喻 晨，趙 劼，張亞雄，朱昌雄，姚 鵑，李知洪

（1.三峽大學(xué)生物工程重點實驗室，湖北宜昌443002；2.安琪酵母股份有限公司，湖北宜昌443003）

桔青霉發(fā)酵制備核酸酶P1研究進展

喻 晨1，趙 劼2，張亞雄1，朱昌雄2，姚 鵑2，李知洪2

（1.三峽大學(xué)生物工程重點實驗室，湖北宜昌443002；2.安琪酵母股份有限公司，湖北宜昌443003）

核酸酶P1是一種重要的工業(yè)酶制劑，可用于水解核酸生產(chǎn)5’-核苷酸。本文綜述了利用桔青霉發(fā)酵得到核酸酶P1的菌種選育、培養(yǎng)基優(yōu)化、發(fā)酵工藝控制、濃縮、相關(guān)應(yīng)用和國內(nèi)外市場狀況。

核酸酶P1，桔青霉，發(fā)酵法

核酸酶P1（Nuclease P1），又名5′-磷酸二酯酶，其作用為水解核酸中的3′，5′-磷酸二酯鍵得到四種5′-核苷酸。核苷酸是生物體內(nèi)重要的低分子化合物，具有許多生理功能，目前，隨著在嬰幼兒奶粉及保健品領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，核苷酸市場變得越來越大。核酸酶P1在核苷酸工業(yè)化生產(chǎn)中起著至關(guān)重要的作用。從目前的研究和工業(yè)化現(xiàn)狀來看，核酸酶P1主要通過桔青霉（Penicillium citrinum）發(fā)酵和麥芽根提?。?］兩種途徑生產(chǎn)，但由于麥芽根中可能含有的N-甲基大麥芽堿、亞硝胺、展青霉毒素、米曲霉毒素和蕁麻青霉菌毒素等物質(zhì)對人體有害，同時麥芽根提取酶活水平較低，原酶液酶活為300U/mL［2］，而且受麥芽根本身品質(zhì)影響較大，目前，麥芽根提取核酸酶P1技術(shù)在工業(yè)化生產(chǎn)中沒有任何優(yōu)勢；桔青霉發(fā)酵生產(chǎn)核酸酶越來越受到酶制劑工業(yè)的重視，此外，研究表明桔青霉產(chǎn)生的核酸酶P1在酵母抽提物生產(chǎn)中參與酵母產(chǎn)品風(fēng)味的提高，對操作工人和消費者是安全的［3］。目前，有關(guān)桔青霉發(fā)酵產(chǎn)核酸酶P1的研究主要集中在以下幾個方面。

1 核酸酶P1性質(zhì)研究

核酸酶P1的分子量約為24000，由331個氨基酸多肽單鏈構(gòu)成，含有2個二硫鍵，并含有3個鋅原子，酶分子含17.4%的碳水化合物（圖1）。

圖1 核酸酶P1結(jié)構(gòu)［4］

核酸酶P1的溫度適用范圍比較廣，是一種熱穩(wěn)定酶，在45～95℃均有催化活性。其最適酶反應(yīng)溫度為70℃［5］。最適pH因底物而異，一般在pH5～8都有較強的活性。核酸酶P1的最適pH還與溶液中的離子種類和離子強度有關(guān)。對于酵母核酸而言，此酶的最合適pH為5.0左右。郭春香［5］等人研究了金屬離子對核酸酶P1催化活性的影響，其結(jié)果表明Ti3+、Ce3+在濃度大于 10-3mol/L時，Mn2+、Fe2+、Co2+、Cu2+和Pd2+在濃度10-3～10-5mol/L的范圍時均表現(xiàn)出明顯抑制作用。Mg2+和Ca2+對酶活略有促進的效果［6］（見圖2）。

Zn2+在10-2～10-6mol/L的濃度范圍對該酶的酶活有激活作用，這與核酸酶P1的結(jié)構(gòu)（見圖1）有關(guān)，研究表明，核酸酶P1分子結(jié)構(gòu)中含有3個鋅原子，各個鋅原子作用如下［7］：鋅I主要參與維持酶的三級結(jié)構(gòu)從而確保酶與大分子底物如RNA的結(jié)合。鋅II用于活性構(gòu)象的維護。通過圓二色譜在遠紫外區(qū)檢測發(fā)現(xiàn)，鋅I和鋅II并不參與維護二級結(jié)構(gòu)，鋅III主要起維持完整二級結(jié)構(gòu)的決定性作用。

