程富勝,胡振英,辛蕊華,羅永江,董鵬程

(中國農業(yè)科學院蘭州畜牧與獸藥研究所新獸藥工程重點實驗室,甘肅蘭州730050)

鴉膽子味苦,性寒,有毒,傳統(tǒng)上治療休息痢和瘧疾等,現(xiàn)代藥理研究證實鴉膽子具有殺滅阿米巴原蟲、抗瘧、抗寄生蟲、抗腫瘤、降低血壓等作用[1]。一氧化氮(NO)的基本生物學作用之一是在細胞間信息交換中起作用。研究表明,是NO作用于靶細胞并在鳥苷酸環(huán)化酶(GC)的作用下產(chǎn)生的主要第二信使,進而環(huán)磷酸鳥苷(cGMP)通過下游許多分子發(fā)揮NO的作用[2]。NO的作用方式獨特,它代表一類新的細胞信使分子,是“氣體性、親脂性”的,這種特性與NO可能具有的廣泛生物學功能有很大的相關性。資料表明,L-Arg-NO-cGMP通路在人類和動物多種組織和細胞中廣泛存在,它代表著一種細胞間信息傳遞和細胞功能調節(jié)的新的信號傳導機制[3]。本試驗通過研究鴉膽子提取物對脾淋巴細胞內NO、cGMP含量的變化,分析了鴉膽子提取物對NO-cGMP信號系統(tǒng)的影響,為研究鴉膽子抗寄生蟲提供理論依據(jù)。

1 試驗材料

1.1 藥物 鴉膽子提取由課題組提取、分離、純化。

1.2 實驗動物 昆明系小鼠,體重18～22 g,雄性,健康;由甘肅省腫瘤醫(yī)院實驗動物中心提供。

1.3 主要儀器和試劑 RPMI-1640粉劑(Gibco),cGMP放射免疫試劑盒購自上海醫(yī)科大學,Griess試劑、1 mmol/L NaNO2標準液為國產(chǎn)分析純。島津UV-3000紫外可見光分光光度計,智能放免γ-測量儀(SN-695B型,上海原子核研究所日環(huán)儀器一廠)。

1.4 應用SPSS 11.0軟件進行組間t檢驗,進行差異性比較。

2 試驗方法

2.1 細胞培養(yǎng)及處理 按照脾淋巴細胞的提取方法[4]進行細胞懸液的制備,用臺盼藍拒染法進行活細胞的測定,使活細胞數(shù)大于95%,調節(jié)細胞的濃度為5×106個/mL,分裝于培養(yǎng)瓶,試驗分5個組,即為空白對照組(為提取的淋巴細胞),藥物組(鴉膽子提取物濃度依次為 80μg/mL、120μg/mL、240 μg/mL),每組加脾淋巴細胞懸液3 mL,鴉膽子提取物按所需量加入,在37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中分別孵育4 h、8 h、12 h、24 h后。按照試驗要求分別收集不同培養(yǎng)時間的細胞及其上清液,備用。

2.2 細胞內cGMP的測定 將備用細胞,調節(jié)濃度為1×106個/mL。取 1 mL,1 500 r/min離心5 min,棄去上清液,細胞沉淀加1 mL 50 mmol/L的醋酸緩沖液(pH值4.75),混懸,反復凍融細胞3～4次,3 000 r/min離心15 min,取上清液100μL按照試劑盒操作說明書進行測定。

2.3 細胞內一氧化氮含量的測定(Griess法)[5]在p H值7.5～8.1條件下,溶液中的NO2-可與對氨基苯磺酸發(fā)生重氮化,再與N-(1-萘基)-乙二胺偶聯(lián),生成紫紅色產(chǎn)物,該產(chǎn)物在550 nm存在較大吸收峰。將其在550 nm比色,吸光度值的大小與NO2-的含量或一氧化氮(NO)的產(chǎn)量成正比,據(jù)此可檢測NO的生成量。

2.3.1 標準曲線制作 以NaNO2為標準,取 0、5、10、25、50、100、160、200、250 μmol/L 濃度梯度作標準曲線,進行標準曲線的測定。

2.3.2 細胞培養(yǎng)4 h、8 h、12 h、24 h后,收集細胞,1 500 r/min離心5 min,取上清液在550 nm處讀取吸光度值。根據(jù)標準曲線方程計算樣品中NO2-的含量。

3 結果

3.1 鴉膽子提取物對細胞內 cGMP的影響 見表1。

濃度為50μg/mL和100μg/mL的鴉膽子提取物組8 h和24 h細胞內cGMP的含量較高,200 μg/mL藥物組在12 h開始下降,與空白無差異性。

3.2 鴉膽子提取物提高脾淋巴細胞內的一氧化氮含量結果 見表2。

在表2中,隨著鴉膽子提取物濃度的遞增,細胞產(chǎn)生的NO的含量在遞增,而隨著培養(yǎng)時間的延長,細胞產(chǎn)生的NO的含量也在遞增,在時間與濃度雙因素作用下,細胞產(chǎn)生的NO的含量均呈正相關。

表1 鴉膽子提取物對細胞內cGMP的影響 (pg/10 m L)

表2 鴉膽子提取物對脾淋巴細胞產(chǎn)生NO的影響 (μmol/L)

4 討論

環(huán)核苷酸是重要的細胞內信使物質,它們參與調控各種激素、神經(jīng)遞質等所導致的各種生命活動。cGMP是三磷酸鳥苷(GTP)在鳥苷酸環(huán)化酶(GC)作用下水解產(chǎn)生的。NO也可以通過激活鳥苷酸環(huán)化酶,導致細胞內 cGMP增加[6]。最新的研究發(fā)現(xiàn),細胞信號轉導中存在NO-cGMP通路[7]。NO-cGMP是細胞內NO和cGMP相互作用的機制之一,為了考察鴉膽子提取物對兩者的作用,不僅要從單方面研究,而且更重要的是要結合NO-cGMP這一系統(tǒng)機制進行研究。

從鴉膽子提取物對細胞內NO影響結果看,鴉膽子提取物對細胞內NO的產(chǎn)生具有明顯的調節(jié)作用,不論從培養(yǎng)時間還是藥物濃度方面,鴉膽子提取物具有雙因子調節(jié)功能,并呈時間和濃度的正相關關系。NO可以通過廣泛的信號途徑來實現(xiàn)其對細胞的功能進行調節(jié),如NO通過MAPK途徑啟動不同的信號通路,改變機體相應的功能[8];cGMP是NO作用于細胞的主要信號通路[9],低濃度的NO作用于可溶性鳥苷酸環(huán)化酶,升高胞間的cGMP,介導PDES,離子通道和蛋白激酶G發(fā)揮其相應的生理作用[10]。雖然細胞中NO含量在試驗中隨著濃度和時間在遞增,但存在著一定的活性范圍。本試驗提示應以cGMP的水平來確定影響NO產(chǎn)生的鴉膽子提取物的濃度。

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