王企珂，于大德，王 晟

（北京林業(yè)大學(xué)，北京 100083）

云南松（Pinus yunnanensis）廣泛分布于我國四川西南部、云南、西藏東南部、貴州西部、廣西西部等地。該樹種喜光，耐干旱耐瘠薄，適應(yīng)酸性的紅壤、黃壤，在其他樹種不能生長的貧瘠石礫地和沖刷嚴(yán)重的荒山坡地也能生長，是西南地區(qū)荒山造林的先鋒樹種。其木材是優(yōu)質(zhì)的造紙、人造板原料，具有較高的濟(jì)價(jià)值。大量繁殖云南松，對(duì)保護(hù)這一我國特有樹種并發(fā)揮其環(huán)境、經(jīng)濟(jì)方面的價(jià)值有著十分重要的意義。但由于松屬植物本身的扦插繁殖困難，而種子繁殖速度慢、周期長、發(fā)芽率低，嚴(yán)重限制了其大規(guī)模繁殖。體外胚胎發(fā)生是一種重要、有效的無性繁殖手段，但在針葉樹種中應(yīng)用還不多，主要由于缺乏經(jīng)濟(jì)有效的組織培養(yǎng)方法[1～2]。

黃健秋等使用云南松成熟種子成功獲得了云南松的完整小植株，但其培育時(shí)間較長，特別是胚性愈傷組織誘導(dǎo)率最高只有35.8%，轉(zhuǎn)化率也比較低，其實(shí)驗(yàn)過程中，未探究對(duì)種子不同處理方法以及不同激素濃度配比對(duì)胚性愈傷組織誘導(dǎo)的影響[3]。本文探討了使用云南松成熟種子誘導(dǎo)胚性愈傷組織的方法，使用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，探究了不同的消毒方式及2,4-D與6-BA的不同濃度配比，對(duì)云南松成熟種子愈傷組織的誘導(dǎo)成功率的影響，為建立該樹種離體培養(yǎng)技術(shù)的生物學(xué)基礎(chǔ)，促進(jìn)現(xiàn)代生物技術(shù)在其定向遺傳改良中的應(yīng)用等提供實(shí)驗(yàn)資料與數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

云南松成熟種子，于2009年11月購自中國林木種子公司，為2008年采收自云南昆明，干燥后一直密封保存于4℃冰箱。使用前先用流水沖洗干凈，浮選法篩選出飽滿健康的種子備用。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 外植體表面消毒與接種 云南松種子經(jīng)流水清洗后放入培養(yǎng)皿移入超凈臺(tái)中，70%酒精消毒 30 s，無菌水沖洗2 ～ 3次。約100粒種子加入20 mL不同濃度的次氯酸鈉溶液，浸泡20 min，無菌水沖洗2 ～ 3次，剝?nèi)シN皮與胚乳，取出胚接種于培養(yǎng)基表面。誘導(dǎo)在錐形瓶中進(jìn)行，每瓶接種5個(gè)胚，每個(gè)設(shè)計(jì)設(shè)置重復(fù)3次。在25±1℃下黑暗培養(yǎng)，每隔3 d觀察記錄。

1.2.2 使用正交設(shè)計(jì)誘導(dǎo)愈傷組織 本實(shí)驗(yàn)采用DCR培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，蔗糖濃度3%，瓊脂0.6%，肌醇1 000 mg/L，CH 500 mg/L，pH值6.2 ～ 6.8。按照L9(34)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，使用3%、5%、7% 3個(gè)濃度的次氯酸鈉溶液對(duì)種子進(jìn)行消毒，添加2,4-D的濃度為15、10、5 mg/L，6-BA的濃度為6、4、2 mg/L，共9組實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 小梯度濃度激素配比誘導(dǎo)愈傷組織 在以上實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，確定消毒液濃度，再在最佳的激素濃度附近選取3個(gè)較小的梯度濃度進(jìn)行全交叉試驗(yàn)，以期得到更精確的激素濃度配比。2,4-D的濃度分別為8、10、12 mg/L，6-BA的濃度分別為1.0、1.5、2.0 mg/L。培養(yǎng)條件與上述實(shí)驗(yàn)相同。

