唐 榮 周巧玲 Veeraragoo Pouranan 肖 舟 劉志純

氧化應(yīng)激是高血壓腎損傷的重要發(fā)病機(jī)制之一,而應(yīng)用抗氧化劑可延緩高血壓腎損傷的進(jìn)展[1]。klotho基因是 Kuro-o等新發(fā)現(xiàn)的一種抗衰老基因,與氧化應(yīng)激關(guān)系密切[2,3]。近年來,klotho基因在腎臟疾病發(fā)病機(jī)制中的作用日益受到關(guān)注。冬蟲夏草(cordyceps sinensis,CS)是一種名貴中藥,其在腎臟疾病中的應(yīng)用日益廣泛,對藥物性腎損傷、缺血性腎損傷、糖尿病腎病、慢性腎衰等均具有良好的腎保護(hù)作用[4,5]。我們前期的研究顯示,CS可通過抗腎小管上皮細(xì)胞凋亡減輕高血壓腎損傷,但對血壓無明顯影響[6]。本實(shí)驗用 CS干預(yù)自發(fā)性高血壓大鼠(spontaneously hypertensive rat,SHR),以氯沙坦(losartan)為對照藥物,觀察腎臟 klotho基因表達(dá)及氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)的變化,進(jìn)一步探討高血壓腎損傷的相關(guān)機(jī)制以及 CS的腎保護(hù)作用機(jī)制。

材料與方法

主要試劑 CS菌絲粉(江西濟(jì)民可信公司惠贈),內(nèi)容物為蝙蝠蛾擬青霉 Cs-4菌粉,又稱為發(fā)酵蟲草菌粉,是從青海產(chǎn)天然冬蟲夏草菌中分離純化所得的蟲草菌——蝙蝠蛾擬青霉經(jīng)液體深層發(fā)酵培養(yǎng)、過濾、干燥、粉碎制成的產(chǎn)品;Losartan(100mg/片,杭州默沙東公司惠贈);RNA抽提試劑Trizol(美國 Invitrogen);逆轉(zhuǎn)錄試劑盒 (美國Fermentas Life science);Taq Mix酶(北京天為時代);兔抗大鼠 Klotho多克隆抗體 (美國 US Biogical);兔抗大鼠 GAPDH多克隆抗體及辣根過氧化物酶標(biāo)記抗兔二抗(美國 Santa Cruz);總抗氧化能力(T-AOC)、丙二醛(MDA)、銅鋅超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)、錳超氧化物歧化酶 (Mn-SOD)、過氧化氫酶(CAT)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

實(shí)驗方法

實(shí)驗動物及分組 22周齡雄性 SHR 15只及健康雄性 Wistar-Kyoto(WKY)大鼠 5只(成都史萊克實(shí)驗動物研究所提供)。適應(yīng)性喂養(yǎng) l周后,按隨機(jī)數(shù)字表法將 22周齡 SHR大鼠分為三組(每組 5只):模型組 (SHR組),冬蟲夏草組 [CS組5 g/(kg·d)灌胃],Losartan組[Los組 50mg/(kg·d)灌胃]。22周齡雄性 WKY大鼠 5只(WKY組)作為正常對照。SHR組和 WKY組予等量蒸餾水清晨灌胃。共喂養(yǎng) 8周。

一般檢測及標(biāo)本采集 實(shí)驗前及實(shí)驗第 8周(處死前一天)分別檢測各組大鼠的體重、尾動脈收縮壓、24h尿蛋白量及尿 NAG酶。實(shí)驗結(jié)束時予10%水合氯醛腹腔麻醉,心臟采血 10 ml,用于檢測血尿素氮(BUN)及血肌酐(SCr);取左腎稱重后去包膜縱向切開后置于 4%多聚甲醛溶液中固定 24h,常規(guī)石蠟包埋,切成 4μm厚的切片用于 HE、Masson及免疫組化染色。右腎予生理鹽水和 0.1%二乙基焦磷酰胺(DEPC)水沖洗后,取腎皮質(zhì)于液氮中保存,用于 RT-PCR、Western Blot及氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)的檢測。

腎臟病理 常規(guī)固定、包埋腎組織后切片,行常規(guī) HE和 Masson染色,在普通光學(xué)顯微鏡下觀察。結(jié)果判斷:取 HE染色切片,單盲依序觀察左上、右上、左下、右下、中間五個腎小管間質(zhì)視野(×200),按腎間質(zhì)損傷八項指標(biāo)進(jìn)行評分,作為該標(biāo)本的腎小管間質(zhì)損傷指數(shù)。取 Masson染色切片,每例切片低倍鏡下觀察 10個互不重疊腎小管間質(zhì)視野,計算腎間質(zhì) Masson染色陽性面積占整個視野百分比,以對腎間質(zhì)膠原含量進(jìn)行半定量分析。

