王 煜，張竹君，張麗君，王 炯，張參軍

(1.甘肅省中醫(yī)院，甘肅 蘭州730050;2.甘肅省中醫(yī)藥研究院，甘肅 蘭州730050)

補肺益壽合劑是全國名老中醫(yī)王自立主任醫(yī)師集數(shù)十年臨床經(jīng)驗方。王老遵“春夏養(yǎng)陽，秋冬養(yǎng)陰”的經(jīng)旨，結(jié)合臨床經(jīng)驗研制出補肺益壽合劑。臨床用其治療慢性支氣管炎、肺氣腫、支氣管及過敏性哮喘反復(fù)發(fā)作的肺系疾病具有顯著療效。本實驗意在通過建立動物模型探討補肺益壽合劑Ⅱ補陰潤肺的可能機制。

1 材料與方法

1.1 動 物

小鼠40 只，雌雄不拘，體質(zhì)量(20 ±2)g，由上海中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心提供，合格證號:SYXK(滬)2004－2005。

1.2 藥物、試劑與儀器

補肺益壽合劑Ⅱ號由五味子、山藥、女貞子、丹皮、太子參等藥物組成，方由甘肅省中醫(yī)院王自立教授提供，由甘肅中醫(yī)院藥劑科制備，批號:甘衛(wèi)普制準(zhǔn)字(94)188－ 04。TRIzol Reagent，加拿大Life Technologies 公司產(chǎn)品，批號16696－026;M－MuLV Reverse Transcriptase，美國MBI 公司產(chǎn)品，批號MTT－1004;Taq DNA 聚合酶(Taq DNA Polymerase)，華美生物工程公司，批號MR0962;dNTP，生工生物工程公司產(chǎn)品，批號R0182;3－(N－嗎啉代)－丙磺酸(MOPS)，美國Amresco 公司產(chǎn)品，批號0670;焦碳酸二乙酯(DEPC)，美國Amresco 公司產(chǎn)品，批號Q0640;核糖核酸酶抑制劑(RNasin)，華美生物工程公司產(chǎn)品，批號MN0041;Agrose，Spanish分裝;100 bp DNA ladder，華美生物工程公司產(chǎn)品，批號A8200。引物設(shè)計按文獻(xiàn)［1］，由上海生物工程公司合成，引物序列及擴增片段見表1。

表1 引物序列及擴增片段

PCR 儀(GeneAmp PCRSystem 9600)，美國Perkin elmer 公司產(chǎn)品;PB－20 pH 酸度計，美國Sartorius 公司產(chǎn)品;SYDR－1990 凝膠成像儀，美國Gene公司產(chǎn)品;Image Master VDS，美國Pharmacia 公司產(chǎn)品;電動高速勻漿機，美國IKA Works 公司產(chǎn)品;Du7500 紫外分光光度計，德國Beckman 公司產(chǎn)品;核酸電泳槽，上海曹行無線電元件廠產(chǎn)品。

1.3 模型的建立

根據(jù)文獻(xiàn)［2］并加以修改建立肺陰虛證動物模型。將小鼠隨機分為即正常對照組、模型對照組、中藥補肺益壽合劑Ⅱ號(以下簡稱中藥)小劑量組及大劑量組4 組，每組10 只。給模型對照組、中藥小劑量組、中藥大劑量組小鼠灌服15 g/L(每天0.01 mL/g 體質(zhì)量)劑量的甲狀腺素粉及0.1 g/L(每天0.01 mL/g 體質(zhì)量)劑量的利血平，用藥7 d;然后采用SO2熏法，于玻璃熏箱中，SO2濃度為0.09 mg/cm3，每次15 min，1 d 1 次，連熏15 d。正常對照組不做任何處理。同時中藥小劑量組、大劑量組分別每天灌胃中藥0.04 mL/g ，中藥含量分別為22.5 g/(kg·d)、45 g/(kg·d)，1 d 1 次;正常對照組、模型對照組每天灌胃等量生理鹽水。造模結(jié)束后，動物斷頭處死，立即取出并在冰浴上分離肺組織。

1.4 檢測指標(biāo)

1.4.1 組織總RN A 提取(Trizol 一步法)

