張慧蘭, 喬學文, 申云飛

(山西康寶生物制品股份有限公司, 長治 046011)

帕米膦酸二鈉(APD)為新一代雙膦酸鹽類骨代謝改善劑,在對骨質生長和礦化無明顯不良影響的劑量下,有很強的抑制骨質再吸收作用,國外已用于惡性腫瘤的高鈣血癥、溶骨性骨轉移、佩吉特氏病、骨質疏松癥及多發(fā)性骨髓瘤的治療或預防,對惡性腫瘤骨轉移所引起的疼痛有顯著的止痛作用。帕米膦酸二鈉在碳鏈末端引入氨基,使生物活性大大增強,其抑制骨吸收作用比依屈膦酸鈉強 100倍,比氯屈膦酸鈉強 10倍。帕米膦酸二鈉作為骨吸收抑制劑,用于治療腫瘤高血鈣和惡性腫瘤骨轉移,療效顯著,副作用低。該藥品 1987年在阿根廷首先上市后,在英、美以及歐洲國家普遍相繼上市使用。由于該藥在合成過程中使用了有機溶劑甲醇、氯苯,本研究采用氣相色譜法,以 50%N,N-二甲基甲酰胺為溶劑,對帕米膦酸二鈉中甲醇、氯苯溶劑殘留量進行測定,操作簡單,重現(xiàn)性好,可用于該原料藥中甲醇、氯苯殘留的測定。

1 儀器與試藥

島津 GC-14C型氣相色譜儀;FID檢測器。帕米膦酸二鈉原料藥(山西康寶生物制品股份有限公司生產(chǎn),批號 040401,040402,040403),甲醇、氯苯、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性實驗 色譜柱 DIMWax毛細管柱(30 m×0.32 mm,0.50μm);進樣口溫度為240℃;FID檢測器,溫度為250℃;柱溫 40℃(保持 5 min),以 20℃/min升溫至 180℃(保持1 min);載氣為氮氣;進樣量 1μl。在此色譜條件下,理論板數(shù)以氯苯計算為5 354,氣相色譜圖見圖1,甲醇、氯苯及溶劑 N,N-二甲基甲酰胺的保留時間約為0.975,5.305,7.772 min,分離度均＞4。空白溶劑 N,N-二甲基甲酰胺對測定不干擾。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的配制 精密稱取甲醇(15.6 mg)、氯苯(14.5 mg)分別置 25 ml量瓶中,加 50%N,N-二甲基甲酰胺稀釋至刻度,搖勻,作為殘留溶劑對照品儲備液,再分別精密量取甲醇對照品貯備液 5.0 ml和氯苯對照品貯備液 0.6 ml于 10 ml量瓶中,加 50%N,N-二甲基甲酰胺稀釋至刻度,搖勻,作為對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的配制 精密稱取供試品 1.0 g于具塞試管中,精密加入 10 ml 50%DMF溶解,濾過,取續(xù)濾液,即得。

2.3 精密度試驗 取 2.2項下對照品溶液,平行進樣 5次,測得甲醇、氯苯峰面積的RSD分別為1.53%和1.08%。

2.4 檢測限 分別取甲醇、氯苯對照品儲備液稀釋制成一定濃度的溶液,進樣 1μl,當甲醇、氯苯濃度分別為0.374μg/ml,0.209μg/ml,信噪比約為3,甲醇、氯苯的檢測限分別為0.4 ng,0.2 ng。

2.5 標準曲線的制備 分別精密量取甲醇對照品儲備液 1.0,2.5,5.0,6.5,8.0 ml和氯苯對照品儲備液 0.2,0.4,0.6,0.8,1.0 ml,分別置 10 ml量瓶中,用 50%N,N-二甲基甲酰胺配制成每毫升含甲醇 62.4,156.0,312.0,405.6,499.2μg和氯苯 11.6,23.2,34.8,46.4,58.0μg的標準溶液。照上述色譜條件進樣 1μl,記錄色譜圖,以峰面積(A)對濃度(C)進行線性回歸。甲醇 Y=304.87X-7 982.2,r=0.999 2;氯苯 Y=2 727.6X-17 465,r=0.999 4。甲醇和氯苯分別在 62.4-499.2 mg/ml和11.6-58.0 mg/ml的濃度范圍內線性關系良好。

2.6 回收率試驗 取本品(批號 040401)6份,每份約 1.0 g,置 10 ml量瓶中,再精密加入 2.2項下對照品溶液適量(低、中、高樣品,使甲醇和氯苯濃度分別約為249.6,312.0,374.4μg/ml和27.84,34.80,41.76μg/ml),加 50%N,N-二甲基甲酰胺溶解,并定容至刻度,搖勻。依上述色譜條件,精密量取 1μl進樣,并記錄色譜圖,計算回收率及 RSD值,結果見表1,2。

圖1 2種有機溶劑及空白溶劑氣相色譜圖Fig 1 Gas chromatograms of blank(A)and two organic solvents(B)

表1 甲醇回收率試驗結果Tab 1 Recovery test of methanol

表2 氯苯回收率試驗結果Tab 2 Recovery test of chlorobenzene

2.7 測定結果 取標準對照品溶液與供試三批樣品溶液,進樣 1μl,進行色譜分析,測定結果見表3。

表3 帕米膦酸二鈉有機溶劑殘留量的測定結果Tab 3 Contents of residual solvents in pamidronate disodium

3 討論

3.1 限度的確定 人用藥物注冊技術要求國際協(xié)調會(ICH)的有機溶劑殘留量指導原則中,規(guī)定甲醇和氯苯為第二類應該限制使用的溶劑,本文參照中國藥典 2005年版二部的指標要求,規(guī)定待測溶劑的限度為:甲醇 0.3%,氯苯 0.036%。

3.2 溶劑的選擇 由于帕米膦酸二鈉為水溶性藥物,而待測的有機溶劑氯苯在水中的溶解性不好,故選擇 50%N,N-二甲基甲酰胺水溶液做溶劑,這樣不僅可以使帕米膦酸二鈉充分溶解,還可以使氯苯在 N,N-二甲基甲酰胺充分溶解。

3.3 柱溫的選擇 本實驗采用程序升溫的方法,測定時將柱溫設定在 40℃保持 5 min,使甲醇和氯苯能很好分離,但溶劑 N,N-二甲基甲酰胺沸點高,故以 20℃/min升溫至 180℃,加快 N,N-二甲基甲酰胺出峰。

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