蘇志堅(jiān),龐 義,李廣宏*,張敏靜,林健聰,黃亞東,3

(1.中山大學(xué)有害生物控制與資源利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/昆蟲學(xué)研究所,廣州 510275;2.廣州暨南大學(xué)醫(yī)藥生物技術(shù)研究開發(fā)中心,廣州 510632;3.基因工程藥物國(guó)家工程中心,廣州 510632)

家蠅 Musca domestica L.是一種分布廣泛、數(shù)量眾多、與人畜接觸頻繁的雙翅目昆蟲,既可以作為經(jīng)濟(jì)昆蟲大規(guī)模人工飼養(yǎng)以獲取優(yōu)質(zhì)動(dòng)物蛋白(郎躍深,2009),同時(shí)也是傳播傷寒、痢疾、霍亂、鼠疫、炭疽等多種嚴(yán)重疾病的重要媒介之一(Grubel et al.,1997;Zimmerman et al.,1989;Zurek et al.,2001)。在自然界,家蠅幼蟲大多生活在富含微生物群落的諸如動(dòng)物尸體、排泄物、生活垃圾以及食品等有機(jī)基質(zhì)中。而基質(zhì)中的微生物群落,尤其是細(xì)菌,對(duì)其生存、生長(zhǎng)和發(fā)育起著關(guān)鍵性作用(Zurek et al.,2000;Graczyk et al.,2001;Moon,2002)。研究資料表明,家蠅幼蟲在完全無菌的環(huán)境中不能發(fā)育至 3齡(Gerberich,1948;Schmidtmann and Martin,1992)。然而,在培養(yǎng)基中添加活的或者死的細(xì)菌均能使幼蟲完成整個(gè)生活史(Greenberg,1954;Levinson,1960)。目前,關(guān)于細(xì)菌支持家蠅幼蟲生長(zhǎng)發(fā)育的真正機(jī)制尚未清楚,一種解釋是細(xì)菌在幼蟲腸道中為其提供維生素以及固醇類等生長(zhǎng)必需物質(zhì)(Bergmann and Levinson,1954;Brookes and Fraenkel,1958;Chang and Wang,1958);另一種解釋是細(xì)菌分解幼蟲生活環(huán)境中的有機(jī)物質(zhì)(Zurek et al.,2000;Moon,et al.,2001);還有一解釋種就是細(xì)菌直接作為幼蟲食物(Levinson,1960;Rochon et al.,2004)。

并不是所有的細(xì)菌都能支持家蠅幼蟲的生長(zhǎng)發(fā)育,且不同種類的細(xì)菌及細(xì)菌群落對(duì)幼蟲的存活率、化蛹率、蛹重及羽化率都有不同的影響。Schmidtmann和 Martin(1992)在血瓊脂平板上分別接種 9種細(xì)菌,結(jié)果發(fā)現(xiàn),家蠅幼蟲的化蛹率在 0～69%之間,而羽化率則在 0～54%之間。Zurek等(2000)將不同細(xì)菌接種到胰化酪蛋白大豆卵黃瓊脂(Trypticase Soy Egg Yolk Agar,TSEYA)培養(yǎng)基中,然后接入無菌幼蟲進(jìn)行培養(yǎng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),24種細(xì)菌當(dāng)中,共有 8種(Morganella morganii,Providencia rettgerii,Serratia marcescens,Providencia stuartii,Microbacterium barkei,Xanthobacter flavus,Corynebacterium seminale,Gordona amarae)不能支持幼蟲的生長(zhǎng),而其余細(xì)菌對(duì)幼蟲的化蛹率、蛹重以及羽化率的影響則分別為 6.67%～93.3%、11.8～24.2 mg和 0 ～ 91.5%。 Rochon等(2004)將 Empedobacter brevis、Flavobacterium odoratum和 Escherichia coli等量混合,然后接種到 TSEYA培養(yǎng)基中,結(jié)果發(fā)現(xiàn),家蠅幼蟲在這種培養(yǎng)基中的存活率、化蛹率、生長(zhǎng)時(shí)間及蛹重均顯著優(yōu)于單獨(dú)接種 E.coli,這個(gè)研究也說明多種不同細(xì)菌群落可以為幼蟲提供更為充分的營(yíng)養(yǎng)。

