王慶華,喬志軍,金藝鵬,裴增楊,林德貴

(1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院,北京 海淀 100193;2.拜耳(四川)動物保健有限公司,北京 朝陽 100020)

鹽酸特比萘芬是一種廣譜抗真菌藥物[1-4],臨床上廣泛用于治療淺部真菌病,結(jié)果顯示鹽酸特比萘芬治療淺部真菌病療程短、療效高、不良反應(yīng)少[5-6]。對由皮膚癬菌引起的甲真菌病特比萘芬比灰黃霉素、伊曲康唑和氟康唑療效要好[7-8]。近年來,鹽酸特比萘芬也逐漸應(yīng)用于獸醫(yī)臨床,以治療小動物真菌病[9-10]。

鹽酸特比萘芬口服后吸收良好,約70%～80%被吸收;血漿蛋白結(jié)合率高達(dá)99%,并具有親脂性和親角質(zhì)性,能迅速經(jīng)真皮層彌散并集中在角質(zhì)層。該藥主要在肝臟代謝,代謝產(chǎn)物無抗菌活性,主要經(jīng)過腎臟排泄,口服吸收量的80%以代謝物形式由尿液排出,少部分經(jīng)過膽汁、糞便排泄。該藥消除半衰期為17 h,在體內(nèi)無蓄積作用,其穩(wěn)態(tài)血藥濃度不受年齡影響。但肝、腎功能不全者對特比萘芬的清除率可能降低,從而導(dǎo)致血藥濃度升高,出現(xiàn)肝、腎損傷。在獸醫(yī)臨床上研究特比萘芬對犬貓肝、腎損傷的資料較少。并且特比萘芬致肝、腎功能正常者肝臟及腎臟損傷的機(jī)制目前尚不完全清楚,可能由于藥物的直接毒性,也可能通過獨特的免疫學(xué)和代謝機(jī)制導(dǎo)致機(jī)體特發(fā)性反應(yīng)。本試驗采用組織病理學(xué)方法檢測口服不同劑量的鹽酸特比萘芬后貓肝臟和腎臟器官的組織學(xué)變化,以探討鹽酸特比萘芬對貓肝腎的損傷影響,為獸醫(yī)臨床合理應(yīng)用鹽酸特比萘芬治療犬貓真菌病提供臨床用藥的試驗數(shù)據(jù)及相關(guān)病理資料。

1 材料

1.1 實驗動物 28只短毛貓 ,公貓15只和母貓13只,2.5～4歲,平均體重2.8 kg,來自中國農(nóng)業(yè)大學(xué)實驗動物中心。實驗動物適應(yīng)飼養(yǎng)環(huán)境3周后,對實驗貓進(jìn)行全面體況檢查及實驗室檢驗。健康貓入選本研究。在試驗前6周內(nèi)局部使用或系統(tǒng)性使用過藥物的貓不入選。

1.2 試驗藥物及配置 鹽酸特比萘芬片劑：北京諾華制藥公司;規(guī)格：每片250 mg。配置方法：將片劑藥物研磨,根據(jù)實驗動物體重準(zhǔn)確稱取相應(yīng)重量藥物。

1.3 主要儀器 山東醫(yī)療器械廠 LX-75型切片機(jī),英國Shandon半自動石蠟包埋機(jī),英國Shandon自動烤片機(jī),重慶光學(xué)儀器廠COIC XSZ-G型光學(xué)顯微鏡。

1.4 其他主要材料 優(yōu)級純甲醛、二甲苯、中性樹膠、蘇木精-伊紅染色液、明膠、石蠟等均由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院臨床系外科實驗室提供。

2 方法

2.1 實驗動物的飼養(yǎng) 飼喂偉嘉成年貓糧,自由飲水。

2.2 實驗動物分組及給藥步驟 3周適應(yīng)期后,28只貓被隨機(jī)分為4組(7只/組)。鹽酸特比萘芬以獸醫(yī)臨床推薦使用劑量10 mg/kg?d為基礎(chǔ),適當(dāng)?shù)募恿孔鳛樵囼瀯┝?即分為低劑量組(10 mg/kg?d)、中劑量組(20 mg/kg?d)、高劑量組(40 mg/kg?d)和對照組(0 mg/kg?d)。不同組的實驗貓連續(xù)3周口服給藥相應(yīng)劑量的鹽酸特比萘芬。

2.3 組織采集及保存方法 分別在給藥后第3周(即第21天)和第5周(即第35天)取不同劑量組的實驗貓各3只,安樂死后分別取肝臟及腎臟部分組織,分成大小約1 cm3的小組織塊,使用10%中性福爾馬林固定備用。