1.2.4 愈傷組織形態(tài)學(xué)與細(xì)胞學(xué)觀察 將完整愈傷組織置于實(shí)體顯微鏡下觀察胚性愈傷組織外形，顏色等。細(xì)胞學(xué)觀察采用壓片法，將少許愈傷組織挑取到載玻片上，滴入少量清水用解剖針展開，輕輕壓片觀察。由于愈傷組織柔弱，壁薄，不可用力過度使細(xì)胞破裂。

2 結(jié)果與分析

2.1 愈傷組織誘導(dǎo)過程觀察與胚性愈傷組織觀察

接種后每3 d觀察一次愈傷組織誘導(dǎo)情況，檢查是否有污染，愈傷組織的產(chǎn)生部位、形態(tài)、大小、顏色，在2周后鏡檢。如有污染，在第3 d即可出現(xiàn)，根據(jù)表面形態(tài)可確認(rèn)污染主要由黏菌與霉菌引起。

在培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 d內(nèi)，外植體明顯變粗，子葉略微伸展開，但無萌發(fā)跡象，且表面光滑，無愈傷組織產(chǎn)生（圖1）；培養(yǎng)4 ～ 5 d后，從胚根或下胚軸、子葉產(chǎn)生直徑約2 mm的乳白色半透明粘狀組織（圖2），該組織在6 ～ 10 d內(nèi)無明顯變化，僅有少量的膨大（圖3）；直到11 d后，開始加速膨大，并延胚軸向子葉方向延伸，到最后直徑可達(dá)到1 cm以上；15 d后部分愈傷組織表面產(chǎn)生白色，透明絲狀組織（圖4），此時(shí)使用顯微鏡觀察，可看到表面產(chǎn)生透明的圓丘狀凸起（圖5），而非胚性愈傷組織則無此結(jié)構(gòu)。壓片后可見細(xì)胞呈粗棒狀，細(xì)胞核大，細(xì)胞質(zhì)濃厚（圖6），每一個(gè)細(xì)胞均有可能發(fā)育成為一個(gè)胚。有時(shí)在同一胚上可觀察到兩種愈傷組織：①下胚軸產(chǎn)生的淺黃、半透明絲狀愈傷組織，結(jié)構(gòu)松軟，表面具有透明凸起；②主要由子葉產(chǎn)生，黃褐色或棕褐色，質(zhì)地較堅(jiān)硬，黃色，細(xì)胞排列緊密，較小。前者即為胚性愈傷組織。該愈傷組織在一定條件下誘導(dǎo)經(jīng)過早期原胚—后期原胚—子葉胚階段即可發(fā)育成為成熟的體細(xì)胞胚。

圖1 接種3d內(nèi)狀態(tài)Figure1 The 3rd day of inoculation

圖2 接種4 ～ 5d時(shí)狀態(tài)Figure2 The 4th-5th day of inoculation

圖3 接種6 ～ 10 d時(shí)狀態(tài)Figure3 The 6th-10th day of inoculation

圖4 接種15 d后狀態(tài)Figure4 The 15th day of inoculation

圖5 顯微鏡觀察到愈傷組織表面透明凸起Figure5 Transparent structure on the surface of embryogenic callus under microscope

圖6 涂片法觀察到胚性愈傷組織細(xì)胞Figure6 Cell structure of embryogenic callus under microscope

在實(shí)驗(yàn)中還觀察到一些胚的子葉在培養(yǎng)基中生長、變粗，長出小的凸起最終形成愈傷組織，但經(jīng)觀察確認(rèn)并非胚性愈傷組織。這種情況在小濃度梯度實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)較少，主要是在 6-BA濃度較高的試驗(yàn)中出現(xiàn)。此外如果在剝出種子的過程中對(duì)胚根和胚軸，特別是下胚軸有損傷，則難以發(fā)育成為愈傷組織，而如果子葉有受傷，則仍可正常誘導(dǎo)出愈傷組織，說明胚的完整性對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)有一定的影響。

2.2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

重復(fù)3批實(shí)驗(yàn)后統(tǒng)計(jì)所得數(shù)據(jù)，得到實(shí)驗(yàn)結(jié)果（表1）。

表1 正交試驗(yàn)結(jié)果Table1 Result of orthogonal experiment

2.2.1 消毒劑濃度的選擇 外植體消毒時(shí)間過短滅菌不徹底，造成污染，是組培實(shí)驗(yàn)需要極力避免的；而消毒時(shí)間過長則造成外植體活力降低甚至殺死外植體。在實(shí)驗(yàn)中曾觀察到如果使用 7%的次氯酸鈉溶液消毒時(shí)間過長，外植體接種后無論激素濃度與比例如何，均難以誘導(dǎo)出愈傷組織，且在接種后外植體不膨大也不生長，或者在培養(yǎng)一段時(shí)間后即從尖端枯萎。因此在選擇濃度與消毒時(shí)間時(shí)需要綜合考慮各個(gè)因素。