家蠅幼蟲可以在動(dòng)物糞便、米糠、奶粉、酒糟及麥麩等培養(yǎng)料中進(jìn)行飼養(yǎng)(Spiller,1964)。麥麩因其產(chǎn)量大、價(jià)格低廉、處理方便以及無寄生螨等特點(diǎn),自 Richardson(1932)報(bào)道以來就成為人工飼養(yǎng)家蠅的主要材料。然而,家蠅幼蟲對(duì)麥麩的利用率非常低,一般情況下料蟲比僅為 3：1(彭宇等,1996)。此外,盡管剩余麥麩的營(yíng)養(yǎng)組成與新鮮麥麩相差不大,但并不能繼續(xù)用于家蠅幼蟲、牲畜以及家禽等的飼養(yǎng)。由于家蠅幼蟲在生長(zhǎng)發(fā)育過程中可以利用細(xì)菌作為食物且沒有選擇性,而一些細(xì)菌又不支持幼蟲的生長(zhǎng)發(fā)育(Zurek et al.,2000;Schmidtmann and Martin,1992;Watson et al.,1993;Rochon et al.,2004;Lysyk et al.,1999;Peck and Walton,2006)。因此,篩選培養(yǎng)基中可以支持幼蟲生長(zhǎng)的各種細(xì)菌以及了解細(xì)菌中不同營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)對(duì)幼蟲生長(zhǎng)發(fā)育影響對(duì)今后開展低成本集約化生產(chǎn)家蠅幼蟲和進(jìn)行特種經(jīng)濟(jì)動(dòng)物生態(tài)養(yǎng)殖具有重要的作用。

1 材料與方法

1.1 麥麩中細(xì)菌分離方法

取 10 g小麥麩(購(gòu)自廣州市南方面粉廠,批號(hào)：20070325),加入無菌去離子水 40 mL,在超凈臺(tái)內(nèi)充分?jǐn)嚢杌靹蚝?4℃靜置 16 h。然后,紗布過濾,收集上清。將該上清液按 10倍進(jìn)行系列稀釋(10-2～10-8),各取 1 mL在 SOC瓊脂平板中進(jìn)行涂布(100μL/板),30℃,培養(yǎng) 24 h。按照單菌落的形態(tài)、大小、色澤、透光度、革蘭氏染色、活動(dòng)能力、氧化能力以及催化能力等指標(biāo)進(jìn)行挑選分離(Garcia et al.,1998)。

1.2 不同細(xì)菌 16Sr RNA鑒別方法

將初步分離的各種細(xì)菌單克隆接種到 LB培養(yǎng)基中,220 rpm,30℃,培養(yǎng) 16 h。然后,利用基因組DNA抽提試劑盒(Qiagen,Cat.#51504,Germany)獲得各種菌株的基因組 DNA。合成上下游引物63 F(5'-CAGGCCTAACACATGCAAGTC-3')和1387 R(5'-GGGCGGTGTGTACAAGGC-3')(Acinas et al.,2004),并建立標(biāo)準(zhǔn)的 PCR體系(50μL體積)：10×PCR buffer 5μL,dNTP(各 2.5 mM)4μL,63F(10μM)2.5μL,1387R(10μM)2.5μL,DNA 聚 合 酶 (Hotstart,5 U/μL,Qiagen,Cat.#203603,Germany)0.25 μL,模板 DNA 1μL(100 ng/μL),滅菌水 34.75μL。然后,進(jìn)行 PCR擴(kuò)增(95℃,5 min,1個(gè)循環(huán);94℃,30 s;55℃,30 s;72℃,1.5 min;25個(gè)循環(huán);72℃,10 min,1個(gè)循環(huán))。1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),割膠回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。將回收片段克隆到 T-載體(pGEMT,Cat.#1380,Promega,USA)上,再轉(zhuǎn)化到大腸桿菌 JM109中,氨芐青霉素抗性篩選重組子并送上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序。獲得的序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)分析(www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)。

1.3 不同細(xì)菌對(duì)家蠅幼蟲生長(zhǎng)發(fā)育影響的測(cè)定

本實(shí)驗(yàn)中所使用的家蠅成蟲及幼蟲均取自中山大學(xué)有害生物控制與資源利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,并在溫度為 25～30℃,濕度為 70%～90%及光周期 L：D=16：8 h的條件下飼養(yǎng)。TSEYA培養(yǎng)基的配制參考 Watson等(1993)方法。

