郭嘉偉, 謝洪平

(1第三軍醫(yī)大學藥學院藥物分析與分析化學教研室, 重慶 400038; 2蘇州大學藥學院藥物分析教研室; *通訊作者:E-mail:breakhp@163.com)

左氧氟沙星,以其抗菌活性強、抗菌譜廣、高效等特點,是目前最受歡迎的氟喹諾酮類抗菌藥物之一。其分子結構存在有 C-4羰基氧,C-3羧基,另外還有哌嗪基團,因此其理化性質(zhì)必然會受到介質(zhì)的理化性質(zhì)和pH的影響。隨著介質(zhì) pH的改變,左氧氟沙星會產(chǎn)生不同的結構變化,結構變化又會使其熒光光譜發(fā)生改變[1]。近年來,已經(jīng)有報道利用一些熒光分析方法對左氧氟沙星在不同 pH環(huán)境中的不同結構形態(tài)進行了研究[2-5],但是這些研究僅能獲取不同結構形態(tài)藥物的混合物光譜,往往進行一些間接的推論,未能闡述這些不同結構形態(tài)的具體變化過程,同時也不能直接獲得各結構形態(tài)的光譜和濃度變化信息。本文利用熒光分光光度法對不同pH值下的左氧氟沙星溶液進行三維熒光分析,并以滿秩平行因子分析方法(full rank parallel factor analysis,Full-PARAFAC)對相應的三維陣列數(shù)據(jù)進行分辨,達到對不同 pH環(huán)境下左氧氟沙星各種結構型體熒光光譜和濃度變化進行研究的目的,為左氧氟沙星的藥動學和藥效學研究提供更科學的信息。

1 儀器與試劑

左氧氟沙星(含量 99%,蘇州長征制藥廠提供),磷酸二氫鉀,磷酸氫二鉀,氫氧化鈉,鹽酸 (國藥集團化學試劑有限公司)。所有藥品均為分析純,雙蒸水(自制)。

LS-55熒光分光光度計(Perkin Elemer公司),pHS-3TC精密數(shù)顯酸度計(上海精密科學儀器有限公司)。

2 方法

2.1 樣本制備 以左氧氟沙星、KH2PO4,K2HPO4,NaOH和HCl(0.01 mol/L)配制了 pH值分別為2.78,3.54,4.21,4.71,5.16,5.76,6.57,6.84,7.02,7.26,7.43,7.62,7.83的13個待測樣本。

2.2 光譜條件 對所配制的不同 pH值的待測樣本分別掃描其三維熒光譜圖,光譜條件為:激發(fā)波長290-360 nm,步長增加 5 nm;發(fā)射波長410-560 nm,掃描次數(shù) 15次;激發(fā)與發(fā)射的狹縫寬度均為5 nm。

3 結果

3.1 左氧氟沙星在不同 pH值下的三維熒光光譜在樣品的三維熒光譜圖中可以觀察到,隨著 p H值的改變,左氧氟沙星溶液發(fā)生了熒光特征變化,熒光發(fā)射峰發(fā)生了明顯的藍移(見圖1),此現(xiàn)象說明在不同 pH環(huán)境下此藥物可能存在不同的結構型體。基于文獻[3],發(fā)現(xiàn)它們可能是氫鍵結構(the hydrogen bond structure,HDS)和雙極離子結構(the dipole ion structure,DIS)兩種型體,但由于兩種結構型體之間存在顯著的化學平衡和弱化學鍵的結構,難于分離,當然更無從得到其純光譜。

圖1 左氧氟沙星在pH 2.78,pH 5.16和pH 7.83溶液中的三維熒光光譜Fig 1 The three dimensional fluorescence spectrum of levofloxacin in the pH 2.78,pH 5.16and p H 7.83 solution

3.2 Full-PARAFAC分辨結果 用 Full-PARAFAC方法對三維數(shù)據(jù)陣列進行分辨,得到了左氧氟沙星兩個結構型體的光譜(圖2)以及相應的濃度變化曲線(圖3)。圖2中 290-360 nm范圍內(nèi)的光譜為激發(fā)光譜,400-560 nm范圍內(nèi)的光譜為發(fā)射光譜。從圖3可以觀察到,兩種結構型體濃度之和的變化趨勢依據(jù) pH值可分為三個階段:分別為pH2.78-5.76,pH5.76-7.02和pH7.02-7.83。

圖2 左氧氟沙星 HDS(●)和DIS(▲)的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜(實線:分辨光譜;虛線:p H值 2.78的實際光譜)Fig 2 The excitation and emission spectra of HDS(●)and DIS(▲)for levofloxacin(line:resolution spectra;dash line:real spectra of p H 2.78)

