陳志寶,姜游帥,夏禮杰,于 錄,邱家章,宋科技,卜仕金,鄧旭明

(1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院,黑龍江大慶163319;2.揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院,江蘇揚(yáng)州225009;3.吉林大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院,吉林長春130062)

金黃色葡萄球菌(簡(jiǎn)稱金葡菌)是臨床非常重要的致病菌之一,是引起奶牛和山羊乳房炎最重要的病原菌。目前,全世界有三分之一的奶?；加心膛Ｈ橄傺?每年因乳腺炎造成的損失高達(dá)350億美元[1]。研究表明,在臨床分離的金葡菌中,超過60%為耐藥菌,耐甲氧西林金葡菌(MRSA)感染有明顯增高趨勢(shì)[2]。耐萬古霉素金葡菌(VRSA)[3]的出現(xiàn),使臨床中MRSA感染面臨無藥可治的局面。因此急需尋找新的抗金葡菌藥物。

蜂膠是蜜蜂采集植物的芽苞分泌物或傷口處流出的樹葉油脂、黏液、樹脂、橡膠,并混入蜂蠟和其他分泌物經(jīng)咀嚼加工而成的一種粘稠物質(zhì)[4]。蜂膠的成分相當(dāng)復(fù)雜,含有黃酮類、芳香酸、醋類、萜烯類等多種化合物。蜂膠生物活性主要有：抗病毒、抗菌、抗真菌、抗腫瘤、抗氧化、免疫增強(qiáng)作用。蜂膠的抗金葡菌感染機(jī)制尚不明確,本文主要探討亞抑菌濃度蜂膠對(duì)金葡菌一些毒力因子分泌的影響。

1 材料與方法

1.1 菌株 標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC29213購自中國藥品生物制品檢定所(CMCC)。

1.2 試劑和儀器 蜂膠購自CMCC;SuperECL Plus超敏發(fā)光液(北京普利萊基因技術(shù)有限公司);SEA、SEB抗體(Sigma);UV-2600型紫外可見分光光度計(jì)(尤尼柯公司),酶標(biāo)儀(TECAN)。

1.3 方法

1.3.1 最小抑菌濃度(MIC)以及生長曲線的測(cè)定 參照CLSI(Clinical And Laboratory Standards Institute)的標(biāo)準(zhǔn)方法M7-A8,倍比稀釋測(cè)定蜂膠對(duì)ATCC29213的MIC。繪制ATCC29213在不同濃度蜂膠作用的生長曲線。挑取單菌落至3mLLB液體,37℃過夜培養(yǎng),次日接種至300mLLB液體培養(yǎng)基培養(yǎng),至OD600nm為0.3時(shí)分裝成6份,分別加入蜂膠至終濃度為：256μg/mL,128μg/mL,64μg/mL,32μg/mL,16μg/mL,0μg/mL。LB培養(yǎng)基調(diào)零,測(cè)量OD600nm吸光值,繪制生長曲線。

1.3.2 樣品處理 不同藥物濃度培養(yǎng)的金葡菌在對(duì)數(shù)生長后期且相同的OD值(OD600nm=2.5)時(shí)取樣,12000r/min離心2min,上清用0.22μm濾膜過濾,留作以下試驗(yàn)。

1.3.3 α-溶血素活力測(cè)定 參照Bernheimer[5]的方法,無菌條件取去纖維蛋白的新鮮兔血2mL,氯化鈣緩沖液(20mmol/LCaCl2,0.125mol/LNaCl)洗滌,3000r/min離心5min,洗滌3次。向1.5 mL滅菌離心管加入875μL氯化鈣緩沖液,100μL樣品上清,25μL紅細(xì)胞,37℃孵育30min;5500r/min離心1min;OD543nm測(cè)定其吸光值。

1.3.4 凝固酶的效價(jià)測(cè)定 參考HirokoKuroda等[6]的方法取肝素抗凝的新鮮兔血漿,3000r/min離心10min,按PBS和血漿體積比例 4∶1稀釋;用LB培養(yǎng)基將上述收集的菌液倍比稀釋,每試管中加100μL;再加0.5mL稀釋兔血漿,37℃孵育直至產(chǎn)生凝集。以產(chǎn)生凝集的最高稀釋倍數(shù)作為凝固酶效價(jià)。

1.3.5 腸毒素分析 取上清樣品20μL加上樣緩沖液,煮沸5min,配制5%濃縮膠,12%分離膠進(jìn)行SDS-PAGE電泳,半干法轉(zhuǎn)膜(0.03A,30min);3.5%BSA封閉2h;加入一抗(SEA,1∶5000;SEB,1∶1000)室溫慢搖1h;TBST清洗3次,每次10min;加入HRP標(biāo)記的二抗(1∶4000)室溫輕搖1h,再洗滌;ECL顯色,曝光、顯影。