1.3.1 家蠅卵的表面消毒

取 500～700個(gè)卵,在超凈臺(tái)內(nèi),將卵放入平皿中,加入預(yù)冷的(15℃)無菌水 29.688 mL,然后緩慢加入 312μL 30%次氯酸鈉溶液(廣州化學(xué)試劑廠,AR),快速攪拌混勻,并靜置 15 min。用吸管收集卵,無菌水洗滌 3～ 4次后,置于滅菌濾紙上,再放入平皿中,Parafilm膜封口。28℃,70%～90%濕度培養(yǎng) 12～14 h至幼蟲孵化。

1.3.2 細(xì)菌在培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)速度以及 pH變化。

將各種細(xì)菌接種到胰化酪蛋白大豆卵黃液體培養(yǎng)基中,220 rpm,37℃,培養(yǎng) 16 h后測(cè)量其 pH值。再將各種細(xì)菌接種于液體 LB培養(yǎng)基中,220 rpm,37℃,培養(yǎng) 16 h,取 1 mL培養(yǎng)液,離心收集沉淀,無菌水洗滌 3次后稱重。實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3次。

1.3.3 家蠅幼蟲在細(xì)菌培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)發(fā)育

將已鑒定的各種細(xì)菌分別接種到 LB液體培養(yǎng)基中,220 rpm,37℃,搖瓶震蕩培養(yǎng) 14～16 h后測(cè)量其 OD595值。然后用滅菌水稀釋至 OD595=0.250±0.02。在 TSEYA培養(yǎng)基中各加入 100μL菌液,每種菌接 3瓶。對(duì)照組中加入等量的無菌水。用滅菌毛筆挑取剛孵化的無菌幼蟲(蟲齡＜8 h),接種到含不同細(xì)菌的 TSEYA培養(yǎng)基中(10～12頭 /瓶),28±0.5℃,70% ～80%的濕度及光周期 L：D=16：8 h的條件下飼養(yǎng)至化蛹為止,每天觀察 3次。實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3次。

1.4 單純細(xì)菌作為食物對(duì)家蠅幼蟲生長(zhǎng)發(fā)育影響的測(cè)定

將各種細(xì)菌分別接種到 250 mLLB液體培養(yǎng)基中,220 rpm,37℃,搖瓶震蕩培養(yǎng) 16 h,然后轉(zhuǎn)入到5 L發(fā)酵罐中進(jìn)行培養(yǎng)。4℃,12000 rpm(13920 xg)離心 5 min收集菌體,用無菌水洗滌菌體 4～5次后,稱重,用去離子水稀釋至終濃度為 100 mg/mL。在 100 mL三角瓶中,放入一塊滅菌棉墊(r=2.5 cm,h=0.3 cm),然后加入 3 mL菌液。接入無菌幼蟲(15頭/瓶),在 28±0.5℃,濕度為 70%～80%以及光周期 L：D=16：8 h的條件下進(jìn)行飼養(yǎng)。每 2天更換一次含新鮮菌液的棉墊。每天觀察 3次。實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3次。

1.5 細(xì)菌的氨基酸、脂肪酸以及維生素 B3含量的檢測(cè)

按照 1.4制備枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、成團(tuán)腸桿菌、大腸桿菌、奇異變形桿菌、香味類香味菌,連同家蠅幼蟲以及麥麩在 110℃處理 10 h后,用凱氏定氮法、酸水解法以及氣相 -質(zhì)譜連用法分別測(cè)定總氮、各種氨基酸以及脂肪酸含量。利用 HPLC方法測(cè)定細(xì)菌和蛋黃的維生素 B3含量。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

幼蟲生長(zhǎng)時(shí)間、化蛹率、蛹重、成蟲羽化率等數(shù)據(jù)均取平均值。所有數(shù)據(jù)均用 SAS軟件包(ver10.0;SASinstitute,Cary,North Carolina,U.S.A)處理,p＜0.05表示有差異,p＜0.01有顯著差異,p＞0.05為無差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 麥麩中細(xì)菌種類的鑒定

