郝 習，趙明耀

(1.河南職工醫(yī)學院內科學教研室，河南 鄭州451191;2.鄭州大學醫(yī)學院病理生理教研室，河南 鄭州450052)

目前惡性腫瘤的生物治療日益受到青睞。生物治療能夠修復受損的免疫系統(tǒng)，激活機體的免疫細胞，有效清除手術及放、化療后殘余的腫瘤細胞，預防腫瘤復發(fā)和轉移。目前國際先進的生物診療技術是利用樹突狀細胞(dendritic cell，DC)和細胞因子誘導的殺傷細胞(CIK 細胞)兩種細胞聯(lián)合治療腫瘤的。DC 是目前已知的功能最強的抗原遞呈細胞，在激發(fā)T 細胞免疫反應中起重要作用。機體內自身的DC 數(shù)量是有限的，因此如何在體外大量擴增DC 成為醫(yī)學界研究的熱點。大量研究表明，中藥多糖在機體內有增強機體免疫和腫瘤抑制作用［1－2］。那么，中藥多糖在體外能否促進DC 的增殖和成熟，可否為DC 的體外擴增提供一個新的思路呢?本實驗旨在探討枸杞多糖(lycium barbarum polysaccharides，LBP)體外干預對DC 的影響，以期為DC 的體外擴增、分化以及成熟的促進提供一個新的思路。

1 材料與方法

1.1 動 物

KM 小鼠，雄性，8 周齡，體質量18～20 g，購自鄭州大學醫(yī)學院實驗動物中心。

1.2 瘤 株

H22 細胞株由鄭州大學醫(yī)學院病理生理教研室保存，常規(guī)傳代培養(yǎng)。

1.3 藥物、試劑與儀器

枸杞多糖由上海靈菱食用菌有限公司惠贈，批號05524。I 重組鼠源的白細胞介素4(rmIL-4)、粒細胞－巨噬細胞集落刺激因子(rmGM-CSF)、重組鼠白介素2(rmIL-2)，均購自美國R＆D System 公司;PRMI 1640、新生小牛血清、T 細胞尼龍毛柱為美國GIBCO 產品;四甲基偶氮唑藍MTT(Sigma 分裝)，購自華美公司;白介素－ 12 P40(interleukin-12P40，IL-12P40)單克隆抗體，購自武漢博士德生物有限公司;CD86、CD11a 單克隆抗體，購自美國BD(Becton Dickinson)公司。CO2培養(yǎng)箱，德國Heraeus公司產品;流式細胞儀(FACS Calibur)，美國BD 公司產品;24 孔培養(yǎng)板，美國Coastar 公司產品。

1.4 小鼠骨髓來源DC 的分離培養(yǎng)

參照文獻［3］分離小鼠骨髓DC。頸椎脫臼處死小鼠，75%酒精浸泡10 min，無菌條件下取股骨;用Hanks 液反復沖洗髓腔獲得骨髓細胞，收集沖洗液，1 000 r/min 離心3 min，去上清，反復2 次;加入10 倍體積的37 ℃預溫的Tris-NH4Cl 紅細胞裂解液去除紅細胞;1 000 r/min 離心3 min，去上清，再用Hanks 液洗反復洗2 次;用含10%小牛血清的RPMI 1640 完全培養(yǎng)基(含10 μg/L rmGM-CSF，5 μg/L rmIL-4)調細胞濃度至1 ×106/mL，以1 mL/孔加入24 孔培養(yǎng)板培養(yǎng);置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48 h 后吸棄細胞碎片和未貼壁細胞并半量換液。

1.5 H22 腫瘤抗原肽的制備

收集 H22 腫瘤細胞，調配成濃度為1 ×106個/mL，常規(guī)－80 ℃～37 ℃凍融法制備腫瘤抗原，以40 μL/孔加入培養(yǎng)至第五天的DC 微池中，以沖擊DC。