①將肺組織置于10 mL 消毒試管中，每50～100 mg 組織加入1 mL Trizol 試劑，冰浴中用電動高速勻漿器制備勻漿。②每1 毫升Trizol 試劑加入0.2 mL 氯 仿，快 速 震 蕩15 s，冰 浴5 min，4 ℃12 000 g 離心15 min，吸取上層水相轉(zhuǎn)移到另一干凈離心管內(nèi)。③加入與水相等體積預(yù)冷的異丙醇，緩慢混勻，冰浴15 min，4 ℃12 000 g 離心10 min，棄上清，將離心管倒置在消毒濾紙上，吸干異丙醇。④加入75%乙醇，重懸沉淀，4℃7 500 g 離心8 min，棄上清，在消毒濾紙上吸干乙醇。⑤重復(fù)步驟④，傾去乙醇，空氣干燥。⑥干燥后將沉淀溶于DEPC 水，置－70 ℃貯存，沉淀加乙醇于－20 ℃可長期貯存。⑦取4 μL 總RNA 溶液稀釋至1 mL，Beckman DU 7 500紫外分光光度計檢測OD 260 和OD 280 值，測定其濃度和純度。

1.4.2組織總RNA 甲醛凝膠變性電泳

①配制1%瓊脂糖甲醛變性膠:室溫放置30～45 min。②預(yù)電泳:凝固的甲醛瓊脂糖凝膠板放于電泳槽中，加入1×MOPS 電泳緩沖液，直到略微蓋過膠面。3～4 V/cm 電壓，預(yù)電泳10 min。③加樣及電泳:4.5 μL RNA(總RNA 30 μg)，10 μL 去離子甲酰胺，3.5 μL 甲醛，1.0 μL 10 ×MOPS 緩沖液，95 ℃變性15 min，冰浴冷卻，加2 μL 上樣緩沖液混合。④3～4 V/cm 電壓電泳，直至溴酚藍(lán)遷移至膠長2/3處，停止電泳。⑤紫外燈下觀察電泳結(jié)果，照相。

1.4.3 逆轉(zhuǎn)錄－聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)

(1)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA 第一鏈:在0.2 mL 無RNase 的PCR 管中依次加入以下試劑:Total RNA(1 g/L)3 μL，Antisense primer (25 pmol/μL)1 μL，DEPC H20(Rnase－free)調(diào)體積至12.5 μL，70 ℃變性5 min，冰浴5 min，5 × RT buffer 4 μL，10 mM 4 dNTP Mix 2 μL，RNAsin(20 U/μL)0.5 μL，M-MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶(200 U/μL)1 μL，42 ℃水浴45 min，72 ℃水浴10 min。

(2)PCR 擴增:在0.2 mL PCR 管中依次加入以下試劑:逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物10 μL，10 ×buffer 5 μL，MgCl2(25 mM)1 μL，DNTPs (2.5 mM)2 μL，Sense/Antisense primer 1 μL (each)，Taq DNA 聚 合 酶(5 U/μL)1 μL，DEPC H20 29 μL，瞬時離心，94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃1 min，94 ℃1 min，72 ℃1.5 min(IL-1循環(huán)參數(shù));56 ℃1 min，62 ℃2 min，56 ℃2 min(TNF-α 循環(huán)參數(shù));均為30 個循環(huán);72 ℃延伸10 min，4 ℃保存?zhèn)溆谩CR 產(chǎn)物進(jìn)行測序，由上海生工生物工程公司協(xié)助完成，測序采用T7 和M13 通用引物。

1.5 序列的同源性分析

根據(jù)生工生物工程公司返回的測序結(jié)果，通過國際互連網(wǎng)進(jìn)行同源性分析。以美國國家生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)的BLAST(basic local alignment search tool)作為主要的檢索工具，網(wǎng)址為:http://www.ncbi.nlm.nih.gov。進(jìn)行序列比對分析的數(shù)據(jù)庫主要有:①NCBI 的nr 庫，包括GenBank、EMBL(Euoropean Molecular Biological Laboratory)、DDBJ(DNA Database of Japan)所收錄的所有非冗余(non-redundant)序列;②NCBI 的ESTs(expressed sequence taqs)庫。檢索程序主要采用BLAST。以GAPDH 作為內(nèi)參照，比較條帶的光密度值。PCR 產(chǎn)物經(jīng)膠回收后，進(jìn)行序列測定。將序列測定結(jié)果進(jìn)行同源性比對分析，與大鼠IL-1 和TNF-α cDNA 同源性100%。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 肺組織總RNA 提取結(jié)果

