FMD是由口蹄疫病毒(FMDV)引起的偶蹄動(dòng)物的一種急性高度傳染性疫病,被國際獸疫局列為A類動(dòng)物傳染病之首。在自然狀態(tài)下FMDV可經(jīng)消化道入侵感染,但呼吸道是最主要的 感染途徑,數(shù)個(gè)感染性病毒顆粒即可引起易感動(dòng)物發(fā)病。動(dòng)物、人員及運(yùn)輸工具等均可機(jī)械性的散播病毒〔1〕。幼畜感染本病(以仔豬較多見)往往伴有心肌炎,心肌外呈現(xiàn)黃色條紋斑,心外膜有不同水平的出血點(diǎn),呈現(xiàn)典型的“虎斑心”癥狀〔2〕,死亡率極高。文獻(xiàn)對(duì)口蹄疫致幼畜心肌炎,早有描述,但其致病機(jī)理未見報(bào)道。

口蹄疫病毒對(duì)牛舌上皮、犢牛腎、犢牛甲狀腺、仔豬腎、豚鼠腎、倉鼠腎、仔兔腎原代細(xì)胞和仔豬腎、敘利亞倉鼠腎傳代細(xì)胞系(BHK21)都較敏感可以產(chǎn)生典型的致細(xì)胞病變(CPE)〔1〕。雖然口蹄疫病毒可以致仔豬等幼畜的心肌炎,但口蹄疫病毒是否感染心肌細(xì)胞還未見報(bào)道。

本試驗(yàn)參考 Simpson〔3〕等人大鼠心肌原代細(xì)胞培養(yǎng)方法和國內(nèi)文獻(xiàn)〔4-7〕,建立仔豬心肌原代細(xì)胞培養(yǎng)方法。然后用O型口蹄疫病毒接種心肌原代細(xì)胞來研究其對(duì)口蹄疫病毒的敏感性。為進(jìn)一步研究口蹄疫誘發(fā)幼畜心肌炎的致病機(jī)理提供細(xì)胞模型和試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康無FMDV感染的1 d長白仔豬購自蘭州種豬場(chǎng)。

1.2 細(xì)胞株和病毒 BHK21細(xì)胞株,口蹄疫O型乳鼠適應(yīng)毒MF6(o/China/99)為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.3 主要試劑及儀器設(shè)備 CMM 6201心肌專用培養(yǎng)基、DMEM(高糖)、胰蛋白酶和II型膠原酶購自Gibco公司;胎盤藍(lán);5-溴脫氧核苷(5-Bromodeoxyuridine;Brdu)購自Sigma公司,其余試劑均為國產(chǎn)分析純。CO2培養(yǎng)箱購自德國Heraeus公司;倒置光學(xué)顯微鏡購自德國Laica公司。

1.4 仔豬心肌原代細(xì)胞的培養(yǎng) 將出生后1 d仔豬,用0.1%的新潔爾滅全身消毒后,迅速前腔靜脈放血處死,解剖仔豬,無菌條件下剪取心室組織,用pH7.2的冰PBS液清洗干凈后剔除纖維結(jié)締組織,將組織反復(fù)剪成1～3 mm的小塊。加入3～4mL 1∶1混合的2 g/L的胰蛋白酶和1 g/L的膠原酶,置37℃水浴中消化10 min后,自然沉淀,用吸管吸取(棄去)上清液(主要為紅細(xì)胞、細(xì)胞碎屑及死細(xì)胞)。再加入3～4 mL的2 g/L胰蛋白酶和1 g/L膠原酶,置37℃水浴中消化15 min后,再混懸10 s,自然沉降。將上清液移入另一支無菌離心管中,并加入2 mL含有15%(10%～20%)小牛血清的培養(yǎng)液(或冷PBS液)以終止消化。如此反復(fù)消化3～8次,至組織塊完全消化為止。將各次消化所制成的細(xì)胞懸液集中混勻。用200目的不銹鋼過濾篩過濾后收集到離心管,2 000 r/min離心10 min后,用10%胎牛血清的CMM培養(yǎng)液重懸細(xì)胞,用計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞,以5×105/mL的濃度每瓶(75 mL細(xì)胞瓶)加入 10 mL,放入37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.5 心肌細(xì)胞形態(tài)觀察 常規(guī)倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化、用相差顯微鏡觀察心肌細(xì)胞搏動(dòng)情況。