1.6 小鼠H22 肝腹水瘤細胞的培養(yǎng)

將H22 肝腹水瘤細胞在含10%(V/V)胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)基(含青霉素和鏈霉素100 U/mL)、5% CO2、37 ℃、飽和濕潤空氣中培養(yǎng);常規(guī)每3 天傳代1 次。

1.7 小鼠脾T 淋巴細胞的制備

無菌條件下取小鼠脾臟，研磨成單細胞，經孔徑40 μm 尼龍篩過濾;用Tris-NH4Cl 低滲溶解紅細胞，經尼龍毛柱，洗脫后用含10%小牛血清的培養(yǎng)液(含hIL-2 5 μg/L )1 ×107/mL 中培養(yǎng);培養(yǎng)6 h 后收集未貼壁細胞即為T 細胞。

1.8 LBP 溶液的制備

分別稱取LBP 粉劑(多糖含量＞95%)5，10，20 mg，分別溶于1 000 mL 生理鹽水中，即得5，10，20 mg/L 的LBP 溶液。

1.9 DC 分組

將制備好的DC 分成4 組，分別為生理鹽水(NS)+DC + H22組、LBP 5 mg/L + DC + H22組、LBP 10 mg/L+DC+H22組及LBP 20 mg/L+DC +H22組。隔天換液，繼續(xù)培養(yǎng)至第6 天。

1.10 腫瘤抗原肽負載DC

將培養(yǎng)至第4 天的各組DC 與制備好的H22 腫瘤抗原肽相混合，40 μL/孔(DC 與腫瘤細胞對應比例為100 ∶1，相當于每毫升相應腫瘤細胞數(shù)為4 ×104個)。

1.11 檢測指標

1.11.1 DC 的培養(yǎng)

加入1640 培養(yǎng)基、IL-4 以及GM-CSF 條件下，小鼠骨髓來源的單核細胞誘導分化成DC。以倒置顯微鏡觀察正常培養(yǎng)(即培養(yǎng)過程中正常換培養(yǎng)液，不加任何刺激物)至第6 天的DC。此外，將培養(yǎng)至第4 天的DC(此時已有部分細胞有樹突樣突起)加入LBP 10 mg/L 繼續(xù)培養(yǎng)24 h(即第5 天)、48 h(即第6 天)，并以倒置顯微鏡觀察。

選擇如下代表性系統(tǒng)作為基準模型：(1)Neural Responding Machine(NRM)[21] 是針對單輪對話設計的序列學習模型?；谟柧殧?shù)據(jù)中的問題—答案對訓練NRM 模型。主要注意的是NRM 沒有與知識庫進行交互，它是聊天機器人的代表模型；(2)Embedding-based QA(EQA)[22] 直接匹配問題和事實，是知識問答系統(tǒng)的代表模型，它只能提供答案實體，不能生成自然答案；(3)GenQA[7]是第一個自然答案生成模型。

1.11.2 DC 表達CD86、CD11a 情況的檢測

通過流式細胞儀檢測。將負載H22 腫瘤抗原肽的DC 繼續(xù)培養(yǎng)(24 孔板培養(yǎng))至第3 天;分別加入5，10，20 mg/L 的LBP 溶液1.0 mL 和等體積的生理鹽水，每個濃度設6 個復孔，繼續(xù)培養(yǎng)至第6 天;第6 天時收集培養(yǎng)的DC;將培養(yǎng)細胞首先用0.25%胰蛋白酶消化5 min，至光鏡下見到貼壁細胞間出現(xiàn)篩狀間隙為止，棄去消化液，加PBS 液;用吸管將細胞從瓶壁上輕輕吹打下來，并移入離心管中;短時低速離心(800～1 000 r/min)5 min;棄上清，加pH 為7. 4 的PBS 液5 mL，再低速短時離心5 min;重復3 次，以去除細胞懸液中的細胞碎片;加少許PBS 液，加入1%多聚甲醛固定5 min，加入PBS 清洗2 遍，棄上清，分別加入FITC 和PE 標記的單克隆抗體CD86 和CD11a，上機檢測。