由表中數(shù)據(jù)可得，在消毒劑濃度過低時(shí)（3%），消毒效果不明顯，平均有約20%的污染率。濃度較高時(shí)（5%、7%）效果較好，污染率大大減少，僅出現(xiàn)少量偶然的污染。同時(shí)為避免消毒劑濃度過高對(duì)種子活力的傷害，我們選擇5%作為最佳的消毒劑濃度。

2.2.2 最佳激素濃度選擇 愈傷組織的誘導(dǎo)率因不同激素濃度變化較大（見表1）?？偟膩碚f，在6-BA濃度較高時(shí)，愈傷得率均較低，此因素與愈傷得率呈顯著相關(guān)性。在一定范圍內(nèi)，愈傷誘導(dǎo)率隨著 2,4-D濃度提高而提高，但超過一定濃度則會(huì)降低。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：第5組實(shí)驗(yàn)，即消毒劑濃度5%，2,4-D濃度10 mg/L，6-BA濃度2 mg/L為最佳實(shí)驗(yàn)組合，其愈傷誘導(dǎo)率為68.89%。

由于以上正交實(shí)驗(yàn)未得出在 2,4-D低濃度時(shí)，愈傷組織的誘導(dǎo)情況，且無法得到在最佳濃度附近組合對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)率的影響，因此我們?cè)O(shè)計(jì)了小濃度梯度實(shí)驗(yàn)。

2.3 小濃度梯度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，在DCR培養(yǎng)基上添加2,4-D濃度分別為8、10、12 mg/L，6-BA濃度分別為1.0、1.5、2.0 mg/L配比，共9組，設(shè)置出小濃度梯度全交叉實(shí)驗(yàn)。其中以2,4-D 10 mg/L，6-BA 1.5 mg/L為最佳組合。

表2 小濃度梯度實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table2 Result of small concentration gradient experiment

在小梯度誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)過程中，觀察到有一部分愈傷組織產(chǎn)生的速度較快，但最終得到的愈傷組織比率與正交實(shí)驗(yàn)的第5號(hào)處理接近。實(shí)驗(yàn)結(jié)果確認(rèn)了正交實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，2,4-D濃度在一定范圍內(nèi)，誘導(dǎo)率與6-BA濃度的變化正相關(guān)；但濃度過高時(shí)（12 mg/L），誘導(dǎo)率隨6-BA濃度升高而降低。表明激素在高濃度處理時(shí)對(duì)外植體會(huì)有一定毒害作用。

該全交叉實(shí)驗(yàn)還得到了6-BA作用的拐點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，2,4-D/6-BA的數(shù)值對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有較大的影響，當(dāng)2,4-D/6-BA的值較小時(shí)，特別是小于3時(shí)，誘導(dǎo)率均較低，通常不超過30%；而2,4-D/6-BA的值在4 ～ 5時(shí)，有較高的誘導(dǎo)率，均達(dá)到了50%以上，其中最高的可以達(dá)到近70%；之后隨著比值繼續(xù)升高，誘導(dǎo)率則略有下降，但都維持在30%以上。

3 討論

通過以上實(shí)驗(yàn)證明，使用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，使用DCR培養(yǎng)基，2,4-D與 6-BA作為激素誘導(dǎo)云南松成熟胚產(chǎn)生胚性愈傷組織是可行的。在先前的研究中，曾經(jīng)得出使用DCR培養(yǎng)基作為基本培養(yǎng)基胚性愈傷組織的得率較低的結(jié)論[2]，但經(jīng)過分析，我們認(rèn)為DCR培養(yǎng)基也完全可以滿足愈傷組織誘導(dǎo)的需要，且因?yàn)镈CR培養(yǎng)基在針葉樹種體胚發(fā)生中應(yīng)用廣泛，使用方便，因此仍決定使用該培養(yǎng)基。

