岳紅云, 賀翔鴿, 燕振國(guó), 曹 虹, 馬巖梅

(1蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院眼科, 蘭州 730050; 2第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院眼科; *通訊作者,E-mail:Xiangge he@hotmail.com)

為了加強(qiáng)機(jī)體對(duì)一定免疫原的免疫應(yīng)答,常應(yīng)用各種免疫促進(jìn)劑,稱為免疫佐劑(immunological adjuvant,IA),佐劑與免疫原混合,可以加強(qiáng)對(duì)免疫原的免疫應(yīng)答能力。佐劑增強(qiáng)對(duì)免疫原的免疫應(yīng)答,但并不賦予半抗原免疫原性。

Nogo-66蛋白的等電點(diǎn)為6.09;當(dāng) pH＞pI的溶液中,蛋白質(zhì)為陰離子,根據(jù) Nogo-66蛋白的等電點(diǎn),當(dāng) pH=7時(shí),Nogo-66在電場(chǎng)中向陽(yáng)極移動(dòng);而中性 pH值時(shí),硫酸鋁帶負(fù)電荷,氫氧化鋁帶正電荷。因此,選擇 Nogo-66蛋白的適合佐劑時(shí),選擇氫氧化鋁為適合佐劑。

在已經(jīng)證實(shí) Nogo-66蛋白免疫原性[1]的基礎(chǔ)上,本實(shí)驗(yàn)擬驗(yàn)證其生物效應(yīng)及免疫反應(yīng)過(guò)程的特征,試圖了解氫氧化鋁佐劑對(duì)Nogo-66蛋白免疫原性的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 8周齡正常成年 SD大鼠 48只,體重 200-220 g,雌雄不拘,動(dòng)物由第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,許可證號(hào):SCXK(渝)2003.0003。

1.2 方法

1.2.1 氫氧化鋁佐劑的Nogo-66蛋白吸附率計(jì)算

氫氧化鋁佐劑與 Nogo-66蛋白吸附方法:取氫氧化佐劑混懸液 1 ml后,按照說(shuō)明書,與 4%Nogo-66蛋白溶液以體積比例 1∶1,1∶2,1∶3配制,充分微量震蕩混勻 30 min。

微板考馬斯亮藍(lán)蛋白定量法計(jì)算上清液中的Nogo-66蛋白質(zhì)濃度:①500 r/min離心混合后的氫氧化鋁佐劑與 Nogo-66蛋白質(zhì) 1 min,取上清液,分別標(biāo)記體積比例 1∶1,1∶2,1∶3為樣本 1,2,3。 ②10 mg考馬斯亮藍(lán) G-250溶于 5 ml 95%乙醇溶液,加入 85%磷酸 10 ml,混勻,取 1.5 ml母液,其余部分作為儲(chǔ)存液保存于 4度冰箱。③于 1.5 ml母液中加入雙蒸水8.5 ml,作為工作液,制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。④樣本 1,2,3中 Nogo-66蛋白質(zhì)濃度測(cè)量。

氫氧化鋁佐劑的Nogo-66蛋白吸附率計(jì)算:按照公式[1]:氫氧化鋁佐劑的Nogo-66蛋白的吸附率=(原有蛋白質(zhì)量-上清液中蛋白質(zhì)的量)/原有蛋白質(zhì)量×100%。樣本 1,2,3中,Nogo-66蛋白的吸附率分別為20.57%,21.06%,20.88%。

1.2.2 吸附氫氧化鋁佐劑的Nogo-66蛋白免疫大鼠 健康 8周齡 SD大鼠 40只,隨機(jī)納入蛋白質(zhì)組與高劑量佐劑組、中劑量佐劑組及小劑量佐劑組各10只,各組動(dòng)物均采用 1%異戊巴比妥鈉 0.8 ml腹腔注射麻醉。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物于實(shí)驗(yàn)第1天開始免疫,接種頻次 1次 /7 d,免疫 4次。

免疫注射液配制及注射方法:將凍干粉 Nogo-66蛋白用等滲 PBS稀釋至 4 mg/ml,按照前述氫氧化鋁佐劑與 Nogo-66蛋白吸附比例與方法配制注射液后,稀釋 10倍,給予實(shí)驗(yàn)大鼠 1 ml背部及雙后趾皮下多點(diǎn)注射。對(duì)照組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物以相同時(shí)間及頻次給予 1 ml等滲 PBS背部及雙后趾皮下多點(diǎn)注射對(duì)照。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)處于活躍分裂期細(xì)胞數(shù)目

