易先國,李 衛(wèi),吳海港,雷咸波,梁存軍,劉漢儒

(1.信陽農(nóng)業(yè)高等?？茖W(xué)校動(dòng)物科學(xué)系,河南信陽464000;2.信陽市光山縣動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所,河南信陽464000;3.河北省清河縣農(nóng)業(yè)局,河北清河054800;4.西南大學(xué)藥學(xué)院,重慶北碚400700)

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis,UC)是一種病因及發(fā)病機(jī)理未明確的慢性腸道炎癥性疾病,是炎癥性腸病(inflammatory bowl disease IBD)的一種。哪種致病菌是這類腸黏膜炎癥的致病原迄今缺乏相關(guān)研究。

本病主要以大腸黏膜以及黏膜下層發(fā)生慢性、非特異性炎癥性病變?yōu)橹行?黏膜上皮及腺體破壞、增生或萎縮,淋巴細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞浸潤.隱窩膿腫形成,因而呈現(xiàn)黏膜充血、糜爛、潰瘍以及增殖性改變[1-2]。動(dòng)物以犬多發(fā),1965年由Van Kruiningen H[3]首先描述。拳獅幼犬特別易感;德國牧羊犬、愛爾蘭塞特犬和阿富汗犬也常發(fā)。病犬易疲勞,喜睡,體重減輕,皮毛干燥。這種疾病在美國、澳大利亞、日本、瑞典、荷蘭、英國都有報(bào)道,國內(nèi)缺乏相關(guān)報(bào)道。

香連滴丸是由黃連、木香組成,根據(jù)中獸醫(yī)理論具有清熱燥濕,行氣止痛之功效,對(duì)治療潰瘍性結(jié)腸炎具有理論依據(jù)。本試驗(yàn)參照Okayasu I[4]采用葡聚糖硫酸鈉(DSS)自由飲水誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生UC模型,觀察香連滴丸對(duì)化學(xué)試劑誘導(dǎo)的小鼠UC的治療作用,為今后進(jìn)一步研究提供依據(jù)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性BALB/c小鼠40只,體重19～21 g,由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 主要藥品與儀器 香連滴丸(西南大學(xué)藥學(xué)院自制,批號(hào)：20081126),葡聚糖硫酸鈉(DSS)(美國Sigma公司),SOD、MDA試劑盒(南京建成生物工程研究所),隱血試劑盒(北京科泰生物工程有限公司),聯(lián)苯胺(成都科龍化工廠)。低溫自動(dòng)平衡離心機(jī)(湖南衡陽儀器制造廠)。

1.3 溶液的配制 聯(lián)苯胺試液的配制：稱取適量的聯(lián)苯胺,加入冰醋酸,配成1%溶液,裝入棕色玻璃瓶中,避光保存;聯(lián)苯胺試液與3%H 2O2滴入量之比為1∶1。4%DSS水溶液的配制：稱取40 gDSS溶解于雙蒸水,并定容到1 000 mL。

2 方法

2.1 試驗(yàn)分組及造模 將BALB/c小鼠40只,隨機(jī)分成5組,每組 8只,分為正常組(A),模型組(B)、高劑量組 6 mg/kg(C)、中劑量組4 mg/kg(D)、低劑量組2 mg/kg(E),除正常組外均參照文獻(xiàn)采用DSS模型法對(duì)小鼠進(jìn)行造模。小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)2 d后,禁食12 h,開始試驗(yàn)。用3%DSS(分子量500 000)溶液給小鼠自由飲水,連續(xù)7 d。造模期間每天觀察小鼠性狀、飲食、毛發(fā)、活潑狀態(tài)等。模型建立成功的標(biāo)志為飲用3%DSS后出現(xiàn)半稀便、腹瀉、大便隱血(+)或肉眼血便中的任一癥狀。選取造模成功的小鼠隨機(jī)分入各組。模型制作成功后,即造模第8天開始灌胃C、D、E組。

2.2 給藥方法 參照Okayasu I[4]介紹的方法,對(duì)DSS的濃度進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)整：小鼠自由飲用 4%DSS水溶液,連續(xù)7 d。在這期間,每天定時(shí)稱量小鼠體重,進(jìn)行隱血試驗(yàn)和觀察糞便性狀。

對(duì)模型組自然死亡的或第8天頸椎脫臼處死小鼠,剪開腹腔,清理出結(jié)腸,沿腸系膜剖開,剪下結(jié)腸(直腸至升結(jié)腸),冰冷生理鹽水反復(fù)沖洗干凈,用清潔濾紙吸干水分。

3 觀察指標(biāo)與結(jié)果

3.1 對(duì)小鼠一般情況的影響 試驗(yàn)后第3～4天,造模小鼠出現(xiàn)腹瀉、飲食減少,體毛不光澤,第5～7天出現(xiàn)不同程度的肉眼血便,蜷縮,活動(dòng)減少,體重減輕。經(jīng)中藥治療1周,C、D、E組小鼠癥狀有不同程度改變,表現(xiàn)為食量增加,體重和毛澤漸漸恢復(fù),肉眼血便減少,其中C、D組無肉眼血便,可見松散大便。而正常對(duì)照組小鼠一般性狀無明顯改觀。

分別在實(shí)驗(yàn)第7、14天,將小鼠稱重,并放入代謝籠中,收集小鼠大便,記錄大便性狀,并取部分糞便,測(cè)定隱血。以Murthy S N等[5]稍加改良評(píng)價(jià)疾病活動(dòng)度(DAI),評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)按表 1進(jìn)行評(píng)分。DAI=(體重下降分?jǐn)?shù)+大便性狀分?jǐn)?shù)+分?jǐn)?shù))/3,結(jié)果用H檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

