肖 笑 劉 巖 周道遠 覃丹平 鐘小仕

繼發(fā)性甲狀旁腺功能亢進是慢性腎功能衰竭 (CRF)的常見并發(fā)癥。研究證實,體內(nèi)磷潴留在甲狀旁腺細胞增生及繼發(fā)性甲狀旁腺功能亢進的發(fā)病和進展中起著重要作用[1,2],同時高磷血癥還被認為是影響腎衰患者死亡率的獨立危險因素[3]。臨床研究也證明控制血磷水平,可以有效地糾正鈣磷代謝紊亂,延緩繼發(fā)性甲狀旁腺功能亢進的進展[4,5]。臨床上治療高磷血癥除了減少磷攝入外,腸道磷結(jié)合劑也可降低血磷水平[6,7]。最常用的磷結(jié)合劑含有鈣鹽和鋁制劑,臨床應(yīng)用常導(dǎo)致嚴重不良反應(yīng)[8,9]。鹽酸司維拉姆是一種不含鈣鋁的磷結(jié)合劑,它可以降低 CRF血液透析患者的血磷并抑制甲狀旁腺功能亢進,同時避免使用含鈣的磷結(jié)合劑所致的高鈣血癥及心血管鈣化[10.11]。我們的研究旨在通過免疫組化研究探討鹽酸司維拉姆對單側(cè)輸尿管結(jié)扎(UUO)導(dǎo)致慢性梗阻性腎病的 CRF大鼠甲狀旁腺增生和甲狀旁腺激素分泌的影響。

材料與方法

模型制作與取材 75只 7周齡 Wistar雄性大鼠(日本東京 SLC公司提供),體重 170～180g,先給予普通飼料喂食 5d,大鼠可以自由取食及飲水,收集 24h尿標本,每組收集 5只大鼠血標本及甲狀旁腺,作為 d0資料。其余大鼠通過尾靜脈注射苯巴比妥 0.1ml/100g體重麻醉,然后以 4-0絲線結(jié)扎左側(cè)輸尿管制造 UUO模型[12]。將大鼠隨機分成三組,普通飼料 (n=20,蛋白含量 22%,磷含量400mg/100g,對照組),5%鹽酸司維拉姆(日本東京化工提供)加普通飼料組(n=20,鹽酸司維拉姆含量 5%,SH組);低蛋白飼料組(n=20蛋白含量6%,含磷 350mg/100g,LP組)。隨后,分別在第3、7、14和 28d,各組的大鼠分別測量體重及置于代謝籠中收集 24h尿標本,在每個時間點每組隨機抽取 5只大鼠,麻醉后取血標本及甲狀旁腺組織標本。

血清及尿液生化檢驗 血標本離心分離血清,標本置于 -80℃保存待檢。血清鈣、磷、肌酐及尿素氮,24h尿磷使用標準實驗室自動生化檢測。血清全段甲狀旁腺激素使用大鼠專用全段甲狀旁腺激素免疫放射檢測。

甲狀旁腺的組織學(xué)和免疫組織化學(xué)檢測 甲狀旁腺組織置于 20%甲醛溶液固定,蠟塊包埋,制成 3 μm切片,分別行 HE和 PAS染色,其他切片待免疫化學(xué)檢查。為評估甲狀旁腺細胞的增生,3μm的組織切片使用 Universal Immuno-enzyme Polymer(UIP)方法 (USA Patent No 6252053)進行免疫組化染色,使用增殖細胞核抗體 (PCNA)作為一抗(抗大鼠 IgG,醫(yī)學(xué)及生物實驗室,日本,名古屋)。在顯微鏡下(400X,總細胞數(shù)為 381±42/每個視野),計數(shù)每高倍視野的 PCNA陽性細胞,每張切片計算五個視野的平均值。

結(jié) 果

三組大鼠的一般情況 三組大鼠在整個實驗過程中均無脫失。三組大鼠的體重、血清白蛋白和血清前白蛋白水平在各個時間點,組間比較均無顯著性差異。UUO后三組大鼠血清尿素氮與肌酐均緩慢上升,至實驗結(jié)束,呈現(xiàn)倍增[BUN:(11.60±0.51)μmol/L vs(22.25±1.44)μmol/L,對照組;(13.60±1.21)μmol/L vs(21.50±2.40)μmol/L,SH組;(11.00±0.71)μmol/L vs(20.00±1.50)μmol/L,LP組;d0 vs d28]。盡管對照組比 SH組和LP組上升更為明顯,但各組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

血磷的變化 在 SH組,血磷水平從 d3開始逐漸降低,與對照組比較,在 d14,及 d28顯示出顯著性的降低[(7.80±0.20)mg/dl vs(8.50±0.04)mg/dl,P＜0.05和(7.57±0.15)mg/dl vs(8.47±0.60)mg/dl,P＜0.05](圖1)。并且,在 d3,d14和d28與 d0(9.72±0.15)相比,降低具有顯著性(P＜0.01),在 LP組,血清磷有降低趨勢,但與 d0對照,僅 d14的下降呈現(xiàn)出統(tǒng)計學(xué)差異。

