王 鈺，童再康，黃華宏，林二培

（浙江農(nóng)林大學 林業(yè)與生物技術(shù)學院，浙江 臨安 311300）

光皮樺（Betula luminifera）別名亮葉樺、樺角、花膠樹，其材質(zhì)優(yōu)良，為淡黃色或淡紅褐色，紋理細致，木材堅硬，有“亞白果”之美稱，是高級實木家具、高級膠合板和實木地板等的優(yōu)良材料[1]。同時，光皮樺也是制革、化妝品和食物香料的重要原料，其樹皮、木材、葉、芽等富含芳香油脂，可提煉香油和樺焦油；樹皮含鞣質(zhì)，可提取栲膠，做消毒劑，治療皮膚病或做礦石浮選劑；木屑是提取木醇、醋酸的優(yōu)良原料[1～2]。近年，因其具有較高的經(jīng)濟價值和廣泛的用途，我國學者已針對光皮樺開展了遺傳改良和新品種育種等工作[3～5]。而且因其具有生長較快、開花結(jié)實早等特性，正在逐漸成為林木分子遺傳研究的重要材料[6～7]。

從植物組織中提取高質(zhì)量的RNA是開展基因克隆、表達分析等分子生物學研究的基礎。然而，不同植物的組織由于其成分的差異，其RNA的提取存在不同的難點[8]。本研究以光皮樺為材料，通過比較多種RNA的沉淀方法，建立光皮樺總RNA提取技術(shù)體系，并以Actin基因作為內(nèi)標參照，用RT-PCR和RACE方法克隆光皮樺Actin基因全長以驗證總RNA提取技術(shù)體系的有效性，為進一步開展光皮樺重要基因克隆、轉(zhuǎn)基因等分子生物學研究提供必要的技術(shù)與方法。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與儀器

試驗材料為光皮樺嫩葉與嫩枝，于2009年4－5月采集于浙江林學院光皮樺種質(zhì)資源收集園。樣品采集后于液氮速凍，并保存于－70℃超低溫冰箱備用。

試驗主要儀器有高速冷凍離心機、DYY-12型電泳儀、紫外可見分光光度計（NANO DROP2000）、電子天平（1/1000g）、電熱恒溫水浴鍋、電熱鼓風干燥箱、超凈工作臺等。

1.2 主要試劑與配制

十六烷基三乙基溴化銨（CTAB）、焦碳酸二乙酯（DEPC）；DNase I；聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、β-巰基乙醇（BME）；LiCl。其中反轉(zhuǎn)錄引物和水飽和酚為上海生工產(chǎn)品；其余試劑均為國產(chǎn)分析純藥品。提取中所用的溶液除Tris外，均用0.1% DEPC水處理并高壓滅菌，Tris溶液用經(jīng)高壓滅菌的水直接配制；玻璃器皿于180℃烘烤12 h；塑料制品等用0.1% DEPC水37℃浸泡過夜后高壓滅菌。

CTAB提取液：2%CTAB，2%PVP，100 mM的Tris-HCl pH8.0，25mM EDTA，2M NaCl，0.5 g/L亞精胺，2%β-巰基乙醇，其中β-巰基乙醇使用前加入。

SSTE 的配制：0.5%SDS，1.0 MNaCl，1.0 mM Tris-HCl，1.0 mM EDTA。

1.3 總RNA的提取方法

參照參考文獻[9～11]，并以此為基礎加以改進與完善。具體方法如下：將700μL提取液加入到l.5 mL離心管，65℃水浴加熱10 min。用液氮冷卻研缽，取1 g低溫冷凍的葉片，迅速置于研缽中，加入液氮以防止研磨過程中葉片褐化，充分研磨后，立即加入到預熱好的提取緩沖液中，并迅速混勻。65℃，水浴20 min后冷卻（冰上）至室溫，期間不斷搖動。加入650μL的氯仿、異戊醇混合液混勻（V氯仿：V異戊醇 = 24：1），12 000 r/min，4℃，離心10 min。小心吸取上清液，加入1/20體積4M KAc pH5.5，1/10體積的預冷無水乙醇，等體積（700 μL）的氯仿：異戊醇（24：1），混勻，12 000 r/min，4℃，離心10 min。小心吸取上清液，加入等體積的氯仿：異戊醇（24：1），混勻，12 000 r/min，4℃，離心10 min。吸取上清液。