免疫組織化學(xué)染色法檢測腎組織 k1otho表達(dá)參照SP試劑盒說明書進(jìn)行試驗,陽性結(jié)果為細(xì)胞質(zhì)及胞核染成棕黃色。結(jié)果判斷:顯微鏡顯影系統(tǒng)采集圖像;每個標(biāo)本隨機(jī)選擇不重疊的 10個視野(×400),計算機(jī)自動測量并計算平均陽性信號積分吸光度(超清晰度病理圖文分析系統(tǒng) PIPS-2020,重慶天海)。

RT-PCR檢測腎組織 klotho基因表達(dá) 取 100mg腎組織,低溫(液氮)下將組織研磨粉碎,加入Trizol裂解后參照試劑盒說明書提取總 RNA及cDNA模板合成。PCR引物由上海生工合成。大鼠Klotho:上游 5′-CAAT GGCTTCCCTCC TTTAC-3′,下游 5′-AGCACAGGTTTGCGTAGTCT-3′(512bp);大鼠 β-actin上 游 5′-ACCCACACTGTGCCCATCTATGA-3′,下游 5′-CA TCGGAACCGCTCATTG CCGATAG-3′(296 bp)。 klotho反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性5 min,94℃ 30s,56℃ 30s,72℃ 1 min,30個循環(huán),72℃終止反應(yīng) 10 min,4℃冷卻。PCR產(chǎn)物于 1.5%瓊脂糖凝膠上電泳,凝膠攝像分析系統(tǒng)定量,比較目的基因/內(nèi)參平均光密度值。

Western Blot檢測腎組織 klotho蛋白表達(dá) 將腎組織加入預(yù)冷的裂解液中充分研磨,提取總蛋白。Bradford法檢測蛋白濃度。取 30～40μg蛋白樣品100℃變性 5 min后,SDS-PAGE凝膠電泳,待溴酚藍(lán)達(dá)膠底部時結(jié)束電泳。分離蛋白至 PVDF膜上,置含 5%脫脂奶粉的 PBS中室溫封閉 2 h后加入一抗(klotho 1∶300,GAPDH 1∶2 000)室溫孵育 2 h,二抗(1∶2 000)室溫孵育 2h,ECL顯色成像。凝膠分析系統(tǒng)定量,比較目的條帶/內(nèi)參條帶平均光密度值。

腎組織氧化應(yīng)激指標(biāo)的檢測 取處死后凍存的大鼠部分腎組織稱重,置 9倍于組織塊重量的預(yù)冷生理鹽水中,冰水浴中勻漿,制成 10%的組織勻漿,于 4℃,10 000 r/min離心 15 min,取上清液檢測。硫代巴比妥酸(TBA)法檢測 MDA含量,黃嘌呤氧化酶法檢測 Cu/Zn-SOD及 Mn-SOD活性,紫外分光光度法檢測 CAT活性,比色法測定 T-AOC及GSH-Px活性 。

結(jié) 果

實(shí)驗前后一般資料 實(shí)驗前(22周齡)四組大鼠體重(Wt)無統(tǒng)計學(xué)差異;SHR組、CS組及 Los組24h尿蛋白量及尿 NAG酶均明顯增高(與 WKY組比較 P均 ＜0.01),且此三組間上述指標(biāo)無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05表1)。實(shí)驗第 8周(30周齡),SHR組 24h尿蛋白量、尿 NAG酶、BUN及 SCr均明顯增高(與 WKY組比較,P均 ＜0.01)。經(jīng) CS或 Los干預(yù)后,上述指標(biāo)均降低 (P＜0.05或 P＜0.01);Los組收縮壓顯著低于 SHR組,CS對血壓無明顯影響;各組大鼠左腎質(zhì)量/體質(zhì)量(LR/BW)無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)(表2)。

表1 用藥前一般情況(22周)

表2 用藥后指標(biāo)變化情況(30周)