從麥麩中分離出的細(xì)菌,通過形態(tài)學(xué)、16S rRNA序列的擴(kuò)增、測(cè)序以及將序列拼接后與 NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)比較,一共有 13種細(xì)菌,屬于 7個(gè)目 9個(gè)科12個(gè)屬：分別為金黃色葡萄球菌 Staphylococcus aureus、枯草芽孢桿菌 Bacillus subtilis、松鼠葡萄球菌Staphylococcus sciuri、成團(tuán)腸桿菌 Pantoea agglomerans、聚團(tuán)腸桿菌 Enterobacter agglomerans、大腸桿菌Escherichia coli、香味類香味菌 Myroides odoratimimus、奇異變性桿菌 Proteus mirabilis、醋酸鈣不動(dòng)桿菌 Acinetobacter calcoaceticus、藤黃八疊球菌Micrococcus luteus、嗜水汽單胞菌 Aeromonas hydrophila、銅綠假單胞菌 Pseudomonas aeruginosa和解糖腸球菌 Enterococcus saccharolyticus(表 1)。金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌及大腸桿菌都是人們所熟知的重要人類條件致病菌。聚團(tuán)腸桿菌又稱聚團(tuán)多源菌,該菌能引起人體呼吸系統(tǒng)、血液、腸道等發(fā)生感染。成團(tuán)腸桿菌是一種符合腸桿菌定義的產(chǎn)類胡蘿卜素的黃色菌群,可以引起人類發(fā)生敗血癥。藤黃八疊球菌為革蘭氏陽性菌,是生乳和乳制品中常見的污染菌。醋酸鈣不動(dòng)桿菌主要分布在水體和土壤中,該菌粘附力極強(qiáng),能引起人體皮膚、泌尿生殖系統(tǒng)以及腦部發(fā)生感染?？莶菅挎邨U菌是革蘭氏陽性需氧菌,作為 α-淀粉酶、中性蛋白酶以及角蛋白酶的重要生產(chǎn)菌而廣泛應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)中。香味類香味菌屬革蘭染色陰性菌,可分解甘露醇,發(fā)酵糖的能力緩慢而微弱。奇異變形桿菌廣泛存在于水、土壤腐敗的有機(jī)物以及人和動(dòng)物的腸道中,為條件致病菌,可引起敗血癥、創(chuàng)傷感染、膀胱炎、以及食物中毒等。嗜水氣單胞菌為革蘭氏陰性菌,普遍存在于淡水、污水、淤泥、土壤和人類糞便中。該菌也是一種條件致病菌,對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物、畜禽和人類均有致病性,是一種典型的人 -畜 -魚共患病原菌,可引起多種水產(chǎn)動(dòng)物的敗血癥和人類腹瀉(Garrity,2008)。需要指出的是,不同產(chǎn)地或不同條件下加工處理的麥麩,其所含細(xì)菌的種類和數(shù)量也可能有較大不同。

表 1 從麥麩中分離的細(xì)菌種類*Table 1 The bacterial species isolated from wheat bran

2.2 不同細(xì)菌在培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)速度以及 p H變化

在所測(cè)定的 12種細(xì)菌中,醋酸鈣不動(dòng)桿菌是生長(zhǎng)最快的一種(表 2)。培養(yǎng) 16 h后,菌體平均生長(zhǎng)量可達(dá)到 63.75±1.25 g/L。隨后依次為藤黃八疊球菌、松鼠葡萄球菌、銅綠假單胞菌、嗜水汽單胞菌、聚團(tuán)腸桿菌、成團(tuán)腸桿菌、大腸桿菌、奇異變性桿菌、枯草芽孢桿菌和香味類香味菌。金黃色葡萄球菌則是生長(zhǎng)得最慢的一種,培養(yǎng) 16 h后,菌體平均生長(zhǎng)量?jī)H為 8.40±0.17 g/L。大多數(shù)的細(xì)菌生長(zhǎng) 16 h后,與對(duì)照組相比,培養(yǎng)基的pH值維持不變或者略高。堿性最強(qiáng)的是奇異變形桿菌,其培養(yǎng)基的 pH值能達(dá)到 8.23。銅綠假單胞菌和嗜水汽單胞菌在生長(zhǎng)過程中會(huì)產(chǎn)酸,從而導(dǎo)致培養(yǎng)基呈酸性,后者培養(yǎng) 16 h后培養(yǎng)基的 pH值低至 5.52。從表 2可知,盡管在生長(zhǎng)過程中各項(xiàng)指標(biāo)有所不同,然而幼蟲在分別接種這 12種細(xì)菌的培養(yǎng)基中均能完成整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育周期。這一結(jié)果說明了從麥麩中分離出的細(xì)菌,盡管其生長(zhǎng)量存在差異,且其在生長(zhǎng)過程中對(duì)環(huán)境 pH值也有一定的影響,但這些變化均不會(huì)阻礙幼蟲完成整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育過程。此外,由于解糖腸球菌在這種培養(yǎng)基生長(zhǎng)極其緩慢,因此沒有測(cè)定該株細(xì)菌。

