 華支睪吸蟲囊蚴引物合成序列

表2 并殖吸蟲囊蚴引物合成序列

表3 東方次睪吸蟲囊蚴引物合成序列

1.5 方法

1.5.1 華支睪吸蟲囊蚴的檢測(cè)

1.5.1.1 消化法鏡檢 稱取魚肉300g,搗碎,按1∶5比例加入2%人工胃蛋白酶消化液,37℃消化過夜,用尖底量筒沉淀,取沉渣用解剖鏡鏡檢分離囊蚴。

1.5.1.2 FTA 定量PCR法 ：將1個(gè) 、3個(gè)、5個(gè) 、10個(gè)華支睪吸蟲囊蚴,分別加入含1g魚肉的試管中,每管分別加入pH 8.0緩沖液用細(xì)玻璃珠勻漿打碎,分別吸取勻漿液 20μ L滴在 FTA 卡上,自然干燥(或56℃5min)直接提取DNA,用打孔機(jī)打孔制的一張直徑6mm的濾膜片,用FTA卡洗液洗3次,每次5min,涼干后剪碎濾紙片于 PCR反應(yīng)管中,以提取的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)PCR產(chǎn)物是否有特征條帶。

PCR擴(kuò)增：總體積為 100μ L。反應(yīng)體系為DNA模板剪碎(制好的直徑6mmFTA濾膜片一片),2×Taq PCR Master Mix 50μ L;1%BSA 4μ L;10 μ mol/L 引物各 3μ L;ddH2O40μ L 。

反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3 min;94℃變性1min,62℃退火1min,72℃延伸1min,40個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度分別為315bp。

1.5.2 并殖吸蟲囊蚴的檢測(cè)

1.5.2.1 搗碎法鏡檢 收集陽性溪蟹(或喇蛄)1只,用竹筒和竹棒研磨溪蟹(或喇蛄),用100目銅篩過濾去除蟹殼后置1 000mL尖底量筒沉淀20min,沉淀物解剖鏡鏡檢分離囊蚴。

1.5.2.2 FTA定量PCR法 將分離的囊蚴分別計(jì)數(shù),分為1個(gè)、3個(gè)、5個(gè),分別加入含1g蟹肉的試管中,每管分別加入pH 8.0緩沖液用細(xì)玻璃珠勻漿打碎,分別吸取勻漿液20μ L滴在FTA卡上,自然干燥(或56℃5min)直接提取DNA,用打孔機(jī)打孔制的一張直徑6mm的濾膜片,用FTA卡洗液洗3次,每次5min,涼干后剪碎濾紙片于PCR反應(yīng)管中,以提取的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)PCR產(chǎn)物是否有特征條帶。

PCR擴(kuò)增：總體積為 100μ L。反應(yīng)體系為DNA模板剪碎(制好的直徑6mmFTA濾膜片一片),2×Taq PCR Master Mix 50μ L;1%BSA 4μ L;10 μ mol/L 引物各 3μ L;ddH2O 40μ L 。

反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性1 min;94℃變性50s,68℃退火2min,68℃延伸5 min,35個(gè)循環(huán);68℃延伸7 min。擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為560bp。

1.5.3 東方次睪吸蟲囊蚴的檢測(cè)

1.5.3.1 消化法鏡檢 稱取魚肉300g,搗碎,按1∶5比例加入2%人工胃蛋白酶消化液,37℃消化過夜,用尖底量筒沉淀,取沉渣用解剖鏡鏡檢分離。

1.5.3.2 FTA定量PCR法：將分離的囊蚴分別計(jì)數(shù),分為1個(gè)、3個(gè)、5個(gè),分別加入含1g魚肉的試管中,每管分別加入pH 8.0緩沖液用細(xì)玻璃珠勻漿打碎,分別吸取勻漿液20μ L滴在FTA卡上,自然干燥(或56℃5min)直接提取DNA,用打孔機(jī)打孔制的一張直徑6mm的濾膜片,用F TA卡洗液洗3次,每次5min,涼干后剪碎濾紙片于 PCR反應(yīng)管中,以提取的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)PCR產(chǎn)物是否有特征條帶。

PCR擴(kuò)增：總體積為 100μ L。反應(yīng)體系為DNA模板剪碎(制好的直徑6mmFTA濾膜片一片),2×Taq PCR Master Mix 50μ L;1%BSA 4μ L;10 μ mol/L 引物各 3μ L;ddH2O 40μ L 。

反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性 5 min;94℃變性30s,50℃退火30s,72℃延伸1min15s,38個(gè)循環(huán);72℃延伸5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度分別為1 500bp。

2 結(jié) 果

2.1 華支睪吸蟲囊蚴FTA定量PCR法 用華支睪吸蟲成蟲作為對(duì)照,在1g魚肉中分別加入1個(gè)、3個(gè)、5個(gè)、10個(gè)囊蚴,用試劑盒和FTA法提取囊蚴的DNA,檢測(cè)華支睪吸蟲囊蚴 ITS2基因 CS1/CS2,經(jīng)PCR擴(kuò)增,在315 bp可見明顯的顯帶,兩種方法電泳膠顯帶效果一致。

2.2 并殖吸蟲囊蚴FTA定量PCR法 用并殖吸蟲成蟲作為對(duì)照,在1g蟹肉中分別加入1個(gè)、3個(gè)、5個(gè)囊蚴,用試劑盒和FTA法提取囊蚴的DNA,檢測(cè)并殖吸蟲囊蚴ITS2基因3S'/A28,經(jīng)PCR擴(kuò)增后,在560bp可見明顯的顯帶,兩種方法電泳膠顯帶效果一致。