腎組織病理改變 HE染色顯示,WKY組大鼠腎組織結(jié)構(gòu)未見明顯異常;SHR組可見腎臟入球小動脈管壁增厚,部分腎小球毛細(xì)血管缺血、皺縮,腎小管上皮細(xì)胞空泡及顆粒變性,部分間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤,腎小管間質(zhì)損傷指數(shù)明顯增加(P＜0.01);CS組和 Los組上述病理損傷減輕,腎小管間質(zhì)損傷指數(shù)下降(P＜0.01)(圖 l)。Masson染色顯示,WKY組大鼠腎小球包曼囊及周圍的腎小管間質(zhì)區(qū)可見極少量藍(lán)綠染的膠原纖維;SHR組大鼠腎小球包曼囊及周闈腎小管間質(zhì)區(qū)可見增多的藍(lán)綠染的膠原纖維,腎間質(zhì)膠原相對面積明顯增加(P＜0.01);CS組和 Los組腎間質(zhì)膠原減少(P＜0.01)(圖2)。

圖1 腎組織病理變化(HE,×400)

圖2 腎組織病理變化(Masson,×400)

腎組織 klotho mRNA及蛋白表達(dá) klotho蛋白主要表達(dá)于腎小管上皮細(xì)胞胞質(zhì)及胞核中,且以遠(yuǎn)曲小管為主;WKY組大鼠腎小管有一定量的 klotho蛋白表達(dá)。與 WKY組比較,SHR組腎組織 klotho mRNA及蛋白表達(dá)減少(P＜0.01);經(jīng) CS或 Los干預(yù)后,klotho mRNA及蛋白表達(dá)明顯高于 SHR組(P＜0.05或 P＜0.01),兩藥物干預(yù)組間無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)(圖3～4)。

圖3 各組腎 klotho mRNA表達(dá)變化

腎組織氧化應(yīng)激指標(biāo)的變化 與 WKY組比較,SHR組腎組織 MDA含量增加,T-AOC、Cu/Zn-SOD、CAT及 GSH-Px活性降低(P＜0.01);經(jīng) CS或 Los干預(yù)后,SHR組 MDA含量減少,T-AOC、Cu/Zn-SOD、CAT及 GSH-Px活性增加(P＜0.05或 P＜0.01)。各組大鼠Mn-SOD活性無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)(表3)。

圖4 腎klotho蛋白表達(dá)變化

討 論

在過去 10余年中,美國終末期腎臟疾病(ESRD)的發(fā)病率以每年9%的速度遞增,其中 28%ESRD患者因高血壓腎損傷所致[7]。在我國,高血壓腎損傷的發(fā)病率也逐年上升。在高血壓腎損傷的發(fā)生發(fā)展過程中,氧化應(yīng)激的作用日益得到人們的重視。氧化應(yīng)激是指由于活性氧(reactive oxygen species,ROS)過度產(chǎn)生與抗氧化防御機(jī)制減弱,兩者平衡失調(diào)導(dǎo)致的組織損傷。氧化應(yīng)激是高血壓腎損傷進(jìn)展的重要因素,已經(jīng)在不同的高血壓實(shí)驗動物模型中得到證實(shí),并且抗氧化應(yīng)激治療具有較好的療效[8]。

SHR的發(fā)病機(jī)制和病理特點(diǎn)與人類高血壓病相似,是研究人類原發(fā)性高血壓最常用的動物模型。與以往對 SHR的研究相一致,本研究發(fā)現(xiàn),SHR的血壓、24 h尿蛋白量、尿 NAG酶、BUN和 SCr水平高于同齡 WKY大鼠,并出現(xiàn)典型的高血壓腎損傷的病理特征。這一結(jié)果表明,30周齡 SHR已出現(xiàn)腎功能損害、腎小球及腎小管間質(zhì)損傷。

klotho基因主要表達(dá)于腎臟遠(yuǎn)端小管上皮細(xì)胞。klotho基因缺陷鼠可出現(xiàn)一系列類似人類衰老的表現(xiàn),如生長遲緩,動脈硬化,異位鈣化,骨質(zhì)疏松,肺氣腫,壽命縮短和不育等[9]。慢性腎衰患者常出現(xiàn)以上類似表現(xiàn)。已有學(xué)者在 SHR、癌癥研究所(Institute of Cancer research,ICR)衍生性腎小球腎炎小鼠、腎臟上皮細(xì)胞癌、急性腎衰竭大鼠、慢性腎衰及其鈣磷代謝紊亂等研究中證實(shí),klotho基因與腎臟疾病關(guān)系密切[10-12]。在 klotho基因眾多的分子機(jī)制中,研究最熱的是抗氧化活性。klotho基因可通過抑制胰島素/胰島素樣生長因子 1信號通路、激活 cAMP信號通路或增加一氧化氮的產(chǎn)生等機(jī)制清除 ROS,從而增加細(xì)胞或生物體對氧化應(yīng)激損傷的抵抗性[13]。因此,klotho基因與氧化應(yīng)激關(guān)系密切。研究發(fā)現(xiàn),SHR腎組織 klotho基因表達(dá)明顯受抑制,提示 klotho表達(dá)異?？赡軈⑴c了高血壓腎損傷的發(fā)生發(fā)展。