表 2 麥麩中不同細(xì)菌對(duì)家蠅幼蟲生長(zhǎng)發(fā)育的影響Table 2 Development of M.domestica larvae on trypticase soy egg yolk agar inoculated with different bacterial species isolated from wheat bran

2.3 家蠅幼蟲在細(xì)菌 -TSEYA培養(yǎng)基中生長(zhǎng)發(fā)育的情況

麥麩中分離出來的 12種細(xì)菌都能支持家蠅幼蟲的生長(zhǎng)發(fā)育,但其對(duì)幼蟲歷期、蛹重、化蛹率以及羽化率的影響是不一樣的。在幼蟲歷期方面,幼蟲在接種香味類香味菌的 TSEYA培養(yǎng)基中平均生長(zhǎng)時(shí)間最短,僅需 97.61±1.14 h,而取得與此相近結(jié)果的有生長(zhǎng)在接種醋酸鈣不動(dòng)桿菌、嗜水汽單胞菌及大腸桿菌 TSEYA培養(yǎng)基中的幼蟲,它們的幼蟲歷期均顯著短于接種其余 8種細(xì)菌的 TSEYA培養(yǎng)基中的幼蟲(p＜0.001)。而幼蟲歷期最長(zhǎng)的是在接種藤黃八疊球菌的 TSEYA培養(yǎng)基中的幼蟲,完成整個(gè)過程需要 133.95±1.87 h(表 2)。這一結(jié)果也說明,幼蟲生長(zhǎng)速度并不與細(xì)菌生長(zhǎng)量呈正相關(guān)。在化蛹率方面,幼蟲在接種醋酸鈣不動(dòng)桿菌和松鼠葡萄球菌的 TSEYA培養(yǎng)基中具有最高的平均化蛹率,分別達(dá)到 86.81%和 85.15%。奇異變形桿菌和成團(tuán)腸桿菌對(duì)幼蟲的生存有明顯的影響,部分幼蟲在3齡期間死亡,死蟲通體發(fā)黑(資料沒顯示)。幼蟲在接種這兩種細(xì)菌的 TSEYA培養(yǎng)基中的平均化蛹率僅為 42.22%和 35.56%,顯著低于其它 10種細(xì)菌(p＜0.001)。在蛹重方面,從接種嗜水汽單胞菌的 TSEYA培養(yǎng)基中得到的蠅蛹平均重量達(dá)到20.15±0.23 mg,顯著高于除成團(tuán)腸桿菌以外的接種其它細(xì)菌 TSEYA培養(yǎng)基中得到的蠅蛹重量(p＜0.001)。而幼蟲在接種金黃色葡萄球菌的 TSEYA培養(yǎng)基中生長(zhǎng)情況并不理想,其平均蛹重僅為15.94±0.21 mg。除銅綠假單胞菌外(羽化率僅為60.87%)(p＜0.001),其余的細(xì)菌對(duì)成蟲羽化不會(huì)造成明顯的影響(羽化率在 84.33%～97.47%之間)。在對(duì)照組中,所有幼蟲發(fā)育均不能超過 2齡,兩周后全部死亡。

2.4 單純細(xì)菌作為食物對(duì)家蠅幼蟲生長(zhǎng)發(fā)育的影響

在所有測(cè)試的細(xì)菌中,只有枯草芽孢桿菌、香味類香味菌、聚團(tuán)腸桿菌及成團(tuán)腸桿菌能支持幼蟲順利完成整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育過程。幼蟲以枯草芽孢桿菌作為食物,僅需 169.44±1.30 h就進(jìn)入蛹期。而以香味類香味菌和成團(tuán)腸桿菌為食物的幼蟲生長(zhǎng)需要的時(shí)間較長(zhǎng),進(jìn)入蛹期的時(shí)間分別為 210.24±2.08和 204.24±1.67 h(表 3)。食用聚團(tuán)腸桿菌、成團(tuán)腸桿菌及香味類香味菌的幼蟲化蛹后,其蛹重均顯著優(yōu)于以枯草芽孢桿菌為食物的幼蟲化蛹后的蛹重(p＜0.001),然而在成蟲羽化率方面,卻顯著低于后者(p＜0.001)。而以這 4種細(xì)菌作為食物,其幼蟲在存活率差異不顯著。此外,盡管醋酸鈣不動(dòng)桿菌和松鼠葡萄球菌也能支持大部分幼蟲生長(zhǎng)發(fā)育到 3齡,但均在幼蟲化蛹前全部死亡。其余細(xì)菌組及對(duì)照組的幼蟲在 24～36 h內(nèi)全部死亡。