2.4 肝、腎病理組織學(xué)切片的制作 按常規(guī)組織學(xué)切片制作方法制作肝、腎組織學(xué)切片。

2.5 切片觀察 用顯微鏡對肝腎病理組織切片進(jìn)行觀察和拍照。

3 結(jié)果與分析

3.1 口服不同劑量鹽酸特比萘芬的貓肝臟組織病理切片觀察 本試驗中通過H.E染色進(jìn)行病理學(xué)觀察可見,口服不同劑量的鹽酸特比萘芬均能造成不同程度的貓肝實質(zhì)病變。染色并鏡檢表現(xiàn)為：肝索紊亂、肝竇不明顯、界限不清晰,以及不同程度的間質(zhì)水腫;肝細(xì)胞空泡變性,肝細(xì)胞顯著腫脹,核固縮;肝細(xì)胞胞漿內(nèi)有少量棕紅色含鐵血紅素顆粒沉著,疑為肝性膽紅素阻塞;匯管區(qū)與小葉間界限不清晰,小葉間結(jié)締組織增生,形成膠原纖維;肝中央靜脈擴(kuò)張,小葉間靜脈極度擴(kuò)張;血管內(nèi)有大量含鐵血紅素沉著;不同程度的膽管增生、纖維化;不同程度的嗜中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞浸潤,炎性細(xì)胞多分布于肝小葉及匯管區(qū)。高劑量特比萘芬能導(dǎo)致門管區(qū)更嚴(yán)重的炎性反應(yīng),大量的淋巴細(xì)胞形成淋巴濾泡;小葉間結(jié)締組織增生更為明顯;肝細(xì)胞嚴(yán)重腫脹、核固縮明顯。見中插彩版圖 1、圖2。

3.2 口服不同劑量鹽酸特比萘芬的貓腎臟組織病理切片觀察 H.E.染色進(jìn)行病理學(xué)觀察可見,口服不同劑量的鹽酸特比萘芬均能造成不同程度的貓腎實質(zhì)病變。主要表現(xiàn)為腎間質(zhì)充血擴(kuò)張,髓質(zhì)血管輕度擴(kuò)張、充血;廣泛性的腎小管上皮空泡變性,胞碎裂、壞死;腎小管上皮細(xì)胞明顯核固縮;散在腎小管上皮細(xì)胞溶解;管腔內(nèi)存在少量散在性管型;近曲小管管腔內(nèi)有蛋白顆粒,細(xì)胞腫脹,管腔變窄;遠(yuǎn)曲小管管腔擴(kuò)張,集合管擴(kuò)張,并有少量纖維組織增生;被膜下腎小管變性壞死,間質(zhì)中有局灶性淋巴細(xì)胞浸潤;腎小球內(nèi)皮與基底膜細(xì)胞分離。

對不同劑量的給藥組實驗貓腎臟損傷進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn),高劑量特比萘芬能導(dǎo)致腎小管上皮嚴(yán)重的空泡變性,部分核溶解甚至消失;皮質(zhì)腎小管上皮嚴(yán)重腫脹,明顯核固縮;腎小管封閉,腎小球基底膜增厚;甚至造成腎小球萎縮,腎小囊出血。見中插彩版圖3、圖4。

3.3 口服鹽酸特比萘芬在不同時期對貓肝臟組織病理切片觀察 飼喂各劑量組特比萘芬的試驗貓在持續(xù)給藥3周后停止給藥,繼續(xù)觀察實驗貓的各種指標(biāo)。在停藥兩周后(即試驗的第35天),分別取肝臟與腎臟組織行組織病理學(xué)切片。H.E.染色后進(jìn)行病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn),口服鹽酸特比萘芬3周后停藥兩周明顯比口服鹽酸特比萘芬21 d對貓肝臟造成的組織病理學(xué)損傷嚴(yán)重。結(jié)果顯示：試驗第5周肝細(xì)胞變性情況比試驗第3周更嚴(yán)重,肝細(xì)胞腫脹顯著、空泡變性;小葉間結(jié)締組織增生嚴(yán)重;門管區(qū)炎性細(xì)胞尤其是嗜中性粒細(xì)胞及淋巴細(xì)胞浸潤增多。見中插彩版圖5。

3.4 口服鹽酸特比萘芬在不同時期對貓腎臟組織病理切片觀察 H.E.染色后進(jìn)行病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn),口服鹽酸特比萘芬3周后停藥2周明顯比口服鹽酸特比萘芬21 d對貓腎臟造成的組織病理學(xué)損傷嚴(yán)重。具體的顯微對比結(jié)果為腎小管上皮空泡變性更為嚴(yán)重,核固縮更明顯;腎小管管腔內(nèi)有更多量的蛋白顆粒;間質(zhì)中更多量的纖維組織增生;間質(zhì)中有更多的炎性細(xì)胞,尤其是淋巴細(xì)胞呈片狀浸潤。見中插彩版圖6。

組織學(xué)切片觀察結(jié)果表明,對照組貓的肝臟和腎臟未見病理學(xué)變化。

4 結(jié)語

本試驗采用組織病理學(xué)方法觀察了口服鹽酸特比萘芬的正常貓肝腎組織學(xué)變化,以探討鹽酸特比萘芬對貓肝腎的損傷。從組織病理學(xué)檢查可以得出：(1)口服不同劑量的鹽酸特比萘芬均能造成不同程度的貓肝腎實質(zhì)病變;鹽酸特比萘芬對貓肝腎的損傷具有明顯的量效關(guān)系：高劑量組與低、中劑量組相比具有更顯著的肝腎損傷效應(yīng)。(2)口服鹽酸特比萘芬3周后停藥2周(即給藥后第35天)明顯比口服鹽酸特比萘芬給藥后第21天對貓肝腎造成的組織病理學(xué)損傷嚴(yán)重,提示了鹽酸特比萘芬對貓肝腎的損傷可能是一個藥物蓄積的損傷過程。

本試驗證實了口服鹽酸特比萘芬對貓肝腎的損傷作用,提示獸醫(yī)臨床上應(yīng)用鹽酸特比萘芬治療貓皮膚真菌病時,應(yīng)綜合考慮該藥的肝腎毒性,制定合理的用藥劑量和用藥周期。

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