計(jì)算處于增殖期細(xì)胞的數(shù)量及占細(xì)胞總量的百分比,周期中 S及 G2/M期細(xì)胞百分比。于初次免疫后8 d,16 d不同時(shí)間段取各組 SD大鼠各 5只。同前方法麻醉大鼠,取出新鮮大鼠脾臟后,提取細(xì)胞,淋巴細(xì)胞分層液分離脾臟淋巴細(xì)胞。流式細(xì)胞檢測(cè)儀進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物共 40只,試驗(yàn)過(guò)程中,各組均無(wú)死亡大鼠。所有大鼠試驗(yàn)數(shù)據(jù)均符合統(tǒng)計(jì)學(xué)分析要求。

2.2 各實(shí)驗(yàn)組脾淋巴細(xì)胞增殖能力檢測(cè) 蛋白質(zhì)組、高劑量佐劑組、中劑量佐劑組及小劑量佐劑組的SD大鼠脾淋巴細(xì)胞經(jīng)過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1,表2,圖1。高劑量佐劑組的脾淋巴細(xì)胞增殖程度為最小,中劑量佐劑組與小劑量佐劑組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,而與高劑量佐劑組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。三組比單純蛋白質(zhì)組的免疫原性均較低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

神經(jīng)系統(tǒng)損傷后,局部級(jí)聯(lián)反應(yīng)的損傷抗原Nogo-66具有明確的免疫原性[1],通過(guò)免疫佐劑的吸附之后,能否得到更強(qiáng)免疫原性,從而對(duì)于神經(jīng)免疫保護(hù)過(guò)程起到持久作用,是前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上所要完成的內(nèi)容。

本試驗(yàn)中,應(yīng)用不同吸附比例氫氧化鋁懸液(alum precipitate,AP),對(duì)Nogo-66蛋白質(zhì)進(jìn)行處理,目的是促進(jìn)抗原的吸收,并使抗原連續(xù)緩慢在受試動(dòng)物機(jī)體釋放,從而判斷佐劑能否增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物對(duì)M[TM]攝取和處理抗原的活性。應(yīng)用在不同時(shí)間觀察分相情況,并及時(shí)檢查吸附度的方法,監(jiān)測(cè)上清中抗原的量,除以制造時(shí)加入抗原的總量,計(jì)算吸附百分率。通過(guò)分析各時(shí)間段淋巴細(xì)胞增殖情況[2],判斷 Nogo-66蛋白的免疫原性及其促進(jìn)淋巴增殖的時(shí)間峰值。所得到的數(shù)據(jù)證實(shí),佐劑存在的前提下,刺激 T淋巴細(xì)胞的免疫原性較單純的Nogo-66蛋白降低[3]。

鋁佐劑的作用機(jī)制主要表現(xiàn)在吸附率越高,佐劑效果越明顯。很小劑量的鋁可以使抗原完全吸附,但不能達(dá)到最好的佐劑效果。使用鋁佐劑,除了100%吸附的劑量外,尚需附加量的鋁佐劑[4]。其原因可能是免疫局部有足夠量的鋁佐劑,以確保逐步釋放抗原[5]。佐劑本身可能刺激吞噬細(xì)胞活性,但是過(guò)多的佐劑抑制抗原釋放。本實(shí)驗(yàn)中,氫氧化鋁佐劑對(duì)Nogo-66的影響表現(xiàn)為對(duì)免疫原性的抑制作用,其原因可能在此。

表1 免疫后4 d SD大鼠脾臟 T淋巴細(xì)胞增殖結(jié)果Tab 1 Comparison of proliferation of T lymph cells in SD rats after immunization for 4 d among 4 groups

表2 SD大鼠脾臟T淋巴細(xì)胞增殖結(jié)果 (免疫后8d)Tab 2 Comparison of proliferation of T lymph cells in SD rat after immunization for 8 d among 4 groups

圖1 免疫后4d淋巴細(xì)胞周期流式圖Fig 1 The cell cycle of T lymph cells after immunization for 4 d by flow cytometry

Nogo-66蛋白在進(jìn)入體內(nèi)后,根據(jù)其抗原表位的特征,只有通過(guò)吞噬細(xì)胞的處理,才能夠暴露抗原表位的小肽段,從而刺激 T淋巴細(xì)胞,激活后者的免疫作用[6]。但是由于鋁佐劑對(duì)吞噬細(xì)胞有細(xì)胞毒作用,因此,可能導(dǎo)致對(duì)于蛋白的處理能力降低,表現(xiàn)抗原表位肽段表達(dá)程度降低后,細(xì)胞免疫功能下降[7]。

如果實(shí)驗(yàn)的目的在于制成人用疫苗,為了降低EAE發(fā)生可能性,最初的實(shí)驗(yàn)步驟中,并不苛求非常高的免疫原性[8]。重要點(diǎn)在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)能否達(dá)到如周圍系統(tǒng)一樣的免疫應(yīng)答,激活相對(duì)免疫赦免系統(tǒng)的EAE之前,Nogo-66蛋白激活損傷抗原特異性 T淋巴細(xì)胞,完成損傷過(guò)程中被損害的免疫系統(tǒng)的修復(fù)。

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