表 3 單純一種細(xì)菌對(duì)家蠅幼蟲生長(zhǎng)發(fā)育的影響Table 3 The development of M.domestica larvae on different bacterial cultures

上述這些結(jié)果表明,部分細(xì)菌可以為家蠅幼蟲提供其生長(zhǎng)發(fā)育過程中所需要的全部營(yíng)養(yǎng),包括維生素、蛋白質(zhì)以及必需脂肪酸,但細(xì)菌中所含營(yíng)養(yǎng)成分的差異對(duì)幼蟲生長(zhǎng)發(fā)育的影響也有所不同。蛹重是反映幼蟲生長(zhǎng)發(fā)育是否良好的重要指標(biāo),從表 3可知,香味類香味菌、聚團(tuán)腸桿菌以及成團(tuán)腸桿菌中所含有的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)較枯草芽孢桿菌的更能適合家蠅幼蟲的生長(zhǎng)。此外,通過與表 2中蛹重指標(biāo)比較后發(fā)現(xiàn),以細(xì)菌作為唯一食物的幼蟲,化蛹后的蛹重遠(yuǎn)小于生長(zhǎng)在接種相同細(xì)菌的 TSEYA培養(yǎng)基中幼蟲化蛹后的蛹重,這一結(jié)果表明細(xì)菌分解生活環(huán)境中的有機(jī)物質(zhì)及其提供的各種營(yíng)養(yǎng)對(duì)家蠅幼蟲的生長(zhǎng)發(fā)育也具有十分重要的作用。

2.5 細(xì)菌的氨基酸、脂肪酸以及維生素 B3含量的檢測(cè)

為了了解不同細(xì)菌之間營(yíng)養(yǎng)成分的差異,本研究根據(jù)前面實(shí)驗(yàn)結(jié)果挑選 6種細(xì)菌并對(duì)其氨基酸、脂肪酸以及維生素 B3含量進(jìn)行了檢測(cè)。據(jù)報(bào)道,家蠅幼蟲在生長(zhǎng)過程中需要多種 B族維生素(郎躍深,2009)。在 TSEYA培養(yǎng)基中,卵黃可以提供多種 B族維生素,只有維生素 B3的含量極低(100 ug/kg)(Food Standards Agency,2002),遠(yuǎn)少于家蠅幼蟲生長(zhǎng)所需(Levinson,1960)。本研究所挑選的細(xì)菌則均能提供大量的維生素 B3(0.105～1.08 g/kg),可以滿足幼蟲新陳代謝所需(表 4)。

表 4 各種細(xì)菌和家蠅幼蟲中總氮、氨基酸以及維生素 B3含量的測(cè)定Table 4 The amino acid composition,vitamin B3 and total nitrogen of bacterial species and housefly larvae

6種細(xì)菌當(dāng)中,大腸桿菌含總氮量最高,平均達(dá)到 15.1±1.06%,其次是奇異變形桿菌和枯草芽孢桿菌,香味類香味菌含總氮量最低,僅為 7.4±0.36%。在氨基酸總量方面,大腸桿菌以及奇異變形桿菌含量最高,每百克樣品分別含有為 60.533±0.26 g和 60.368±0.365 g氨基酸,而金黃色葡萄球菌含量最低,只有 41.651±0.558 g。由于昆蟲必須從食物中攝取包括組氨酸、精氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、色氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸和苯丙氨酸在內(nèi) 10種必需氨基酸以維持其生長(zhǎng)發(fā)育的需要(Genc,2006),因此,本研究進(jìn)一步比較了這些細(xì)菌中含有昆蟲必需氨基酸的含量與總氨基酸之間的比例(表 4)。結(jié)果顯示,比例最高的是香味類香味菌和枯草芽孢桿菌,它們與幼蟲之間的比例沒有顯著差異,但顯著高于其它細(xì)菌(p＜0.01)。比例最低的是金黃色葡萄球菌,僅為 32.80±0.42%。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明,細(xì)菌中含有的昆蟲必需氨基酸含量與總氨基酸含量之間的比例與蛹重呈正相關(guān)(r=0.8324;F=14.90,t=3.86,p=0.031),但與幼蟲生長(zhǎng)時(shí)間(r=0.7355;F=8.344,t=2.88,p=0.063)以及化蛹率(r=0.2265;F=0.8782,t=0.937,p=0.418)沒有相關(guān)性,這一結(jié)果暗示,能支持幼蟲生長(zhǎng)發(fā)育的細(xì)菌,其含有的昆蟲必需氨基酸含量與幼蟲的生長(zhǎng)質(zhì)量可能有關(guān),但與其發(fā)育成功率(successful development)沒有關(guān)系。