核酸酶P1在部分有機溶劑中，如甲基酰氨、二甲亞砜存在時仍有較高的酶活，在低濃度的變性劑環(huán)境中酶活有一定提高。B.N.Gangadhara［8］等人研究核酸酶 P1在低濃度的尿素（1mol/L）和鹽酸胍（0.5mol/L）條件下酶的活性可以提高3～4倍（見圖3）。

圖2 不同金屬離子對核酸酶活性的影響［5］

圖3 有機溶劑濃度對核酸酶P1活性的影響［7］

2 核酸酶P1的發(fā)酵研究

目前利用桔青霉發(fā)酵法生產(chǎn)核酸酶P1的研究主要集中在高產(chǎn)菌株選育、發(fā)酵工藝優(yōu)化和酶的分離純化濃縮工藝等三個領(lǐng)域。

2.1 菌種選育研究

桔青霉菌種誘變主要采用物理和化學(xué)方法，通過物理和化學(xué)手段對生物體DNA產(chǎn)生影響，使其發(fā)生變異，得到高產(chǎn)突變菌株。洪亦武［9］等人分別對桔青霉菌種（AS3.2788和AS3.2833）采用紫外線、硫酸二乙酯、亞硝基胍作為誘變劑誘變，發(fā)現(xiàn)亞硝基胍和紫外線作誘變劑效果較好，二者復(fù)合誘變效果更佳，采用0.5mg/mL的亞硝基胍處理60min，再經(jīng)紫外線處理60s，對出發(fā)菌株的致死率達到90%，篩選得到了3株高產(chǎn)菌株，酶活達到345U/mL。李科德等人［10］以桔青霉菌株（ATCC14994）為出發(fā)菌株，也采用紫外線與亞硝基胍相結(jié)合的方法多次誘變育種，獲得1株高產(chǎn)菌株，酶活達到1329U/mL。

此外，一些新的誘變方式也有報道，蘇龍［11］等人對桔青霉進行微波誘變得到1株核酸酶高產(chǎn)菌株，采用脈沖頻率為2450MHz，功率800W的微波爐，分別對相同濃度和體積的單孢子懸液進行輻射處理，使誘變菌株產(chǎn)酶水平由 667.50U/mL提高到1228.20U/mL，提高了84%。

離子束注入技術(shù)是20世紀80年代初材料學(xué)中興起的一項高新技術(shù)，近幾年逐漸引入到微生物育種［12］。吳永宏［13］采用氮離子束注入對桔青霉 M02進行誘變，確定最佳注入能量為20keV，最佳注入劑量20×1014N+·cm-2，篩選出5株正突變株，發(fā)酵酶活比出發(fā)菌種提高了61%。南京工業(yè)大學(xué)應(yīng)漢杰等人也通過離子束注入對桔青霉菌種進行誘變研究，控制離子注入室的真空度2×10-2～2×10-8，注入能量為0.1～1000keV，劑量為5×1013～500×1013ions· cm-2·s-1，低能離子為N+、Ar+、O6+或C6+，最終獲得了高產(chǎn)核酸酶P1的桔青霉菌株（CGMCC No.2014），采用三級放大發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵終點酶活達到5800U/mL［14］，這也是目前已有報道中見到的最高產(chǎn)酶菌株。

2.2 發(fā)酵工藝研究

從已有文獻來看，目前利用桔青霉發(fā)酵生產(chǎn)核酸酶P1的方式主要有液體深層發(fā)酵，固態(tài)發(fā)酵和固定化細胞培養(yǎng)的方法。

2.2.1 固態(tài)發(fā)酵法 微生物在具有一定溫度和濕度的固體培養(yǎng)基的表面生長、繁殖、代謝的發(fā)酵過程稱作為固態(tài)發(fā)酵。以麩皮為培養(yǎng)基培養(yǎng)桔青霉，操作簡單，成本低，能得到較高酶活的粗酶液。蘇慶輝［1］利用麩皮固態(tài)發(fā)酵法生產(chǎn)核酸酶P1，酶活可以達到500U/mL。但是，由于發(fā)酵周期長，占用空間大，且發(fā)酵過程中孢子污染環(huán)境，同時由于麩皮成分非常復(fù)雜，要想獲得純的核酸酶P1較為困難和繁瑣。因而，該生產(chǎn)工藝基本沒有被生產(chǎn)廠家采用。