1.4 不同沉淀方法

1.4.1 LiCl沉淀法（加KAc） 上清液加1/4體積的10M LiCl混勻，4℃沉淀過夜，然后12 000 r/min離心10 min。用槍吸干，用500μL SSTE溶解沉淀，轉(zhuǎn)到1.5 mL離心管，加等體積氯仿：異戊醇（24：1）混勻，12 000r/min，4℃，離心10 min。離心吸取上清液，加兩倍體積的無水乙醇，－20℃下沉淀2 h。12 000r/min，4℃，離心20 min。去上清，用75%的乙醇洗兩次，超凈工作臺晾干。用20μL DEPC水溶解沉淀，得到RNA樣品。除用于電泳和紫外檢測外，其余的RNA用－70℃冰箱保存。

1.4.2 LiCl沉淀法（不加KAc） 在提取RNA時不加KAc，其他的相同，沉淀方法同上。

1.4.3 NaAc無水乙醇沉淀法 吸取上清液，上清液中加入1/10體積3M NaAc（pH 5.2）和2.5倍體積－20℃預冷的無水乙醇，混勻后－20℃放置2 h以上。4℃，12 000r/min，離心10 min；棄上清，75%乙醇清洗沉淀兩次，超凈工作臺晾干。用20μL DEPC水溶解沉淀，得到RNA樣品。除用于電泳和紫外檢測外，其余的RNA在－70℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.4 異丙醇沉淀法 吸取上清液，上清液中加入等體積異丙醇，－20℃放置1 h以上。4℃，12 000 r/min，離心10 min；棄上清，75%乙醇清洗沉淀兩次，超凈工作臺晾干。用20μL DEPC處理的水溶解沉淀，得到RNA樣品。除用于電泳和紫外檢測外，其余的RNA在－70℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 總RNA的質(zhì)量檢測

對獲得的RNA樣品分別取5μL進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。RNA樣品在紫外可見分光光度計（NANO DROP2000）上檢測，直接獲得A280/A260和A260/A230的數(shù)值。

1.6 Actin基因的克隆

按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa）的說明書進行總RNA的逆轉(zhuǎn)錄反應，獲得cDNA產(chǎn)物。根據(jù)GenBank中各種植物的Actin基因核苷酸序列進行同源性比較，找出高度保守的區(qū)段，根據(jù)同源性高和簡并性低的原則設計一對簡并引物，克隆Actin基因片段，然后測序分析，最后根據(jù)該片段序列設計特異引物，進行3’和5’RACE克隆Actin基因全長。引物由上海生工合成。Actin基因片段克隆采用RT-PCR擴增，20μL反應體系，2μL cDNA模板，2μL 10×Buffer（含MgCl2），0.8μL dNTPs，0.1μL Taq酶，0.2μL上游引物和0.2μL下游引物，加水至20μ L。反應條件：94℃預變性5 min；94℃變性30s、54℃退火30s、72℃延伸90s，30個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。RACE根據(jù)Clontech試劑盒進行。擴增產(chǎn)物用1.2%的凝膠電泳檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同沉淀方法比較

應用改良CTAB法，在相同的前處理條件下，采用不同的沉淀方法，對獲得的總RNA進行了電泳比較。從圖1可以看出，LiCl沉淀獲取的RNA在電泳圖上的條帶比較清晰、整齊，RNA完整性較好，幾乎沒有降解。其中不加 KAc的比加 KAc的亮度稍亮，說明前者的效率更高，且更簡單、實用。而用異丙醇沉淀法和 NaAc無水乙醇沉淀法所獲取的RNA條帶清晰度欠佳，而且含有少量DNA，且在28S和18S帶中間有不明顯的縱向條帶，說明有多糖、多酚類物質(zhì)污染。

圖1 提取的總RNA電泳圖Figure1 Electrophoretogram of total RNA

圖2 RNA逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物電泳結(jié)果Figure2 Electrophoretogram of cDNA

2.2 總RNA的質(zhì)量檢測

對提取所得的RNA樣品進行吸光值測定，結(jié)果如表1。從表1中可以看出，用LiCl沉淀法所獲得RNA樣品的A260/A280吸光值在1.8 ～ 2.0，A260/A230大于2.0，表明所提取RNA中蛋白、多酚和多糖等雜質(zhì)污染較少，純度較高，符合進一步研究的要求。而用NaAc無水乙醇沉淀法、異丙醇沉淀法所獲得RNA的A260/A280和A260/A230的吸光值均與標準值有較大偏差，說明其存在一定量的蛋白質(zhì)、多糖、多酚等雜質(zhì)污染。

表1 結(jié)果分析Table1 Analysis of total RNA by UV Spectrophotometer

2.3 cDNA的合成及Actin基因的克隆

為了檢測LiCl沉淀法獲得的總RNA能否用于逆轉(zhuǎn)錄、基因克隆等分子生物學研究，取LiCl沉淀法（不加KAc）所得到的總RNA進行逆轉(zhuǎn)錄和基因克隆試驗。由圖2可以看出，逆轉(zhuǎn)錄cDNA片段形成一條彌散帶，長度在100 ～ 2 000 bp，帶型清晰，表明該方法得到的總RNA能夠滿足逆轉(zhuǎn)錄實驗的要求。