1.6 細(xì)胞成活率的測(cè)定 選用胎盤藍(lán)染色法進(jìn)行細(xì)胞存活率測(cè)定,死亡細(xì)胞被染成淡藍(lán)色,活細(xì)胞拒染呈陰性反應(yīng)。取細(xì)胞懸液,按9∶1加入0.4%臺(tái)盼籃溶液混勻,在倒置顯微鏡下,任選10個(gè)視野,每次計(jì)數(shù)100個(gè)心肌細(xì)胞,計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.7 O型口蹄疫乳鼠毒對(duì)仔豬細(xì)胞敏感性 口蹄疫O型乳鼠毒MF6(O/China/99)接種鋪滿單層的仔豬原代心肌細(xì)胞,設(shè)對(duì)照一瓶。每瓶(75mL細(xì)胞瓶)接種1mL。37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)感作1 h,加DMEM 維持液9 mL。然后放37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)觀察。

1.8 心肌原代細(xì)胞毒毒價(jià)測(cè)定 用本室研制的間接紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)試劑盒和夾心ELISA試劑盒檢測(cè)細(xì)胞毒型別。同時(shí)將原代細(xì)胞病毒液和BHK21細(xì)胞病毒液用DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液按10倍系列稀釋至 10-7,取 10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-76個(gè)稀釋度,用 96孔板,微量法測(cè)定細(xì)胞毒價(jià),用Reed-Muench法計(jì)算 TCID50。

2 結(jié) 果

2.1 長白仔豬心臟細(xì)胞原代細(xì)胞的分離培養(yǎng)及純化結(jié)果 用倒置顯微鏡觀察原代心肌細(xì)胞,在未貼壁時(shí)呈圓形,貼壁后生長逐漸呈三角形(較多)、梭形、多角形,多形性、胞核1～2個(gè)、具有1～2清晰的核仁,細(xì)胞形態(tài)完整,生長迅速,部分單個(gè)細(xì)胞自行蠕動(dòng),當(dāng)生長成片后可見呈島嶼狀搏動(dòng),見圖1、2。

2.2 細(xì)胞成活率測(cè)定 計(jì)數(shù)10個(gè)視野內(nèi)共1 000個(gè)心肌細(xì)胞,44個(gè)細(xì)胞染色陽性,成活率為95.6%。

2.3 口蹄疫O型乳鼠毒對(duì)仔豬心肌原代細(xì)胞敏感性試驗(yàn) 用長白仔豬原代心肌細(xì)胞接口蹄疫O型乳鼠毒MF6(O/China/99),并進(jìn)行傳代 。從第二代起可以觀察到明顯的細(xì)胞病變(CPE)且隨著傳代次數(shù)的增加病變時(shí)間和收毒時(shí)間縮短。傳至第6代收毒時(shí)間在20 h左右,14 h出現(xiàn)典型的致細(xì)胞病變(CPE),見圖3～4。由此可見,本試驗(yàn)所培養(yǎng)的仔豬心肌原代細(xì)胞可以作為研究口蹄疫致仔豬心肌炎的細(xì)胞模型。

2.4 原代細(xì)胞毒型別和TCID50結(jié)果 用間接紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)和夾心ELISA試驗(yàn)對(duì)上述傳代細(xì)胞毒進(jìn)行口蹄疫型別測(cè)定,所有病變良好的細(xì)胞毒均與所接種的病毒在口蹄疫病毒型上一致。第五、第六代長白仔豬原代細(xì)胞毒毒價(jià)(lgTCLD50/ml)分別為3.75、4.33;第五、第六代BHK21細(xì)胞毒毒價(jià)(lgTCLD50/ml)分別為 4.00、4.83。

結(jié)果顯示原代細(xì)胞毒的病毒毒價(jià)略低于平行傳代的BHK21細(xì)胞毒。說明長白豬原代心肌細(xì)胞對(duì)口蹄疫的敏感性和BHK21細(xì)胞無差異。

3 討 論

1955年,Cavanough對(duì)雞胚心肌細(xì)胞進(jìn)行分離和保存;1960年,Harary和Farley首次培養(yǎng)出Wistar乳鼠的心肌細(xì)胞,并維持其自發(fā)性節(jié)律搏動(dòng)40d;1977年,Jacobson首次成功培養(yǎng)出成熟心肌細(xì)胞;1982年,Piper等又建立了另一種成熟心肌細(xì)胞培養(yǎng)模型〔8-9〕。但有關(guān)仔豬心肌原代細(xì)胞培養(yǎng)的研究國內(nèi)外報(bào)道很少,而用仔豬心肌細(xì)胞進(jìn)行口蹄疫病毒敏感性的研究更是未見報(bào)道。