2.2.2 液體深層發(fā)酵法 液體深層發(fā)酵主要研究培養(yǎng)基優(yōu)化和發(fā)酵工藝控制策略。李科德［2］等人對高產(chǎn)核酸酶P1的桔青霉進行了培養(yǎng)基中碳源、氮源、磷源成分篩選，確定了以蔗糖為碳源、酵母膏和蛋白胨為復(fù)合氮源、KH2PO4和K2HPO4為復(fù)合磷源的培養(yǎng)基。并通過正交實驗得出對酶活的影響順序為蔗糖＞酵母膏+蛋白胨＞MgSO4+ZnSO4＞KH2PO4+ K2HPO4。徐正軍［15］采用中心組合設(shè)計對碳源、氮源、磷源進行優(yōu)化以最大限度地提高核酸酶P1的發(fā)酵水平，結(jié)果表明，最優(yōu)的碳、氮源組成為葡萄糖3.87%、蛋白胨0.191%、玉米漿0.184%，此時的核酸酶P1的產(chǎn)酶水平最高，模型預(yù)測值可以達到661.1U/mL，驗證實驗酶活達到648.3U/mL，比優(yōu)化前提高了70%。此外，金屬離子對桔青霉菌體產(chǎn)酶也有顯著影響，其中，Zn2+對酶活影響較大［16］，研究表明0.04%鋅離子濃度對于核酸酶P1的生成和激活有重要作用。婁永江等人［17］對發(fā)酵培養(yǎng)基中的金屬離子種類進行了研究，得出低濃度的Zn2+能使酶活提高20%左右，F(xiàn)e2+、Sn2+也能小幅提高酶活，在高濃度的 Fe3+、Mn2+、Pb2+下酶活被抑制，Ca2+、Mg2+、 Na+、K+、對菌體產(chǎn)酶影響不大。

梁劍光［18-19］等對桔青霉發(fā)酵的工藝條件進行了相關(guān)研究，結(jié)果表明，種齡24h，接種量10%，初始pH6.5條件下，較高的發(fā)酵溫度下產(chǎn)酶最高點明顯提前，而在較低溫度下，發(fā)酵周期延長，但有利于菌體產(chǎn)酶。王端好等人［20］研究了溶氧對桔青霉發(fā)酵產(chǎn)核酸酶的影響，發(fā)現(xiàn)搖瓶裝液量為20%時，搖床轉(zhuǎn)速為180r/min，產(chǎn)酶最好，表明菌體產(chǎn)酶需要較高的溶氧。徐正軍［21］等人利用30L氣升式發(fā)酵罐研究了桔青霉產(chǎn)酶的發(fā)酵動力學(xué)，結(jié)果表明，核酸酶P1是不完全伴隨菌體生物量生長的產(chǎn)出產(chǎn)物，屬于部分耦聯(lián)，其發(fā)酵過程屬于部分耦聯(lián)型發(fā)酵（圖4）。

圖4 桔青霉發(fā)酵過程中產(chǎn)酶與生物量的關(guān)系［21］

此外，梁劍光等在研究中也發(fā)現(xiàn)，核酸酶P1的產(chǎn)酶量和菌體的生長關(guān)系不大，但是卻與菌體的生長速率有著一定的相關(guān)性，當(dāng)菌體處于快速生長期時，其產(chǎn)酶也相應(yīng)進入快速期［19］。

2.2.3 固定化菌體培養(yǎng) 固定化微生物技術(shù)是指用物理或化學(xué)方法將游離微生物細胞、動植物細胞、細胞器或酶限制或定位在某一特定空間范圍內(nèi)，保留其固有的催化活性，并能被重復(fù)和連續(xù)使用的技術(shù)［22］。其優(yōu)點在于培養(yǎng)生物密度高、反應(yīng)迅速、生物流失量少、反應(yīng)控制容易［23］。固定化細胞技術(shù)的關(guān)鍵是所用載體材料的性能［24］。夏黎明［25］利用吸附固定在多孔聚酯載體上的桔青霉菌絲生產(chǎn)核酸酶，酶活可高達513.3U/mL，其產(chǎn)酶效率是游離菌絲的3.6倍，而葡萄糖和蛋白陳的用量僅為游離菌絲產(chǎn)酶的1/5，連續(xù)生產(chǎn)28批（56d），產(chǎn)酶水平?jīng)]有下降，平均酶活達到507U/mL。煙臺大學(xué)王克明［26］等人通過使用雙載體固定化桔青霉產(chǎn)核酸酶，先使用玉米芯顆粒吸附桔青霉孢子，再用質(zhì)量分數(shù)為1.5%的海藻酸鈉包埋吸附固定化細胞玉米芯顆粒，培養(yǎng)50h后，發(fā)酵液中核酸P1的活力高達503U/mL。河南工業(yè)大學(xué)宋威［27］等人采用復(fù)合載體固定化細胞的方法，研究不同的材料和材料間不同配比對酶活力的影響，最終得出聚乙烯醇與海藻酸鈉比例為2∶1的復(fù)合載體固定桔青霉的孢子，連續(xù)發(fā)酵20個周期后，生產(chǎn)的核酸酶P1酶活力損失不大，始終保持在468.3～501.4U/mL。