2 結(jié)果

2.1 MIC值及抑菌曲線 結(jié)果顯示蜂膠對(duì)金葡菌ATCC29213的MIC為512μg/mL。蜂膠的抑菌作用具有濃度依賴性,1/2MIC時(shí)可明顯抑制ATCC29213的生長,隨著培養(yǎng)時(shí)間加長細(xì)菌仍可增長,1/4MIC仍有較強(qiáng)的抑菌作用,但比1/2MIC抑菌能力弱,1/8MIC,1/16MIC,1/32MIC濃度蜂膠的抑菌作用不明顯(圖1)。

圖1 生長曲線

2.1 α-溶血素活力測(cè)定 結(jié)果表明1/2MIC、1/4 MIC、1/8MIC組的溶血活力僅為對(duì)照的5.69%、14.78%和13.19%。1/32MIC組溶血活力仍低于對(duì)照。高濃度蜂膠對(duì)ATCC29213α-溶血素的表達(dá)有明顯的抑制作用,且在較寬濃度范圍都能明顯降低 α-溶血素的分泌,低濃度仍能抑制 α-溶血素分泌。

圖2 溶血活性分析

2.2 凝固酶分析 試驗(yàn)結(jié)果表明,只有256μg/mL組能夠降低凝固酶的效價(jià),低濃度時(shí)無影響。

2.3 腸毒素分析 Western-blot結(jié)果顯示,不同濃度蜂膠作用后能夠減少腸毒素A、B的產(chǎn)量(圖3)。高濃度蜂膠對(duì)腸毒素A、B分泌的抑制作用強(qiáng)于低濃度。高濃度的蜂膠對(duì)腸毒素B表達(dá)的影響要強(qiáng)于腸毒素A。

圖3 腸毒素 A、B Western-blot分析

3 討論

奶牛乳腺炎大部分是由細(xì)菌感染引起的,其中最主要的是金葡菌,其造成的乳房?jī)?nèi)感染占到50%以上[7]。金葡菌感染主要是耐藥菌株,其侵入乳腺后被炎癥組織包圍,使抗菌藥物不易到達(dá)感染部位[8],并且金葡菌呈高度的接觸性傳染,很容易在擠奶過程傳染。

金葡菌感染產(chǎn)生多種致病相關(guān)的毒力因子,破壞宿主的組織器官,特別是α-溶血素,能引起強(qiáng)烈的組織損傷,破壞宿主的免疫系統(tǒng)[9-11],所以在選用抗菌藥物時(shí)除了考查其抑菌和殺菌能力,還應(yīng)考察其對(duì)毒力因子的影響。很多抗生素能改變金葡菌毒力因子表達(dá),例如,一些β-內(nèi)酰胺類和氟喹諾酮類抗生素能夠刺激α-溶血素表達(dá)并增加α-溶血素的分泌,克林霉素幾乎能完全抑制α-溶血素的表達(dá)[12]。如果能在抑制細(xì)菌生長的同時(shí)也能夠抑制其毒力因子的表達(dá),可降低金葡菌致病力,對(duì)治療金葡菌感染具有重要意義。一些中藥單體,如表兒茶酸沒食子酸酯也能夠降低金葡菌毒力相關(guān)蛋白的分泌,表兒茶酸沒食子酸酯與β-內(nèi)酰胺類抗生素合用治療金葡菌感染將是非常有效的[13]。Smith P等[14]也報(bào)道亞抑菌濃度的多種植物揮發(fā)油具有抑制金葡菌溶血素、腸毒素等毒力因子產(chǎn)生的作用。

研究表明,蜂膠能夠抑制標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 29213的生長,在低濃度時(shí)抑菌作用較弱,雖然亞抑菌濃度的蜂膠不能完全抑制金葡菌生長,但卻能夠抑制金葡菌的多種毒力因子的分泌。蜂膠對(duì)α-溶血素的分泌抑制作用最強(qiáng),且在較寬濃度范圍都能明顯降低α-溶血素的分泌。圖2表明,1/8 MIC組的溶血活力僅為對(duì)照的13.19%,1/32 MIC組溶血活力仍明顯低于對(duì)照組?？梢姷蜐舛鹊姆淠z就能夠減少α-溶血素的產(chǎn)生,從而減輕金葡菌對(duì)機(jī)體的侵害;表1顯示,凝固酶效價(jià)在 MIC、1/2MIC時(shí)表現(xiàn)出下降作用,在低濃度時(shí)凝固酶效價(jià)沒有改變;圖3表明,在不同濃度蜂膠作用下的金葡菌腸毒素分泌量均明顯地降低,而在1/2MIC和1/4MIC蜂膠作用下幾乎不產(chǎn)生腸毒素B,可以將蜂膠作為食品或飼料的添加劑和防腐劑,能夠很好地減少金葡菌分泌的腸毒素對(duì)人類和動(dòng)物的危害。

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