圖3 HDS(●)、DIS(▲)和HSD+DIS(■)的濃度變化曲線Fig 3 The concentration variation curves of HDS(●),DIS(▲)and HDS+DIS(■)

4 討論

4.1 三維光譜數(shù)據(jù)處理 通過掃描獲得了 13個樣本的激發(fā)-發(fā)射光譜,組成了(15′292′13)的三維數(shù)組,但由于其發(fā)射光譜數(shù)據(jù)過于緊密,將導致數(shù)據(jù)處理量大大增加,而信息量并未顯著提高,因此,本文參照激發(fā)光譜,將5 nm的間隔也用于發(fā)射光譜,從而使三維數(shù)組的維數(shù)從(15′292′13)降低為(15′29′13),并以此數(shù)據(jù)進行三維分辨。

4.2 HDS和DIS的熒光光譜及濃度變化 由于在不同的pH環(huán)境中,左氧氟沙星會產(chǎn)生不同的結構變化,偏酸性條件下,分子中的羧基氧結合質(zhì)子,并與 4位 C羰基氧相連,形成氫鍵,此時溶液中 HDS結構型體占主要比例;而隨著 pH值的升高,分子內(nèi)氫鍵逐漸被破壞,具有氫鍵結構的HDS型體逐漸減少,以雙極離子形式存在的結構型體濃度逐漸升高。從圖3可以看出,與圖2光譜 1相對應組分的濃度隨 pH的升高逐漸減少,而光譜 2組分的濃度卻隨pH的升高逐漸增加。因此,在所得到的左氧氟沙星兩個組分的純光譜中,光譜 1應為HDS結構型體的激發(fā)與發(fā)射光譜,而光譜 2為DIS結構型體的純光譜。為了說明以上的結論,對所得 HDS的發(fā)射光譜與實際光譜進行了比對。當 pH為2.78時,HDS型體的濃度最高,而 DIS型體的濃度幾乎為零,因此,這時的實際光譜就應當為型體 HDS的熒光光譜。在 pH2.78的三維熒光光譜圖中,取最大激發(fā)/發(fā)射對294 nm/501 nm處的譜線數(shù)據(jù)歸一化后,與分辨得到的結構型體 HDS的發(fā)射光譜進行對比,發(fā)現(xiàn)二者完全重合(見圖2)。從而進一步證明了上述的實驗結論,亦間接證明了分辨圖中的第二條曲線應為結構型體 DIS的熒光光譜。

在獲取 HDS和DIS兩種型體純光譜的同時,也得到了兩者的濃度變化趨勢。由圖3可知,隨著 p H值的升高,以氫鍵形式(HDS)存在的結構型體逐漸減少,而以雙極離子形式(DIS)存在的結構型體逐漸增多。HDS和DIS兩種結構型體的總量也逐漸減少。同時 HDS和DIS的總濃度的變化呈現(xiàn)三個階段,即在 pH2.78-5.76范圍內(nèi)穩(wěn)定,在 pH5.76-7.02范圍內(nèi)相對穩(wěn)定,而在 pH7.02-7.83范圍內(nèi)明顯下降。

5 結論

本文對不同 pH環(huán)境下左氧氟沙星的三維熒光光譜進行了研究,發(fā)現(xiàn)在 pH值 2.78-7.83的范圍內(nèi),左氧氟沙星的三維熒光光譜會發(fā)生規(guī)律性的變化:2.78≤pH≤5.16時,熒光發(fā)射峰逐漸藍移,熒光強度基本保持不變;5.16＜pH≤7.83時,熒光峰大幅度藍移,熒光強度逐漸降低。在溶液中,當 p H值發(fā)生改變時,左氧氟沙星存在著不同結構型體之間的離解平衡,因此,利用 Full-FARAFAC分析方法得出了 pH值 2.78-7.83范圍內(nèi)兩種結構型體 HDS和DIS的純熒光光譜和濃度變化曲線,兩種結構型體的濃度之和變化呈現(xiàn)出三個階段:p H2.78-5.76范圍內(nèi)穩(wěn)定,pH5.76-7.02范圍內(nèi)相對穩(wěn)定,pH 7.02-7.83范圍內(nèi)明顯下降?；谘芯拷Y論可知,在生理 pH環(huán)境中,左氧氟沙星應當也存在 HDS和DIS這兩種結構型體,隨著 pH的變化,這兩者在體內(nèi)的濃度比例亦會產(chǎn)生變化,而本文中 HDS和DIS兩種結構型體純光譜的獲得,即相當于獲得了兩種結構型體的對照品,通過對分析結果中的光譜進行比對,不僅使生物樣品中左氧氟沙星兩種結構組分的檢測和濃度測定成為可能,更對左氧氟沙星藥物代謝和動力學研究提供了更可靠的信息支持。

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