1.11.3 不同濃度作用下DC 分泌IL-12P40 的檢測

以Western－blot 檢測。①轉膜:SDS-PAGE 蛋白電泳后，凝膠在轉移緩沖液中平衡15 min。放入Towbin 轉移緩沖液中浸泡15～30 min。于Bio-Rad半干式電轉儀中轉印，條件為20V，90 min。②封閉:轉印后的PVDF 膜或NC 膜置于封閉液中，4 ℃下封閉過夜。③抗原蛋白與第一抗體反應:將膜置于封閉液稀釋的血清中，室溫微搖2 h。用PBS 洗滌3 次，每次10 min。轉入TBS 溶液中，室溫微搖10 min。④抗原蛋白與第二抗體反應:將膜置于用含1%(W/V)的去脂奶粉的TBS 稀釋的第二抗體中，室溫微搖1 h。TBS 洗滌3～5 次，每次10 min;⑤顯色:取6 mg DAB(二氨基聯(lián)苯胺)溶于9 mL 0.01 M Tris-HCl(pH 7.6)中，加1 mL 0.3%(W/V)的NiCl2(新鮮配制)。將膜轉入上述顯色液中，顯色充分(1～3 min)時，立即用水洗膜，然后將膜轉入PBS 中，照相保存。

1.11.4 T 淋巴細胞殺傷活性反應的檢測

將各組DC 分別與淋巴細胞按數(shù)量比為1∶30 的比例混合培養(yǎng)4 h，分別致敏T 淋巴細胞。各種致敏的T淋巴細胞為效應細胞，H22 肝癌細胞為靶細胞，進行混合培養(yǎng)24 h，效靶比分別為20∶1，40∶1，80∶1，然后采用MTT 法測定致敏的T 細胞殺傷活性，以未致敏的T 淋巴細胞為效應對照組，計算公式如下:

1.12 統(tǒng)計學方法

2 結 果

2.1 DC 培養(yǎng)結果

正常培養(yǎng)至第6 天，大部分細胞有樹突樣突起，呈現(xiàn)出典型的樹突樣突起，見圖1。將培養(yǎng)至第4 天 的DC 加入LBP 10 mg/L 繼續(xù)培養(yǎng)24 h(即第5 天)后，細胞樹突樣突起增多，細胞生長旺盛。加入LBP 培養(yǎng)48 h(即第6 天)后，大部分樹突狀細胞突起減少，細胞變大變圓，呈現(xiàn)出成熟樹突狀細胞的形態(tài)，見圖2。

2.2 LBP 對DC 免疫表型的影響

LBP 處理組CD11a 和CD86 分子的表達均明顯高于NS 組，其中10 mg/L 增加最為明顯。見表1。

表1 各組DCs 的CD11a 和CD86 免疫表型對比mg·L －1，±s

表1 各組DCs 的CD11a 和CD86 免疫表型對比mg·L －1，±s

注:與NS 組對比，* P＜0.05;與5 mg/L 組對比，# P＜0.05;與20 mg/L 組對比，△P＜0.05。

組 別 劑量/mg·L－1 CD11a CD86 NS 組53.82 ±1.64 63.78 ±1.66 LBP 組 5 68.75 ±1.35* 75.36 ±1.43*LBP 組 10 85.46 ±1.43# 92.37 ±1.86* #△LBP 組 20 76.83 ±2.68* 85.34 ±1.48*

2.3 LBP 對IL-12P40 表達的影響

經電泳、轉膜、抗體雜交顯色后，在約與標準蛋白分子量40 KDa 相對應位置獲得蛋白條帶;采用Gel-Pro analyzer 分析軟件對蛋白條帶圖像進行灰度分析。各加藥組DCs 的IL-12P40 蛋白分泌水平高于NS 組，差別有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。其中以10 mg/L 干預組DC 表達IL-12P40 水平最高，與其他3 組對比，差別有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。見圖3、表2。