復(fù)合載體作為一種新的固定化載體，突顯出機械強度大，使用壽命長等優(yōu)點。同時固定化細胞培養(yǎng)方式解決了液體深層發(fā)酵成本高的問題，重復(fù)利用率高，具有很好的工業(yè)應(yīng)用價值。

2.3 酶的分離純化與濃縮工藝研究

呂浩［28］等人將桔青霉發(fā)酵液通過硫酸銨分級沉淀、凝膠層析和離子交換纖維素層析等生化分離步驟，核酸酶 P1的比活力為711U/mg，純化倍數(shù)為1500。廖紅東［29］對桔青霉發(fā)酵液經(jīng)離心、超濾、硫酸銨鹽析、透析和DE-52型樹脂柱色譜分離，純化得到核酸酶P1，比酶活為28490U/mg，純化10.5倍。張一平［30］等采用超濾和鹽析技術(shù)，對麥芽根浸提液中核酸酶P1進行純化，酶活比初始提高了15倍，達到1500U/mL，其研究創(chuàng)新地將超濾和鹽析技術(shù)相結(jié)合，對桔青霉發(fā)酵中核酸酶P1的純化濃縮有指導(dǎo)意義。

3 核酸酶應(yīng)用研究

目前，核酸酶P1主要是用于酵母核酸水解，一般最適反應(yīng)溫度在70℃左右，pH6.5，水解時間4～5h。鄧義熹［2］等人研究得出，在3%底物濃度下，加入5%的用酶量，反應(yīng)2h時補加核酸底物，可以提高酶的利用率，酶解率維持在85%以上。而酶解反應(yīng)中隨著產(chǎn)物的增加，酶促反應(yīng)速率也相應(yīng)地受到影響。楊大令［31］等人在制備5′-核苷酸設(shè)備研究中采用了新型的分體式中空纖維酶膜反應(yīng)器。其優(yōu)點在于反應(yīng)中形成產(chǎn)物可透過膜分離出來，酶則繼續(xù)參與反應(yīng)循環(huán)往復(fù)，從而提高酶解率，通過優(yōu)化，當(dāng)核酸底物濃度為2%時，核酸酶P1濃度為100mg/L，pH為5.2，溫度為65℃，過膜壓力為0.1MPa，反應(yīng)5h酶解率可達85%。

此外還可以通過固定化酶技術(shù)來提高酶水解率，邵衛(wèi)祥［32］等人采用磁性納米顆粒與酶蛋白共沉淀后經(jīng)戊二醛交聯(lián)的方法，制備了磁性交聯(lián)核酸酶P1聚集體，結(jié)果表明：磁性交聯(lián)核酸酶P1聚集體在熱穩(wěn)定性，耐酸堿性均優(yōu)于游離酶，重復(fù)操作性穩(wěn)定，游離酶和磁性交聯(lián)核酸酶P1聚集體的Km值分別為7.27、30.7mmol/L，最適反應(yīng)溫度分別為75、90℃，最適 pH均為 5.2，連續(xù)使用 6次酶解率仍有70%。

4 展望

隨著我國核酸工業(yè)化的不斷推進，核酸酶P1在核苷酸工業(yè)生產(chǎn)中起到的重要作用，使核酸酶P1的需求量也越來越大。而我國國內(nèi)核酸酶P1生產(chǎn)廠家不多，造成核酸酶P1供應(yīng)緊缺，目前市場來源主要依靠國外進口。由此可見，該酶市場前景巨大。我國核酸酶P1的開發(fā)和生產(chǎn)以及相關(guān)應(yīng)用研究還須進一步加深。

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Advances on the nuclease P1 fermented by Penicillium citrinum

YU Chen1，ZHAO Jie2，ZHANG Ya-xiong1，ZHU Chang-xiong2，YAO Juan2，LI Zhi-hong2
（1.Key Laboratory of Bio-engineering，China Three Gorges University，Yichang 443002，China；2.Angel Yeast Co.，Ltd.，Yichang 443003，China）

Nuclease P1 is an important industrial enzyme，it can be used for hydrolyzing nucleic acid to produce 5′-nucleotide.The strain selection，medium optimization，fermentation processcontrol，concentration，related applications and domestic and international market conditions of nuclease P1 produced by Penicillium citrinum were reviewed.

nuclease P1；Penicillium citrinum；fermentation

Q814.4

A

1002-0306（2010）11-0416-04

2010-06-28

喻晨（1985-），男，碩士研究生，研究方向：微生物代謝工程。