各組動物肺組織總RNA 提取結(jié)果均在1.8～2.0 之間，且可見18 S 和28 S 兩條連續(xù)區(qū)帶，28 S的亮度約是18 S 的兩倍。表明RNA 完整無降解。見圖1。

圖1 RNA 甲醛凝膠變性電泳圖

2.2 補肺益壽合劑Ⅱ號對大鼠肺組織IL-1 mRNA、TNF-α mRNA 表達(dá)的影響

與正常對照組對比，模型對照組大鼠肺組織IL-1 mRNA表達(dá)升高，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。與模型對照組對比，中藥大、小劑量組IL-1 mRNA表達(dá)降低，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0. 05，或P＜0.01)。中藥大、小劑量組IL-1 mRNA 表達(dá)對比，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。見表2、圖2。

表2 補肺益壽合劑Ⅱ號對大鼠肺組織IL-1 mRNA、TNF-α mRNA 表達(dá)的影響 ±s

表2 補肺益壽合劑Ⅱ號對大鼠肺組織IL-1 mRNA、TNF-α mRNA 表達(dá)的影響 ±s

注:與正常對照組對比，* P＜0.05，＊＊ P＜0.01;與模型對照組對比，# P＜0.05，## P＜0.01;與中藥小劑量組對比，△P＜0.05。

組別 IL-1 mRNA TNF-α mRNA正常對照組0.21 ±0.02 0.25 ±0.03模型對照組 0.44 ±0.03＊＊ 0.55 ±0.03*中藥小劑量組 0.34 ±0.03* # 0.54 ±0.03*中藥大劑量組 0.23 ±0.02* ##△ 0.27 ±0.06* #△

圖2 中藥對大鼠肺組織IL-1 表達(dá)的凝膠電泳圖

與正常對照組對比，模型對照組TNF-α mRNA表達(dá)升高，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。中藥大劑量組與模型對照組對比，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。中藥大、小劑量組間比較，差別亦有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。見表2、圖3。

圖3 中藥對大鼠肺組織TNF-α mRNA 表達(dá)的凝膠電泳圖

3 討 論

研究表明，在細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)中，IL-1、TNF-α 等與結(jié)核病、自身免疫性疾病、革蘭氏陰性細(xì)菌感染、炎癥等的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系［3－4］。孫氏的初步研究認(rèn)為，IL-1 和TNF-α 等細(xì)胞因子產(chǎn)生增多是肺陰虛證的本質(zhì)［5］。當(dāng)機體在致病因素的作用下，IL-1、TNF-α 等細(xì)胞因子的基因表達(dá)增強、細(xì)胞因子產(chǎn)生增多、生物學(xué)活性升高，引起細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)自穩(wěn)態(tài)失衡，并使神經(jīng)－內(nèi)分泌系統(tǒng)也發(fā)生相應(yīng)的繼發(fā)性改變。本研究結(jié)果表明，模型對照組IL-1 mRNA 和TNF-α mRNA 表達(dá)較正常對照組明顯升高(P＜0.05或P＜0.01)，中藥小劑量和大劑量可使其表達(dá)下調(diào)，尤以大劑量組更為顯著(P＜0. 05)。表明中藥補肺益壽合劑Ⅱ號可以改善肺陰虛證時的IL-1 mRNA、TNF-α mRNA 的高表達(dá)，恢復(fù)失衡的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)至正常狀態(tài)而發(fā)揮其補陰潤肺的作用，其確切機制有待進(jìn)一步探討。

［1］Ferraris N，Perroteau I，Marchis S，et al.Glutamatergic deafferentation of olfactory bulb modulates the expression of mGluRla mRNA［J］.Neuroreport，1997，8(8):1 949－1 953.

［2］鄒移海，黃韌，連至誠，等. 中醫(yī)實驗動物學(xué)［M］. 廣州:暨南大學(xué)出版社，1999:160.

［3］Dinacello CA.Biological basis of Interleukin-1 in disease［J］.Blood，1996，87(6):2 095.

［4］Feldmann M，Brennan FM，Williams RO，et a1.Cytokine expression and netwoks in rheumatoid arthritis rationale for anti-TNF-α antibody therapy and its mechanism of action［J］.Journal of Inflammation，1996，47:90.

［5］申維璽，孫燕，張叔人，等.白細(xì)胞介素－1 等細(xì)胞因子與肺陰虛證本質(zhì)的相關(guān)性研究［J］. 中醫(yī)雜志，2000，41(7):423.