尿磷的變化 治療前三組間的 24h尿磷排泄并無差異,但在 d14和 d28,與對照組比較,SH組的尿磷排泄顯著降低[(12.45±2.86)mg/24h vs(23.51±2.33)mg/24h,P＜0.01和(12.79±1.04)mg/24h vs(19.29±0.66)mg/24h,P＜0.01],LP組也表現(xiàn)出與 SH組相似的變化 (圖2)。

血清全段甲狀旁腺激素的變化 在 d0三組大鼠的血清全段甲狀旁腺激素(i-PTH)水平無差異,從 d3起,對照組的i-PTH逐漸升高,而在 SH組和 LP組這種上升的趨勢受到抑制,在 d14和 d28與對照組相比,SH組的 i-PTH明顯降低,差異具有顯著性[(6.00±0.30)pg/ml vs(9.0±3.64)pg/ml,P＜0.05;(7.12±2.27)pg/ml vs(10.00±1.14)pg/ml,d28,P＜0.05],LP組也表現(xiàn)出與 SH組相似的變化(圖3)。

圖1 三組實驗大鼠血磷的變化

圖2 三組實驗大鼠各時間點 24小時尿磷的排泌

圖3 三組實驗大鼠血甲狀旁腺素變化

PCNA陽性細胞計數(shù) 在對照組,從 d3出現(xiàn)顯著的甲狀旁腺細胞增生,與 d0相比,PCNA陽性細胞計數(shù)顯著增多[(20.6±2.5)個 /Hp vs(13.76±1.98)個/Hp,P＜0.05]。而 SH組盡管也有甲狀旁腺細胞增生,但整個實驗過程中 SH的 PCNA陽性細胞較對照組顯著減少[(12.2±1.4)個/Hp vs(20.6±2.5)個/Hp,d3,P＜0.05;(11.5±0.93)個 /Hp vs(18.2±2.9)個 /Hp,d7;(10.35±0.88)個/Hp vs(19.2±1.0)個/Hp,d14,P＜0.01;(9.2±1.4)個/Hp vs(15.93±0.18)個 /Hp,d28,P＜0.01](圖4)。在d7,和 d14,低蛋白飲食也抑制了甲狀旁腺細胞的增生[(7.3±0.6)個/Hp;P＜0.05,d7(9.9±1.0)個 /Hp;P＜0.01,d14](圖5)。

討 論

繼發(fā)性甲狀旁腺功能亢進是 CRF患者常見的并發(fā)癥,也是透析患者致殘的主要原因之一。甲狀旁腺功能亢進可以導(dǎo)致腎性骨病和轉(zhuǎn)移性鈣化,而發(fā)生甲狀旁腺功能亢進的始動因子為高磷血癥刺激甲狀旁腺細胞增生。當(dāng)甲狀旁腺細胞增生一旦發(fā)生,往往不可逆[13]。因此,早期預(yù)防尤其重要。

鹽酸司維拉姆是一種不含鈣的磷結(jié)合劑,它在胃腸道內(nèi)通過離子交換結(jié)合磷與膽汁酸,其顆粒直徑較大(平均 45mm),在胃腸不被吸收而隨糞便排出,全身不良反應(yīng)很少,用于治療終末期腎病患者的高磷血癥,可以避免含鈣和鋁的磷結(jié)合劑所導(dǎo)致的不良反應(yīng)[14,15]。

在我們的研究中,三組大鼠的體重、血清蛋白、前白蛋白水平均無顯著差異。和對照組相比,SH組和 LP組大鼠血清磷水平從實驗的第 7天開始明顯降低,在 d14和 d28差異有統(tǒng)計學(xué)意義,而且,SH組和LP組大鼠24h尿磷排泄量也顯著低于對照組,這說明,鹽酸司維拉姆可以通過腸道結(jié)合磷使大鼠磷攝入減少,低蛋白飼料也有同樣作用。在我們的研究中,SH組和 LP組血清 i-PTH的升高明顯受到抑制,提示鹽酸司維拉姆具有與低蛋白飼料相似的預(yù)防及減輕繼發(fā)性甲狀旁腺功能亢進的作用。同時,三組大鼠的甲狀旁腺 PCNA陽性細胞的差異,也證實了鹽酸司維拉姆抑制甲狀旁腺細胞增生的作用。

我們發(fā)現(xiàn),三組大鼠的血磷在整個觀察期均無明顯增高,但檢測血清 i-PTH表現(xiàn)出逐漸升高,雖然在 SH組及 LP組升高的趨勢受到抑制,但仍然較基線升高。這是因為在本研究中,三組大鼠的血尿素氮與肌酐水平在實驗結(jié)束時,較基線升高約一倍,對于早期的腎小球功能受損,腎小球濾過率 60～80 ml/min時,出現(xiàn) i-PTH升高的主要影響因素是腎臟分泌活性 1,25(OH)2D3低下,直至腎小球濾過率降至 25 ml/min時,高磷血癥才成為影響 i-PTH的主要因素[16]。