持續(xù)高血壓狀態(tài)可導(dǎo)致氧化應(yīng)激水平增加,抗氧化活性降低,使 ROS的生成明顯超過機(jī)體清除能力,從而引起腎組織結(jié)構(gòu)的損傷[14]。T-AOC是反映機(jī)體整體抗氧化水平的重要指標(biāo)之一;MDA是氧自由基攻擊生物膜中多不飽和脂肪酸引發(fā)脂質(zhì)過氧化的最終產(chǎn)物,可間接反映細(xì)胞受自由基攻擊的損傷程度;SOD、CAT及 GSH-Px是體內(nèi)清除氧自由基的抗氧化酶系統(tǒng)的重要成員。為明確 SHR腎組織的氧化應(yīng)激狀態(tài),我們檢測了 T-AOC、MDA水平和抗氧化酶 SOD、CAT及 GSH-Px的活性。結(jié)果顯示,SHR腎臟 T-AOC活性明顯降低,證實(shí)了 SHR體內(nèi)氧化應(yīng)激狀態(tài)的存在。與正常對照組比較,模型組腎組織 MDA含量升高,klotho表達(dá)受抑制,Cu/Zn-SOD、CAT及 GSH-Px活性明顯降低。氧化產(chǎn)物 MDA水平增加提示此時 SOD活性增高不足以保護(hù)機(jī)體免受損傷?？寡趸?Cu/Zn-SOD、CAT及GSH-Px的活性降低提示 SHR腎組織中抗氧化系統(tǒng)遭到破壞后其清除自由基的能力明顯減弱。鑒于klotho基因與氧化應(yīng)激的密切關(guān)系,我們推測 SHR氧化應(yīng)激指標(biāo)的變化可能部分繼發(fā)于 klotho表達(dá)的異常。而氧化應(yīng)激指標(biāo)表達(dá)的變化是否位于 klotho的下游,我們將展開進(jìn)一步的研究。

CS的主要成分包括腺苷、多糖、甘露醇、微量元素、硬脂酸及多種必需氨基酸,具有抗炎、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化等作用[15]。藥理學(xué)研究表明,CS的抗氧化機(jī)制復(fù)雜,其抗氧化應(yīng)激功效可能是所含的多種抗氧化損傷成分協(xié)同作用的結(jié)果,其中多糖、腺苷、蟲草素和 D甘露醇等成分是 CS中具有抗氧化作用的有效組分[16]。

本研究應(yīng)用 CS或 Los對 SHR進(jìn)行干預(yù)后,24h尿蛋白量、尿 NAG酶、BUN及 SCr均降低;腎臟klotho表達(dá)增強(qiáng);腎臟 MDA含量明顯降低,T-AOC、Cu/Zn-SOD、CAT及 GSH-Px等抗氧化酶類活性有不同程度的恢復(fù);腎組織病理損傷明顯減輕。這表明 CS可清除自由基,保護(hù)抗氧化酶活性,有效地抑制氧化應(yīng)激損傷。CS的抗氧化應(yīng)激機(jī)制可能有雙重途徑:一是直接清除自由基,通過減少自由基的生成降低對脂質(zhì)、蛋白和 DNA的損傷;二是通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)抗氧化系統(tǒng)發(fā)揮其抗氧化作用。CS可能通過直接抗氧化應(yīng)激或部分通過上調(diào) klotho基因的表達(dá)抑制氧化應(yīng)激,從而對 SHR起到腎保護(hù)作用。研究結(jié)果顯示,CS對血壓無明顯影響,提示其對高血壓腎損傷的保護(hù)作用不依賴于血壓的降低。

表3 腎臟氧化應(yīng)激指標(biāo)的比較

綜上所述,klotho表達(dá)異常及氧化應(yīng)激在高血壓腎損傷的發(fā)病機(jī)制中起重要作用。CS可上調(diào)腎臟 klotho表達(dá)和抑制氧化應(yīng)激反應(yīng),這可能是其治療高血壓腎損傷的作用機(jī)制之一。

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