以上述cDNA產(chǎn)物為模板，用Actin基因的簡并性引物進行PCR擴增。擴增產(chǎn)物經(jīng)1.2%的凝膠電泳檢測。由圖3可以看出，在760 bp左右處有一條亮帶，且其上下無雜帶，PCR產(chǎn)物克隆測序后，經(jīng)序列比對表明為Actin同源基因片段。然后根據(jù)該片段設計的特異引物進行3’和5’-RACE實驗，克隆Actin基因的3’和5’端（圖4）。最后將這些片段的序列進行拼接得到光皮樺Actin基因（Blactin）的全長序列，全長1 651 bp，編碼377個氨基酸，序列分析表明Blactin與白樺、楊樹、棉花、葡萄等的Actin基因的同源性達到99%，說明Blactin確為Actin同源基因（圖5）。

圖3 RT-PCR擴增Actin基因片段Figure3 Amplification of Actin gene fragment by RT-PCR

圖4 3’和 5’-RACE 擴增 Actin 基因 3’和 5’端Figure4 Amplification of 3’ and 5’-end of Actin by RACE

圖5 光皮樺Actin基因序列分析Figure5 Sequence analysis of B.luminifera Actin gene

以上結(jié)果說明，用LiCl沉淀法（不加KAc）提取得到的RNA質(zhì)量較高，可用于后續(xù)分子生物學的試驗研究。

3 討論

提取純度高、完整性好的RNA是開展相關分子生物學實驗（如逆轉(zhuǎn)錄、文庫的構(gòu)建、基因的擴增與克?。┮约盎蚬δ苎芯康裙ぷ鞯那疤釛l件。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，光皮樺與其它木本植物相似，其嫩葉內(nèi)含物多樣、復雜，特別是多糖和多酚類雜質(zhì)對RNA的分離和純化會產(chǎn)生很大干擾作用。因多糖與RNA的理化性質(zhì)相似，抽提過程中易與RNA形成難溶的膠狀物沉淀，或者在溶解后形成黏稠的溶液污染RNA樣品，造成產(chǎn)量得率低、純度不高等問題[12～13]，使之無法用于進一步的分子生物學研究；酚類化合物又極易被氧化而褐化[14]，與RNA不可逆結(jié)合，導致產(chǎn)量減少和抑制酶活。因此，能否在總RNA提取過程中有效地去除多糖、多酚、等雜質(zhì)，是提取高質(zhì)量木本植物RNA的關鍵。我們曾嘗試采用如Trizol試劑盒法等不同方法提取光皮樺葉總RNA，但都無法在光皮樺嫩葉中提取到純度較高的RNA，有的甚至根本無法提取到。

在本研究中，我們采用改良CTAB法，通過LiCl沉淀、NaAc無水乙醇沉淀和異丙醇沉淀等不同的沉淀方法來提取光皮樺的總RNA。結(jié)果表明，NaAc無水乙醇沉淀法RNA產(chǎn)率較低，電泳后條帶不清晰，有拖尾現(xiàn)象，存在DNA污染，且沒有完全去除蛋白質(zhì)、多糖和酚類物質(zhì)；異丙醇沉淀法也存在同樣的問題。LiCl沉淀法中KAc的添加與否對試驗結(jié)果影響不大，但最后所得的RNA產(chǎn)率和純度以不加KAc的效果稍好。

為了進一步驗證提取的總RNA能否用于后續(xù)實驗，我們以Actin基因為鑒定的對象，通過逆轉(zhuǎn)錄、PCR和基因克隆等實驗來進行驗證。Actin是一種廣泛參與真核細胞生理過程的重要基因，在基因表達調(diào)控研究時被廣泛用作分子內(nèi)標[15]。在本研究中，我們以LiCl沉淀法得到的RNA為模板，通過逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA片段在電泳后形成一條彌散帶，進一步的PCR擴增得到單一的Actin基因片段，最后通過RACE實驗得到光皮樺Actin基因的全長序列，序列分析表明該基因與其他植物的Actin基因同源性極高。這些結(jié)果說明提取的總RNA可以用于進一步的分子生物學實驗。

RNA質(zhì)量檢測、逆轉(zhuǎn)錄和基因克隆的結(jié)果說明CTAB-LiCl沉淀法（不加KAc）是一種提取光皮樺總RNA的有效方法。

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