體外培養(yǎng)的心肌細(xì)胞能夠保持其在體內(nèi)原有的許多結(jié)構(gòu)和功能,同時(shí)排除了神經(jīng)、體液等因素的干擾,因此體外培養(yǎng)在心肌細(xì)胞的生長、發(fā)育、生理、代謝、病理等研究中具有重要意義。同時(shí),體外培養(yǎng)的心肌原代細(xì)胞較為純凈,進(jìn)行病毒感染試驗(yàn)所得到的試驗(yàn)數(shù)據(jù)較為真實(shí),避免了機(jī)體因感染其他病原而得到其他不一致的結(jié)果。同時(shí)用體外細(xì)胞模型試驗(yàn),可以使試驗(yàn)過程容易重復(fù)。

通常認(rèn)為,成熟的心肌細(xì)胞是終末分化型細(xì)胞,不具備有絲分裂能力。成年動(dòng)物心肌細(xì)胞中約有15%～20%較年輕的心肌細(xì)胞,保留著增殖的能力。但心肌細(xì)胞增殖潛能的大小尚未知曉,缺乏形態(tài)學(xué)和生物學(xué)資料。由于各實(shí)驗(yàn)室所需要解決的問題、實(shí)驗(yàn)材料的取舍、實(shí)驗(yàn)室具體條件不同等,所采用的細(xì)胞培養(yǎng)方法也不盡相同。首先,筆者在選擇試驗(yàn)動(dòng)物時(shí),在種豬場(chǎng)選擇了出生1日齡的長白仔豬。經(jīng)試驗(yàn)證明,出生后1日齡仔豬心肌原代細(xì)胞具有較高的細(xì)胞活力。其次,消化酶的濃度和消化時(shí)間是實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵。不同的實(shí)驗(yàn)室采用胰酶的濃度從0.05%～0.25%不等,胰蛋白酶濃度過高時(shí),心肌組織中細(xì)胞及間質(zhì)均受到影響,極易把組織消化成為透明粘稠狀液體,使肌原纖維出現(xiàn)萎縮,細(xì)胞死亡率增加或喪失貼壁能力及搏動(dòng)能力;胰蛋白酶濃度過低時(shí),心肌組織消化不足,細(xì)胞聚集成團(tuán),無法分清細(xì)胞邊界,難以進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀測(cè)。同時(shí)用單一的胰酶消化心肌組織,容易造成心肌細(xì)胞的損傷〔10-12〕。本實(shí)驗(yàn)室采用混合消化酶(用濃度為2g/L胰蛋白酶(trypsin)和1g/LⅡ型膠原酶(collagenase)1∶1混合)消化心肌組織。不同實(shí)驗(yàn)室采用的分次消化時(shí)間從5～8 min不等,我們?cè)谠囼?yàn)中發(fā)現(xiàn)分次消化時(shí)間為8 min時(shí),細(xì)胞產(chǎn)量和細(xì)胞活力較理想。有的實(shí)驗(yàn)室在心肌消化過程中將心肌消化到透明為止,而我們發(fā)現(xiàn)隨著總消化時(shí)間的延長細(xì)胞活力呈下降趨勢(shì),本實(shí)驗(yàn)室將總的消化時(shí)間控制在30 min左右。第三,在進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)時(shí),組織材料來源、培養(yǎng)液、血清、消化酶、手術(shù)器械、培養(yǎng)板等,要嚴(yán)格按無菌實(shí)驗(yàn)要求準(zhǔn)備,培養(yǎng)過程中具體操作的每一步都應(yīng)嚴(yán)格遵循實(shí)驗(yàn)原則和無菌要求。心肌細(xì)胞的觀察、拍照時(shí)間不可過長,頻率不可太高,否則能增加污染概率。第四,心肌細(xì)胞生長的最適pH值為 7.2～7.4,因此培養(yǎng)液、胰蛋白酶、DHank′s液pH值均應(yīng)在此范圍內(nèi)。當(dāng)pH低于6.8時(shí),對(duì)心肌細(xì)胞生長會(huì)有抑制作用;當(dāng)pH值大于7.6時(shí),心肌細(xì)胞生長亦會(huì)受到抑制,且搏動(dòng)會(huì)減弱。第五,心肌細(xì)胞的接種密度不僅影響分離細(xì)胞的分化表型特征,而且影響心肌細(xì)胞的生存時(shí)間。心肌細(xì)胞之間聯(lián)系可促進(jìn)細(xì)胞自發(fā)活動(dòng)的形成。如果心肌細(xì)胞接種密度太低,細(xì)胞間難進(jìn)行信息交流,細(xì)胞生長不良、細(xì)胞難于生存;如果細(xì)胞密度太高,則易發(fā)生營養(yǎng)不良,且許多細(xì)胞難于貼壁生長,在更換培養(yǎng)液時(shí)容易被丟失〔13-14〕。本試驗(yàn)的心肌細(xì)胞接種密度為5×105細(xì)胞/mL,細(xì)胞生長良好,收縮明顯而有力,用顯微鏡可以看到搏動(dòng)細(xì)胞。第六,不同組織來源的細(xì)胞其生長所需要的營養(yǎng)物質(zhì)不同。本實(shí)驗(yàn)室在培養(yǎng)仔豬原代心肌細(xì)胞時(shí),曾用過高糖DMEM、低糖DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液,發(fā)現(xiàn)用這兩種培養(yǎng)液培養(yǎng)仔豬原代心肌細(xì)胞時(shí),細(xì)胞生長緩慢、成活率低、細(xì)胞形態(tài)不佳等缺點(diǎn)。后來換CMM 6201心肌專用培養(yǎng)液后,細(xì)胞形態(tài)、生長速度、成活率都明顯變好。綜上所述,本研究介紹的仔豬心肌原代細(xì)胞培養(yǎng)方法,細(xì)胞貼壁快、搏動(dòng)早、產(chǎn)量高,活力好而且操作簡便,是一種較為理想的心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)方法。