家蠅幼蟲可以通過氧化食物中的脂肪酸來為其生長(zhǎng)發(fā)育提供能量,此外,食物中的多種脂肪酸對(duì)昆蟲成蟲羽化以及提供能量方面具有顯著作用(郎躍深,2009)。在總脂肪方面,大腸桿菌含量最高,達(dá)到 168 mg/g(wet weight),其次是成團(tuán)腸桿菌和香味類香味菌,分別為115.8 mg/g和103.4 mg/g;含量最少的還是金黃色葡萄球,僅為 92.6 mg/g。在飽和脂肪酸方面,金黃色葡萄球菌具有最高的含量,達(dá)到 76.38%,其次是大腸桿菌和枯草芽孢桿菌,最少的是香味類香味菌,僅為40.34%。家蠅幼蟲體內(nèi)含有大量的不飽和脂肪酸,達(dá)到60.83%,其中,C16：1(n-7)、C18：1(n-9)以及 C18：2(n-6)含量最高。香味類香味菌以及成團(tuán)腸桿菌有著相似的含量,分別為 56.79%和 51.9%,也含有大量的 C16：1(n-7)和 C18：1(n-9)。所有 6種細(xì)菌均能提供亞麻酸(0.071% ～1.68%),一種昆蟲必需脂肪酸。盡管枯草芽孢桿菌含有極少的不飽和脂肪酸,僅占總磷脂值的 0.4%,然而其含有大量的支鏈脂肪酸(42.16%),且種類和所占的比例與幼蟲體內(nèi)的相當(dāng)(表 5)。

表 5 6種細(xì)菌中不同脂肪酸的含量Table 5 Fatty acid percentage composition of six strain bacterium from wheat bran*

(續(xù)上表)

3 結(jié)論與討論

細(xì)菌對(duì)家蠅幼蟲的生長(zhǎng)發(fā)育起著關(guān)鍵性的作用,但并不是所有的細(xì)菌都能支持蠅科幼蟲的生長(zhǎng)發(fā)育。Lysyk等(1999)在 TSEYA培養(yǎng)基中測(cè)試了 5種細(xì)菌對(duì)廄蠅幼蟲生長(zhǎng)發(fā)育的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)幼蟲在接種 Serratia marcesecns以及 Aeromonas sp.的培養(yǎng)基中不能生長(zhǎng),而這兩種細(xì)菌被證明是昆蟲條件致病菌。Zurek等(2000)在 TSEYA培養(yǎng)基中測(cè)試了 24種從火雞糞以及青貯玉米(corn silage)中分離的細(xì)菌對(duì)家蠅幼蟲影響,幼蟲在接種其中 8種細(xì)菌的培養(yǎng)基不能生長(zhǎng)。此外,一些殺蟲微生物,如蘇云金桿菌 Bacillus thuringiensis以及白僵菌 Beauveria bassiana等都對(duì)家蠅幼蟲有毒性作用。在本研究中,盡管幼蟲在所有接種細(xì)菌的培養(yǎng)基中均能完成各個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育階段,但在接種成團(tuán)腸桿菌和奇異變形桿菌的 TSEYA培養(yǎng)基中死亡率較高,其中的原因未明。這兩種細(xì)菌在TSEYA培養(yǎng)基中均生長(zhǎng)正常,有可能是由于這兩種細(xì)菌能產(chǎn)生一些對(duì)幼蟲生長(zhǎng)有害的物質(zhì)(如成團(tuán)腸桿菌能表達(dá)幾丁質(zhì)酶)所致(Garrity,2008)。