圖3 各組蛋白條帶圖

表2 各組IL-12P40 表達對比灰度值n=3，±s

表2 各組IL-12P40 表達對比灰度值n=3，±s

注:與NS 組對比，* P＜0.05;與5 mg/L 組對比，# P＜0.05;與20 mg/L組對比，△P＜0.05。

組 別 劑量/mg·L －1 IL－P1240 NS 組68.32 ±8.36 LBP 組 5 76.32 ±6.48*LBP 組 10 95.36 ±5.47* #△LBP 組 20 84.32 ±9.86*

2.4 CTL 介導的腫瘤細胞特異性細胞毒實驗

經ANOVA 分析發(fā)現(xiàn)，與NS 組對比，各加藥組殺傷活性增加，差別有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。其中LBP 10 mg/L 劑量干預T 細胞殺傷活性最強。見表3。

表3 DCs 刺激同種反應性T 細胞的殺傷活性n=10，%，±s

表3 DCs 刺激同種反應性T 細胞的殺傷活性n=10，%，±s

注:與NS 組對比，* P＜0.05;與5 mg/L 組對比，# P＜0.05;與20 mg/L組對比，△P＜0.05。

組 別 劑量/mg·L －1殺傷活性NS 組16.32 ±4.54 LBP 組 5 20.48 ±6.58*LBP 組 10 43.65 ±7.36* #△LBP 組 20 21.28 ±6.43*

3 討 論

細胞免疫抗腫瘤的機制主要為CTL 的特異性殺傷效應、巨噬細胞及NK 細胞的殺傷效應、細胞因子直接或間接的殺瘤效應等［4－5］。本研究通過LBP對DC 培養(yǎng)液的干預，證明LBP 可以間接提高T 細胞的殺傷H22 瘤細胞株活性。而免疫反應的產生首先必需由抗原提呈細胞捕獲抗原，經其加工、處理后將抗原信息傳遞給T、B 淋巴細胞，方能產生一系列免疫應答［6］。因此，抗原遞呈細胞是機體免疫反應的首要環(huán)節(jié)，能否進行有效的抗原提呈關系到免疫激活或免疫耐受的誘導。而樹突狀細胞是目前發(fā)現(xiàn)的體內抗原提呈能力最強的專職APC，在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著關鍵作用［7］。

大量的研究表明，正常情況下絕大多數(shù)體內DC處于非成熟狀態(tài)，其表達低水平的共刺激分子和黏附分子，體外激發(fā)混合淋巴細胞反應(MLR)能力較弱，而且抗原提呈能力也較弱，但具有極強的抗原內吞和加工處理能力;成熟的DC 才具有較強的抗原提呈能力［8－9］。而研究表明，成熟的DC 高表達CD80、CD83、CD86、HLA-DR、HLA-A、CD11a 等共刺激分子，相反，非成熟DC 不表達或弱表達上述共刺激分子。本研究中經LBP 處理后的DC 培養(yǎng)液與NS 組相比，在培養(yǎng)第6 天時DC 表達CD86、CD11a的水平明顯增高，說明LBP 能夠促進DC 的成熟。IL-12 是成熟DCs 分泌的一種細胞因子，它能夠促進Th0 細胞向Th1 細胞轉化，誘導Th1 型細胞介導的免疫反應。本實驗表明，LBP 處理的DCs 能夠分泌高水平的IL-12P40，進而促使T 細胞轉化為殺傷性T 細胞，提高T 細胞的殺傷活性。

綜上所述，本實驗證實了LBP 體外干預DC 的培養(yǎng)過程，不但能夠起到增加其數(shù)量的作用，同時也能夠促進DC 的分化和成熟，從而為惡性腫瘤的生物治療提供有益方法。

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