外植體的滅菌是所有組織培養(yǎng)的重要環(huán)節(jié)，如果處理不當(dāng)其結(jié)果將是災(zāi)難性的。組培實(shí)驗(yàn)中常用的滅菌劑有雙氧水、次氯酸鹽、酒精、升汞、抗生素等[4]，體胚發(fā)生中多選用升汞作為消毒劑，但由于抗生素對(duì)細(xì)菌真菌的抑制效果與抑制時(shí)間有限，而升汞含重金屬，對(duì)人體有一定毒性，雙氧水則需要較高濃度長時(shí)間才可達(dá)到效果。表面消毒的基本要求是既要?dú)⑺啦牧媳砻娴娜课⑸?，又要不傷害材料，需要根?jù)不同的材料，選取適當(dāng)?shù)南緞?，合適的濃度和處理時(shí)間。綜合考慮效果與環(huán)保，本試驗(yàn)按照前述的原則選擇次氯酸鈉作為消毒劑，選擇滅菌時(shí)間15 min。

研究表明，胚性愈傷組織的誘導(dǎo)及體胚發(fā)生過程都與外植體的生理狀態(tài)、培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分、生長調(diào)節(jié)因子以及多個(gè)胚在培養(yǎng)中競(jìng)爭(zhēng)性等因素關(guān)系密切[5]。只有合子胚發(fā)育到一定時(shí)期，才對(duì)外界培養(yǎng)環(huán)境有反應(yīng)，其發(fā)育程度對(duì)胚性愈傷組織的誘導(dǎo)起決定性作用[6]。通常認(rèn)為分化程度較低的組織，如未成熟胚，更有利于體細(xì)胞胚胎的誘導(dǎo)發(fā)生[7]。但未成熟胚的采集困難，受時(shí)間與地域限制較大，僅限于胚胎發(fā)育的某一時(shí)期才有較高誘導(dǎo)率，窗口期很短。因此使用成熟胚誘導(dǎo)愈傷組織是簡(jiǎn)化操作、降低成本的有效方法，且此方法可在大規(guī)模生產(chǎn)中較為方便地利用。

試驗(yàn)結(jié)果表明，2,4-D可啟動(dòng)細(xì)胞分裂，完成脫分化過程，因此 2,4-D是導(dǎo)致細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期的關(guān)鍵因素[8～9]。2,4-D在一定濃度范圍內(nèi)，隨其濃度增加，誘導(dǎo)率也增加，但生長素的濃度過高也會(huì)對(duì)胚性愈傷組織產(chǎn)生毒害作用[10]。在早期誘導(dǎo)中，細(xì)胞分裂素含量越高則誘導(dǎo)率越低，但過低也會(huì)影響誘導(dǎo)率，而在后期繼代中，可適當(dāng)提高細(xì)胞分裂素的比例，可以使愈傷組織較快地增殖。本實(shí)驗(yàn)采用成熟種子，可以周期性大量供應(yīng)，無需限時(shí)采摘，相比使用未成熟種子來誘導(dǎo)，操作更簡(jiǎn)便，且成本更低，得到的誘導(dǎo)率也較黃健秋等人高。小濃度梯度的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，激素濃度的細(xì)微調(diào)整對(duì)愈傷組織與胚性愈傷組織的誘導(dǎo)率均無較大影響，因此激素的比例是誘導(dǎo)率的主要影響因素，此結(jié)果與在楊樹等其他植物的愈傷誘導(dǎo)上有相似之處。

有研究認(rèn)為，不同品種間以及同一品種不同基因型之間，對(duì)胚性愈傷組織的誘導(dǎo)及后期胚胎發(fā)育方面都有很大差異[11]。在許多研究中使用了不同地區(qū)，不同環(huán)境下生長的同一物種進(jìn)行誘導(dǎo)研究，結(jié)果差異顯著。本實(shí)驗(yàn)通過比較云南松胚自然呈現(xiàn)的顏色區(qū)分，結(jié)果黃色胚與白色胚的誘導(dǎo)成功率分別在40%與60%左右。我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)有的愈傷組織可以抵抗較為不適宜的環(huán)境，在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中1個(gè)月以上不繼代，也不出現(xiàn)褐化且生長良好。這些愈傷組織可被篩選出來大量擴(kuò)增，建立增殖體系。這種現(xiàn)象說明，基因型對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)與增殖確實(shí)有一定影響。在今后的應(yīng)用中如何方便地篩選這樣的基因型，是一個(gè)需要深入探究和解決的問題。

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