2.3 東方次睪吸蟲囊蚴FTA定量PCR法 在1g魚肉中分別加入1個(gè)、3個(gè)、5個(gè)東方次睪吸蟲囊蚴,用試劑盒和FTA法提取囊蚴DNA。檢測(cè)東方次睪吸蟲囊蚴ITS2基因BD1/BD2,在1 500 bp可見明顯的顯帶,經(jīng) PCR后,兩種方法電泳膠顯帶效果一致。

圖1 華支睪吸蟲囊蚴檢測(cè)2種方法的比較(試劑盒和FTA法)Fig.1 Comparison of 2 detection methods for the metacercariae of Clonorchissinensis(kit and FTA)

3 討 論

FTA技術(shù)包含一種包埋在過濾基質(zhì)中蛋白質(zhì)變性劑、螯合劑和自由基捕捉劑的特殊干燥化學(xué)試劑混合物。它對(duì)人無毒,用FTA技術(shù)收集的核酸可以在室溫和高濕度環(huán)境下保存多年而不降解。FTA卡的工作原理是樣品中感染性病原體在接觸FTA時(shí)裂解失活,病原體中的核酸則被固定下來。通過簡(jiǎn)單的一步,從卡上純化洗脫下來DNA就可以應(yīng)用于下游擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)。FTA技術(shù)具有：①節(jié)省低溫運(yùn)輸樣品以及保存樣品的低溫冰箱的成本。②使有機(jī)體快速失活,避免了操作過程中樣品污染的風(fēng)險(xiǎn)。③處理樣品、分離得到DNA僅需15～30min,縮短、減少分離步驟(4～16h)。④樣品處理只需一個(gè)簡(jiǎn)單的洗脫DNA的過程,省去了使用純化試劑盒的花費(fèi)。⑤樣品需求量最小化(每個(gè)樣品采集區(qū)12～40μ L)因此,可廣泛的用于病毒、微生物、寄生原蟲等生物DNA的提取。

傳統(tǒng)檢測(cè)水產(chǎn)品中寄生蟲囊蚴的方法是,用消化法在解剖鏡下檢查吸蟲囊蚴,但需要檢測(cè)人員具有豐富的鏡檢經(jīng)驗(yàn)、且有易漏檢的缺點(diǎn)。Blair等〔2〕通過檢測(cè)并殖吸蟲的ITS2和CO1基因的研究分析并殖吸蟲的分類地位,錢寶珍等按 Sugiyama〔3-4〕方法提取囊蚴的DNA,應(yīng)用隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)DNA(PCR-RAPD)技術(shù)檢測(cè)并殖吸蟲囊蚴分析生物種群間的分子標(biāo)記,Boris等〔5〕用試劑盒提取螺體中尾蚴和魚中華支睪吸蟲囊蚴的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增,都認(rèn)為核酸技術(shù)檢測(cè)吸蟲囊蚴具有高度的敏感性和特異性。但是Sugiyama和試劑盒提取DNA方法都有步驟較繁瑣、時(shí)間較長(zhǎng)的缺點(diǎn)。隨著FTA技術(shù)的出現(xiàn),使得檢測(cè)時(shí)間大大的縮短。

東方次睪吸蟲常與華支睪吸蟲同時(shí)寄生于魚體內(nèi),形態(tài)學(xué)的鑒定需要有豐富的鏡下工作經(jīng)驗(yàn),?？赡艹霈F(xiàn)誤判。因此,作者首次將FTA技術(shù)應(yīng)用于水產(chǎn)品中吸蟲囊蚴的檢測(cè),根據(jù)華支睪吸蟲囊蚴ITS2基因CS1/CS2、并殖吸蟲囊蚴ITS2基因3S/A28和東方次睪吸蟲囊蚴ITS2基因BD1/BD2,把這3種吸蟲囊蚴通過核酸檢測(cè)技術(shù)分別鑒定出來,解決了水產(chǎn)品在囊蚴低感染度的情況下,3種不同的吸蟲具有完全不同的條帶顯示位置,達(dá)到能檢測(cè)到每克樣品中1個(gè)囊蚴水平,從而達(dá)到快速、準(zhǔn)確檢測(cè)水產(chǎn)品中囊蚴,適用于食品衛(wèi)生檢驗(yàn)檢疫。

〔1〕李朝品.人體寄生蟲學(xué)實(shí)驗(yàn)研究技術(shù)〔M〕.北京：人民衛(wèi)生出版社,2007,225-230.

〔2〕Blair D,Agatsuma T,Watanobe T,et al.Geographical genetic structure within the human lung fluke,Paragonimus westermani,detected from DNA sequences〔J〕.Parasitology,1997,115(Pt4)：411-417.

〔3〕Sugiy ama H,Morishima Y,Kameoka Y,et al.Polymerase chain reaction(PCR)-based molecular discrimination betweenParagonimus westermaniandP.miy azakiiat the metacercarial stage〔J〕.M ol Cell Probes,2002,16(3)：231-236.

〔4〕錢寶珍,沈琦.浙江省衛(wèi)氏并殖吸蟲致病品系 PCR-RAPD分子標(biāo)記的初步研究〔J〕.中國人獸共患病學(xué)報(bào),2006,22(3)：249-252.

〔5〕Müller B,Schmidt J,M ehlhorn H.Sensitive and species-specific detection ofClonorchissinensisby PCR in infected snails and fishes〔J〕.Parasitol Res,2007,100(4)：911-914.