到目前為止,尚未明確細(xì)菌影響家蠅幼蟲生長(zhǎng)發(fā)育的機(jī)理。由于家蠅幼蟲主要通過氧化食物中的氨基酸和脂肪酸來滿足其能量的需要(李紹文等,1988),而無菌幼蟲難以在沒有接種細(xì)菌的TSEYA培養(yǎng)基中正常生長(zhǎng)發(fā)育,且單純細(xì)菌就可以作為幼蟲的食物。這些研究結(jié)果暗示,細(xì)菌中不同氨基酸、脂肪酸以及維生素的含量可能是影響幼蟲生長(zhǎng)發(fā)育的主要因素。TSEYA培養(yǎng)基只含有極其微量的 vitamin B1和 vitamin B3(煙酸),而后者作為輔酶主要參與生物體新陳代謝以及脂肪氧化產(chǎn)能(電子鏈傳遞)的過程,具有十分重要的作用(Genc,2006),本研究中選取的 6種細(xì)菌均能提供大量的煙酸,完全可以滿足幼蟲生長(zhǎng)的需要。

細(xì)菌中 10種昆蟲必需氨基酸含量對(duì)幼蟲的生長(zhǎng)質(zhì)量以及蛹重有著重要影響。其中原因可能是：一方面,家蠅幼蟲腸道中主要的蛋白水解酶為氨基肽酶(aminopeptidase),可將蛋白質(zhì)或者多肽水解成氨基酸(Blahovec et al.,2006);另一方面,由于細(xì)菌的大小差別不大,在單位攝取量相當(dāng)?shù)那闆r下,必需氨基酸比例越高,幼蟲能夠利用的營(yíng)養(yǎng)就越多,因而生長(zhǎng)加快以及蛹重增加。幼蟲在接種枯草芽孢桿菌的 TSEYA培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的時(shí)間以及蛹重均不理想,其原因可能是由于枯草芽孢桿菌能分泌多種蛋白酶,其中一些蛋白酶甚至能水解角蛋白(Gupta and Ramnani,2006;Cai et al.,2008),而這些蛋白酶可能影響幼蟲消化系統(tǒng)。我們?cè)?jīng)利用蛋白酶 K(proteinase K)消化麥麩后再接種幼蟲,結(jié)果發(fā)現(xiàn)幼蟲出現(xiàn)行動(dòng)遲緩、發(fā)育緩慢甚至死亡的現(xiàn)象(資料未顯示)。而利用單純細(xì)菌作為食物的實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明,枯草芽孢桿菌是可以支持幼蟲完成整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育過程的。

蛹重的大小與家蠅成蟲的羽化率沒有顯著的相關(guān)性(Zurek et al.,2000),相反,食物中多不飽和脂肪酸以及支鏈飽和脂肪酸的含量對(duì)滿足宿主能量的需求以及蟲體器官的形成卻有著關(guān)鍵性的作用。Dadd(1980)發(fā)現(xiàn),食物中多不飽和脂肪酸種類(如 γ-亞麻酸、花生四烯酸等)對(duì)庫(kù)蚊 Culex pipiens成蟲的飛行能力起著決定性的作用;Wang等(2006)證實(shí)南美大閃蝶 Morpho peleides幼蟲和成蟲體內(nèi)的多不飽和脂肪酸主要來源于食物,并能滿足成蟲變態(tài)過程中能量的需要以及增加飛行的能力。在本研究中,不飽和脂肪酸含量最高的香味類香味菌和成團(tuán)腸桿菌對(duì)家蠅成蟲的羽化率顯著低于含量最低的枯草芽孢桿菌(表 3),但前者的幼蟲化蛹后,大部分都在蛹期死亡。即使部分變態(tài)為成蟲,并用額囊頂破蛹?xì)?但不能離開蛹?xì)ろ樌鰜?最終死亡(資料未顯示)。這一現(xiàn)象暗示細(xì)菌中營(yíng)養(yǎng)成分含量的不同會(huì)影響蛹期組織的發(fā)育過程以及成蟲能量的需求。我們推測(cè)細(xì)菌中不飽和脂肪酸含量的多少可能對(duì)家蠅成蟲羽化率影響不大,但支鏈脂肪酸的種類及含量對(duì)家蠅幼蟲變態(tài)過程中組織形成及成蟲羽化可能有更為重要的影響。盡管這一推測(cè)尚需要實(shí)驗(yàn)證明,但細(xì)菌中支鏈脂肪酸的重要作用在其它動(dòng)物中早已被發(fā)現(xiàn)。Allison(1962)及 Miura等(1980)就證實(shí)了反芻動(dòng)物瘤胃中的細(xì)菌含有大量的支鏈脂肪酸,而這些脂肪酸可以被宿主吸收并參與構(gòu)成宿主器官及奶類脂肪。

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