試驗(yàn)結(jié)果顯示,模型組DAI分?jǐn)?shù)最高,與香連滴丸高濃度組(C)、中濃度組(B)、低濃度組(E)比較有顯著性差異(P＜0.01),如圖1所示香連滴丸高濃度組DAI評(píng)分與中濃度組、低濃度組比較,有降低的趨勢(shì),但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

表1 疾病活動(dòng)度評(píng)分

圖1 香連滴丸對(duì)造模小鼠疾病活動(dòng)度的影響

3.2 生化指標(biāo)SOD及MDA的測(cè)定 結(jié)腸組織樣品制備：取結(jié)腸組織塊在冰冷生理鹽水中漂洗干凈,濾紙?jiān)嚫?準(zhǔn)確稱重后,立即用眼科剪剪碎組織塊,置于冰浴的玻璃勻漿器中,加入生理鹽水后勻漿,按重量體積比為1∶9加勻漿介質(zhì)制備成10%組織勻漿。然后將勻漿液用高速低溫離心機(jī)3 000 r/min離心15 min,取適量上清液進(jìn)行測(cè)定。

香連滴丸不同劑量組對(duì)4%DSS誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸組織SOD、MDA活性影響,如表2所示,與正常組比較,DSS模型組小鼠結(jié)腸組織SOD活性明顯下降(P＜0.01);香連滴丸高劑量組和中劑量組能有效阻遏SOD活性降低和低劑量作用無明顯差異。

DSS誘導(dǎo)模型組小鼠結(jié)腸黏膜組織中MDA含量顯著增多,提示DSS致小鼠結(jié)腸黏膜氧化損傷。香連滴丸各個(gè)劑量組均能減少M(fèi)DA的產(chǎn)生。

表2 香連滴丸不同劑量組對(duì)4%DSS誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸組織SOD和MDA活性影響

4 討論

UC是一種主要累及直腸、乙狀結(jié)腸黏膜,甚至全結(jié)腸和回腸末端黏膜的非特異性炎癥性疾患之一[6],DSS誘導(dǎo)的UC是一個(gè)重要模型,DSS破壞腸黏膜屏障,使黏膜組織凝固壞死,增加DSS的通透性,促進(jìn)DSS在結(jié)腸中擴(kuò)散,加重炎癥反應(yīng)[7]。該模型有操作簡(jiǎn)單、重現(xiàn)性好、造型時(shí)間短等特點(diǎn)。因此,比較適合該類藥物的研究與篩選。

UC屬中醫(yī)的“泄瀉”“久痢”“便血”等范疇,UC病機(jī)演變過程主要有三個(gè)典型時(shí)期,隨病程延長(zhǎng),其證型的演變規(guī)律,為濕熱蘊(yùn)積大腸(濕熱型);慢性間歇發(fā)作期為脾虛濕熱并存(虛實(shí)夾雜);慢性持續(xù)嚴(yán)重期為脾腎氣血俱虧。根據(jù)中獸醫(yī)理論,香連滴丸方中黃連清熱燥濕,治熱痢,具有免疫調(diào)節(jié)作用;行氣止痛,木香具有和胃消脹,止瀉。調(diào)節(jié)胃腸運(yùn)動(dòng),抗消化性潰瘍,促進(jìn)膽囊收縮的作用,通過長(zhǎng)期健脾補(bǔ)腎,可以影響神經(jīng)內(nèi)分泌網(wǎng)絡(luò),調(diào)節(jié)激素神經(jīng)遞質(zhì)細(xì)胞因子的變化與基因表達(dá),從而影響活性物質(zhì)的釋放,改善機(jī)體免疫失衡狀態(tài)。

試驗(yàn)結(jié)果表明,香連滴丸可明顯降低小鼠DAI評(píng)分,緩解臨床癥狀。DSS模型組小鼠結(jié)腸組織SOD活性明顯下降(P＜0.01);香連滴丸高劑量組和中劑量組能有效阻遏SOD活性降低。DSS誘導(dǎo)模型組小鼠結(jié)腸黏膜組織中MDA含量顯著增多,提示DSS致小鼠結(jié)腸黏膜氧化損傷。香連滴丸各個(gè)劑量組均能減少M(fèi)DA的產(chǎn)生。本試驗(yàn)結(jié)果表明,香連滴丸可以緩解臨床癥狀。提示香連滴丸對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎有一定治療作用。

[1] van K ruiningen H.The ultra structure of macrophages in granulomatous colitis of boxer dogs[J].Veterinary Pathology,1975,12：446-459.

[2] Arai K.Granulomatous colitisin a Boxer dog[J].Journal of the Japanese Veterinary Medical Association,1983,36：29-33.

[3] van Kruiningen H.Granulomatous colitis of boxer dogs comparative aspects[J].Gastroenterology,1967,53：114-122.

[4] Okayasu I,Hatakeyama S,Yamada M,et al.A novel method in the induction of reliable experimental acute and chronic ulcerative colitis in mice[J].Gastroenterology,1990,98：694-702.

[5] Murthy S N,Cooper H S,Shim H,et al.Treatment of dextral sulfate sodium-induced marine colitis by intracolonic cyclosporine[J].Dig Dis Sci,1993,38：1722-1734.

[6] 周玲玲,方泰惠.復(fù)方苦參膠囊對(duì)二硝基氯苯所致豚鼠潰瘍性結(jié)腸炎的保護(hù)作用[J].南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2004,20(2)：107-109.

[7] 劉穎,王瑩.甘草酸二銨抗大鼠潰瘍性結(jié)腸炎作用及相關(guān)機(jī)制研究[J].中國新藥雜志,2007,16(24)：2027-2031.