我們的實驗結(jié)果顯示,從 CRF的早期開始,就出現(xiàn)了甲狀旁腺細胞的顯著增生,鹽酸司維拉姆和低蛋白飼料都能有效降低血磷,降低血清 i-PTH,從而防止并抑制甲狀旁腺細胞增生。因此,我們推斷在 CRF患者早期,即部分腎小球毀損而出現(xiàn)腎小球超濾過狀態(tài)時就應(yīng)該注意控制血清磷濃度,防止甲狀旁腺細胞增生及繼發(fā)性甲狀旁腺功能亢進的發(fā)生。

在我們的實驗中,對于血清磷、i-PTH水平的控制以及對于甲狀旁腺細胞增生的抑制,鹽酸司維拉姆均表現(xiàn)出與低磷飲食相似的作用,但對于 CRF的患者而言,達到治療要求的低蛋白飲食的實施具有一定的難度。

因此,我們建議在腎功能不全的早期,一旦出現(xiàn)血尿素氮及肌酐增高,及時檢測血清 i-PTH,若出現(xiàn)增高,這時即使有部分患者尚未表現(xiàn)出高磷血癥,也可給予患者鹽酸司維拉姆治療,有利于抑制甲狀旁腺細胞的增生及繼發(fā)性甲狀旁腺功能亢進。

圖5 三組實驗大鼠甲狀旁腺增殖細胞數(shù)的比較

1 Stillion JR,Ritt M.Renal secondary hyperparathyroidism.Compend contin Educ Vet,2009,31(6):E1-E11.

2 Slatopolsky E,Dusso A,Brown AJ.The role of phosphorus in the development of secondary hyperparathyroidism and parathyroid cell proliferation in chronic renal failure.Am J Med Sci,1999,317(6):370-376.

3 Block GA,Klassen PS,Lazarus JM,et al.Mineral metabolism,mortality,and morbidity in maintenance hemodialysis.J Am Soc Nephrol,2004,15(8):2208-2218.

4 Slatopolsky E,Finch J,Denda M,et al.Phosphorus restriction prevents parathyroid gland growth.High phosphorus directly stimulates PTH secretion in vitro.J Clin Invest,1996,97(11):2534-2540.

5 Yi H,Fukagawa M,Yamato H,et al.Prevention of enhanced parathyroid hormone secretion,synthesis and hyperplasia by mild dietary phosphorus restriction in early chronic renal failure in rats:possible direct role of phosphorus.Nephron,1995,70(2):242-248.

6 Brancaccio D,Gallieni M,Cozzolino M.Treatment of hyperparathyroidism-why is it crucial to control serum phosphate?Nephrol Dial Transplant,1996,11(3):420-423.

7 Fournier A,Moriniere P,Sebert JL,et al.Calcium carbonate,an aluminum free agent for control of hyperphosphatemia,hypocalcemia and hyperparathyroidism in uremia.Kidney Int Suppl,1986,18:S114-119.

8 Block GA,Port FK.Re-evaluation of risk associated with hyperphosphatemia and hyperparathyroidism in dialysis patients:Recommendations for a change in management.Am J Kidney Dis,2000,35(6):1226-1237.

9 Guérin AP,London GM,Marchais SJ,et al.Arterial stiffening and vascular calcifications in end-stage renal disease.Nephrol Dial Transplant,2000,15(7):1014-1021.

10 Castro R,Herman A,Ferreira C,et al.RenaGel efficacy in severe secondary hyperparathyroidism.Nefrologia,2002,22(5):448-455.

11 Zhang Q,Li M,Lu Y,et al.Meta-analysiscomparing sevelamer and calcium-based phosphate binders on cardiovascular calcification in hemodialysis patients.Neohron Clin Pract,2010,115(4):c259-c267.

12 王海燕,李曉枚,趙明輝,等.單側(cè)輸尿管梗阻致腎間質(zhì)纖維化模型//王海燕.腎臟病學(xué).第三版.北京:人民衛(wèi)生出版社,2008:620-622.

13 Locatelli F,Cannata-Andia JB,Drüeke TB,et al.Management of disturbances of calcium and phosphate metabolism in chronic renal insufficiency,with emphasis on the control of hyperphosphataemia.Nephrol Dial Transplant,2002,17(5):723-731.

14 Cozzolino M,Staniforth ME,Liapis H,et al.Sevelamer hydrochloride attenuates kidney and cardiovascular calcifications in long-term experimental uremia.Kidney Int,2003,64(5):1653-1661.

15 Braunlin W,Zhorov E,Guo A,et al.Bile acid binding to Severlamer HCI.Kidney Int,2002,62(2):611-619.

16 Llach F,Massry SG.On the mechanism of secondary hyperparathyroidism in moderate renal insufficiency.J Chin Endocrinol Mctab,1985,61(4):601-606.