據(jù)報(bào)道,近年來豬口蹄疫逐步表現(xiàn)出發(fā)病率平穩(wěn),但死亡率卻趨于增高的態(tài)勢(shì),尤其是自1998、1999年起個(gè)別地方發(fā)病豬與先前的病豬比較在流行特點(diǎn)、臨床表現(xiàn)及病情控制等方面都有了相當(dāng)大的變化。最大的特點(diǎn)是：(1)仔豬發(fā)病由先前的腸炎、心肌炎到現(xiàn)在的心肌炎比率增大,而且心肌炎的發(fā)病群體也有所擴(kuò)大,育肥豬心肌炎的死亡率升高;(2)無明顯的口蹄疫癥狀,這就使得病豬在強(qiáng)應(yīng)激或藥物注射后迅速死亡,給養(yǎng)殖戶造成了較大的經(jīng)濟(jì)損失,同時(shí)也延誤了對(duì)口蹄疫的有效預(yù)防時(shí)機(jī)。

病毒性心肌炎,致病機(jī)制主要為：(1)病毒對(duì)心肌直接損傷;(2)由于心肌細(xì)胞內(nèi)在感染病毒后免疫反應(yīng)所致〔15〕。本試驗(yàn)首次培養(yǎng)仔豬心肌原代細(xì)胞并接種口蹄疫病毒進(jìn)行敏感性試驗(yàn)。結(jié)果證實(shí)長白仔豬的心肌原代細(xì)胞對(duì)口蹄疫O型乳鼠 適應(yīng)毒MF6(O/China/99)比較敏感。說明該原代心肌細(xì)胞可以作為研究口蹄疫感染誘發(fā)仔豬心肌炎致病機(jī)理的細(xì)胞模型。同時(shí)用生長良好的原代細(xì)胞接種該O型口蹄疫乳鼠適應(yīng)毒(MF6),從第2代可以觀察到比較典型的口蹄疫致細(xì)胞病變(CPE),且隨著傳代次數(shù)的增加病變時(shí)間和收毒時(shí)間縮短。傳至第6代收毒時(shí)間在20h左右,14h出現(xiàn)典型病變(CPE)。用國家口蹄疫參考實(shí)驗(yàn)室生產(chǎn)的間接紅細(xì)胞凝集試劑盒和口蹄疫夾心ELISA抗原定型試劑盒檢測(cè),可以檢測(cè)到O型口蹄疫病毒抗原,這就說明O型口蹄疫病毒可以在仔豬原代心肌細(xì)胞內(nèi)增殖,造成心肌細(xì)胞的損傷。

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